0.   引言

【研究意义】羊伪结核棒状杆菌病Pseudotuberculosis是由伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis，CP)引起的人和多种动物共患的一种接触性慢性细菌性传染病^[1]，其临床特征主要表现为浅表淋巴结肿大，呈脓性干酪样坏死，部分羊只组织脏器内出现干酪样脓肿，故该病也称为干酪样淋巴结炎(Caseouslymphadenitis，CLA)^[2]。该病的发病率一般在8.36%~30%^[3-4]，一年四季均可发病^[5]，且患病率随年龄增大而升高^[6]。该病主要发生于绵羊和山羊，此外，该菌也可感染骆驼、马、牛、兔等多种动物^[7-8]。其感染途径主要是体内外创伤引起，也可通过破损的皮肤、污染的饲料及破溃的脓汁在羊群中直接接触传播，此外，该病也可经呼吸道、消化道或吸血昆虫传播^[9]。由于该病发病缓慢且致死率低，难以引起养殖户重视，而该病一旦侵入羊群则很难彻底清除，是当今世界公认的难以防治的传染病之一，世界上几乎所有养羊的国家或地区甚至大部分羊场都有该病存在^[10]。【前人研究进展】伪结核棒状杆菌隶属棒状杆菌属，放射菌科，兼性胞内寄生，为革兰氏阳性菌^[11]，该菌能够产生坏死性、溶血性外毒素，其成分以磷脂酶为主^[5]。1888年EDWARD从奶牛的淋巴管炎中首次分离出伪结核棒状杆菌^[12]，1891年Preisz和Guinard从羊的肾脏脓肿中再次分离到^[13]，此后，一些学者相继从马、骆驼、羊和人的病变材料中分离到^[14-18]。1956年我国在羊结核结节中分离到该菌^[19]。1989年，Zhao等成功研制出该菌分离用选择培养基, 并用该培养基分离到伪结核棒状杆菌^{[18, 20]}。至今，该菌能从羊鼻腔、咽腔及羊体内外生长脓疱处分离得到。由其引起的羊伪结核棒状杆菌病在世界范围内广泛流行，我国内蒙古、陕西、甘肃、新疆、云南和广东等^{[18, 21]}地区均有该病发生的报道，给养羊业的发展造成极大损失，已引起广大学者的关注^[22-23]，各个国家都对该病的防治和检测都非常重视，因此被农业部列为三类动物疫病^[24]。羊伪结核棒状杆菌病根据其病变类型分为体表型和内脏型，有时两种类型可以同时见于同一只病羊。目前，该病的诊断方法主要有血清学诊断和细菌分离鉴定，血清学诊断方法以酶联免疫吸附试验(ELISA)为主，王韡等^[7]、霍宁宁等^[11]和王璇等^[25]通过ELISA法诊断；郑敏等^[26]、韦志锋等^[27]、朱伟英等^[28]通过分离羊伪结核棒状杆菌并鉴定来诊断该病。【本研究切入点】从病羊皮肤脓肿中分离出伪结核棒状杆菌的报道较多，然而国内尚未有从肺脏脓肿中分离出该菌的报道。本研究从福建省某羊场病死山羊的肺脏脓肿中分离出1株细菌，疑似山羊伪结核棒状杆菌。【拟解决的关键问题】为了明确该分离菌株的分类地位、致病性及药物敏感性，本研究对分离菌株进行了系统鉴定、致病性和药物敏感性试验，为福建省山羊伪结核棒状杆菌病的诊断和合理用药提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   病料来源与采集

福建省屏南县某山羊养殖场某栋羊舍约有10%山羊出现皮肤脓肿、部分病羊脓肿处流出浓汁，病羊精神较差、食欲降低，2019年3月23日，1头山羊出现急性死亡。对送检病死羊进行剖检，可见肺脏肿大、有脓肿、出血，心脏、脾脏、肝脏、肾脏未见明显病变。无菌采取病变肺组织，4~8℃保存备用。

1.2   相关试剂及动物来源

Premix-Taq酶、DNA Marker等购自TaKaRa公司；微生物药敏试纸购自温州市康泰生物科技有限公司；营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、生化鉴定管购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、血液琼脂培养基、LB培养基等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；试验用Balb/c小白鼠购自福州吴氏实验动物贸易有限公司；试验用山羊购自无伪结核棒状杆菌感染羊场。

1.3   细菌的分离培养

无菌挑取肺脏脓肿处组织划线接种于血琼脂平板上，37℃培养24 h后再挑取单个的溶血菌落接种到含10%胎牛血清的LB肉汤培养基上进行培养。将培养后的菌液稀释后再次接种于血琼脂平板上，挑取单个的菌落接种到含有10%胎牛血清的LB肉汤培养基上进行增菌培养。

1.4   引物设计

细菌16S rRNA通用引物参照Weisburg等^[29]设计合成，山羊伪结核棒状杆菌磷脂酶D (phospholipase D，PLD)基因特异性引物参照许国洋等^[30]设计合成，引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，其序列见表 1。

表  1  引物序列

Table  1.  Primer sequence

靶基因 Target gene	引物 Primer	引物序列(5′ → 3′) Primer sequence(5′ → 3′)	扩增片段大小 Amplified fragment size/bp
16S rRNA	F1	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	1500
	R1	CGGCTACCTTGTTACGACTT
PLD基因	F2	GTGAGAAGAACCCCGGTATAAG	291
	R2	TACCGCACTTATTCTGACACTG

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1.5   细菌的形态观察

挑取纯化后接种血琼脂平板上的单个菌落，进行革兰氏染色、镜检以及细菌形态观察。

1.6   16S rRNA序列分析和特异性PCR鉴定

取纯化培养后菌液200 μL，使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的动物基因组DNA提取试剂盒抽提DNA。以抽提后的DNA为模板进行16S rRNA基因的PCR扩增，扩增体系为：Premix-Taq酶20 μL，16S rRNA上、下游引物(10 μmol·L^-1)各2 μL，DNA模板6 μL，ddH₂O补足40 μL，PCR程序为：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸10 min，4℃保存。将PCR扩增产物送铂尚生物技术(上海)有限公司进行克隆测序，获得的序列与GenBank中细菌16S rRNA基因序列进行比较。山羊伪结核棒状杆菌特异性PCR鉴定，20 μL反应体系：Premix-Taq酶10 μL，上、下游引物(10 μmol·L^-1)各1 μL，DNA模板3 μL，ddH₂O 5 μL，PCR反应条件：94℃预变性5 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃终延伸10 min。反应结束后取5.0 μL PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像仪拍照分析。

1.7   生化试验

取处于指数生长期的分离菌按照青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生化反应试剂盒说明书进行操作，操作后的生化管置于37℃恒温培养箱中培养24~48 h，观察其生化特性。

1.8   药敏试验

取处于对数生长期的分离菌悬液0.2 mL均匀涂布在血琼脂平板上，涂布好的血琼脂平板静置片刻，将药敏试纸片放置在平板上并用镊子轻压以防脱落，37℃倒置培养24 h，测量抑菌圈(含药敏纸片)的大小，每种药片作3次重复，取平均值为抑菌圈直径(mm)。按照温州市康泰生物科技有限公司提供的生物药敏试纸说明书，判定分离菌株对抗生素的敏感(S)、中介(I)及耐药(R)性。

1.9   动物攻毒试验

1.9.1   小鼠攻毒试验

取14只Balb/c小鼠，随机分成3组，攻毒组2组，每组5只，空白组4只。攻毒组分别进行皮下和腹腔注射接种，每只小鼠接种0.3 mL含量为4×10⁵ CFU·mL^-1的分离菌，空白对照组腹腔和皮下各注射0. 3 mL PBS。接种后观察临床症状及死亡情况等。同时分别取皮下注射组与腹腔注射组小鼠的肝脏、脾脏及皮下脓肿物再进行细菌分离鉴定。

1.9.2   山羊攻毒试验

取3月龄健康山羊3只，2只皮下接种2 mL含量为4×10⁵ CFU·mL^-1的分离菌，同时经鼻腔接种1 mL含量为4×10⁵CFU·mL^-1的分离菌，另1只皮下和鼻腔分别接种2 mL和1 mL生理盐水作为空白对照。接种后观察临床症状及死亡情况等。试验结束后采集攻毒山羊的肾脏、肝脏及肺脏再进行细菌分离鉴定。

2.   结果与分析

2.1   细菌的分离培养

无菌挑取病死羊肺脏脓肿处组织，接种在血琼脂平板上，在37℃培养箱中培养24 h后可见平板上长出针尖大小的菌落，不透明，呈乳白色，菌落周围有狭窄的β型溶血环，随着培养时间延长菌落变为灰白色，光滑，半透明，且有明显的溶血现象。在普通琼脂培养基上生长不良，在麦康凯琼脂培养基上不能生长。

2.2   细菌染色特性

对分离的细菌进行涂片染色、镜检，可见革兰氏阳性短球杆菌，菌体两端钝圆且着色较深，菌体单个、散在排列。

2.3   分离菌16S rRNA基因序列鉴定及特异性PCR鉴定

通过对分离菌株16S rRNA进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳后可见1条目的片段，其大小为1 500 bp左右，与预期目的片段大小相符(图略)。克隆测序结果显示，所扩增的片段大小为1 512 bp；与GenBank中收录的CP003152.1、CP026374.1、CP036535.1、CP036257.1、CP014543.1、CP003062.1、CP002924.1、CP013146.1、CP003385.1、CP013698.1、CP024995.1、CP012022.2、CP002251.2等(表 2)山羊伪结核棒状杆菌的16S rRNA同源性高达100%。遗传进化树结果显示(图 1)，分离菌与山羊伪结核棒状杆菌在同一分支上，表明该分离菌为山羊伪结核棒状杆菌，命名为FJ-PN。同时用伪结核棒状杆菌特异性引物进行PCR验证，结果如图 2所示，在290 bp左右有一条带，与预测值相符，证实分离菌为山羊伪结核棒状杆菌。

表  2  GenBank中公布的参比序列

Table  2.  Reference sequence published in GenBank

菌株 Strain	登录号 Login ID	宿主 Host	分离地点 Separation location	分离时间 Separation time
3/99-5	CP003152.1	sheep	United Kingdom: Scotland	1999年
OVI2C	CP026374.1	Ovis aries	Brazil:Petrolina	2009年
E7	CP036535.1	Goat	Brazil:Pernambuco	2010年
Cap8W	CP036257.1	goat	Brazil:Pernambuco	2010年
MEX9	CP014543.1	Goat	Mexico: Guanajuato	2012年
42/02-A	CP003062.1	Sheep	Australia	2014年
PAT10	CP002924.1	sheep	Argentina	2014年
N1	CP013146.1	Sheep	Equatorial Guinea: Mongomo	2014年
P54B96	CP003385.1	wildebeest	South Africa	2014年
PO222/4-1	CP013698.1	Goat	Portugal	2015年
KM01	CP024995.1	Goat	China: Yunnan, Kunming	2017年
262	CP012022.2	Bos taurus	Belgium	2017年
I19	CP002251.2	Bovine with severe clinical mastitis in two quarters	Israel	2017年

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图  1  16S rRNA基因的进化分析

Figure  1.  Phylogenetic tree analysis on 16S rRNA gene of FJ-PN

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图  2  山羊伪结核棒状杆菌PCR验证

注：M为2000 DNA Ladder；1为分离菌株；2为阴性对照。

Figure  2.  PCR verification of C. pseudotuberculosis from diseased goats

Note: M=2000 DNA ladder; 1=isolated strain; 2=negative control.

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2.4   生化试验

将分离的山羊伪结核棒状杆菌接种到微量生化管中，在37℃培养24~48 h后观察，结果显示，该分离菌能够分解尿素酶、苯丙氨酸脱羧酶，不能分解3%氯化钠氨基酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、氨基酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶；能发酵1%NaCl甘露糖和1%NaCl乳糖，不能发酵核糖醇、肌醇、甘露醇、蜜二糖、棉子糖；10%NaCl胰胨水、半固体琼脂、氰化钾试验均呈阳性，硫化氢、西蒙氏枸橼酸盐和MR-VP试验均呈阴性。其生化特性与《伯杰细菌鉴定手册》^[31]中的伪结核棒状杆菌的生化特性相符。

2.5   山羊伪结核棒状杆菌分离株的药敏试验

将涂布菌液且贴有药敏片的血琼脂平板37℃培养24 h进行观察，结果显示该分离菌对克拉霉素、环丙沙星、青霉素、四环素、左氟沙星、氧氟沙星、庆大霉素高度敏感，对红霉素、氯霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢西丁、利福平低度敏感，对链霉素、甲氧苄啶耐药。

2.6   小鼠攻毒试验

小鼠在经过腹腔注射0.3 mL含量为4×10⁵CFU·mL^-1的山羊伪结核棒状杆菌后，16 h攻毒小鼠出现精神不佳、活力下降、背部毛蓬松竖起等症状，24 h 3只小鼠死亡，其余2只萎靡不振，32 h后攻毒小鼠全部死亡。皮下注射组攻毒后20 h小鼠精神不佳，24 h有1只小鼠死亡，其余4只活力下降、背部毛蓬松竖起，32 h有4只小鼠死亡，余1只萎靡不振，40 h后全部小鼠死亡。空白对照组小鼠均正常。无菌剖检病死小鼠，发现腹腔注射攻毒小鼠肝脏和脾脏肿大、出血且切面有小白点，皮下注射攻毒小鼠的皮下有淡黄色针尖至粟粒大小的结核样脓肿，空白对照组小鼠均正常(图 3)。从腹腔注射组小鼠的肝脏、脾脏以及皮下注射组小鼠的皮下脓肿物中再次分离到细菌，分别提取其DNA，用伪结核棒状杆菌特异性引物进行PCR鉴定，腹腔注射组和皮下注射组小鼠分离到的细菌均有特异性的扩增条带(图略)。

图  3  小鼠攻毒试验结果

注：A为腹腔注射；C为皮下注射；B、D为空白对照。

Figure  3.  Results of challenge test on mice

Note: A=intraperitoneal injection; C=hypodermic injection; B, D=blank control.

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2.7   山羊攻毒试验

山羊经过皮下接种2 mL、鼻孔接种1 mL含量为4×10⁵CFU·mL^-1的山羊伪结核棒状杆菌后，20 h攻毒山羊出现精神不佳、活力降低等症状，48 h山羊表现出精神极度沉郁、采食量严重降低等症状，攻毒3 d后山羊死亡。剖检病死山羊，发现攻毒山羊皮下出血、肺部有纤维素粘连、腹腔出血、肾脏表面有出血点(图 4)。从攻毒山羊肾脏、肝脏以及肺脏组织中再次分离到细菌，分别提取其DNA，用伪结核棒状杆菌特异性引物进行PCR鉴定，结果显示，肾脏、肝脏以及肺脏中分离到的细菌均有山羊伪结核棒状杆菌特异性的扩增条带(图略)。

图  4  山羊攻毒试验结果

Figure  4.  Results of challenge test on goats

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3.   讨论与结论

伪结核棒状杆菌引起的结核棒状杆菌病目前在世界范围内广泛流行，给养殖业带来巨大损失，已引起广大学者的关注^[22-23]。

PCR作为快速检测技术，在病原鉴定中得到广泛应用，伪结核棒状杆菌的PCR鉴定中常以16S rRNA、rpoB和PLD基因作为靶基因进行检测^[32]。郑敏等^[26]、韦志锋等^[27]、朱伟英等^[28]和李基棕等^[33]根据16S rRNA对分离的山羊伪结核棒状杆菌进行鉴定；许国洋等^[30]根据伪结核棒状杆菌的磷脂酶D基因建立了山羊伪结核棒状杆菌PMA-PCR检测方法。因此，本研究通过细菌16S rRNA基因通用引物和针对伪结核棒状杆菌特异性PCR引物对分离菌进行鉴定，经16S rRNA克隆测序和伪结核棒状杆菌特异性PCR鉴定后，证实分离菌为山羊伪结核棒状杆菌。通过细菌形态观察及生化试验结果显示，该菌在血琼脂平板上呈现针尖大小的菌落，且有明显的溶血现象；该菌能够发酵1%NaCl甘露糖和1%NaCl乳糖，不能发酵核糖醇、肌醇、甘露醇、蜜二糖、棉子糖，这与郑敏等^[26]、王志芳等^[34]、李国平等^[35]、朱伟英等^[28]和李基棕等^[33]报道的一致，符合伪结核棒状杆菌的生化特性。

动物攻毒试验结果显示，经腹腔注射和皮下注射2种方法接种的小鼠，在40 h内全部死亡；经皮下注射途径接种的山羊在攻毒3 d后死亡，剖检发现皮下出血、肺部有纤维素粘连、肾脏表面有出血点，从攻毒山羊肾脏、肝脏以及肺脏组织中再次分离到山羊伪结核棒状杆菌，证明本研究分离的山羊伪结核棒状杆菌具有较强的毒力。

羊伪结核棒状杆菌病目前尚未有商品化疫苗，因此临床上该病的发病率居高不下，发病羊只能通过抗生素进行治疗，但是最近的研究表明，伪结核棒状杆菌已对如复方新诺明、链霉素、呋喃妥因等药物产生了耐药性^{[33, 36-37]}，因此通过药敏试验寻找高敏药物治疗该病是指导临床生产的重要手段之一。本研究的药敏试验结果显示，分离的山羊伪结核棒状杆菌对克拉霉素、环丙沙星、青霉素、四环素、左氟沙星、氧氟沙星、庆大霉素为高度敏感，对红霉素、氯霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢西丁、利福平为低度敏感，对链霉素、甲氧苄啶表现耐药。该结果与潘淑惠等^[38]、王璇等^[10]、张梦思等^[36]、吴浩阳等^[37]研究结果一致，而与王志芳等^[34]、韦志锋等^[27]研究结果不一致，侧面反映了不同地区分离株的耐药性有所差异。

综上所述，本研究从福建省病死山羊肺脏中分离出1株山羊细菌，经系统鉴定证明该菌为山羊伪结核棒状杆菌，致病性试验结果显示分离的山羊伪结核棒状杆菌具有较强的毒力，药敏试验结果显示该菌对克拉霉素、环丙沙星等高度敏感，对红霉素、氯霉素等低度敏感，对链霉素、甲氧苄啶表现耐药，为该病的诊断和合理用药提供了科学依据。