Effect of Laminarin on Growth and Immunity of Pearl Gentian Grouper
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摘要: 为了探究海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能和免疫力的影响,在石斑鱼膨化颗粒配合饲料中添加0.6%海带多糖投喂平均体重(275.55±29.79)g·尾-1的珍珠龙胆石斑鱼,结合养殖场实际生产,试验组和对照组各设2口面积30 m2水泥池,每口放养约1 800尾,在封闭式循环水饲养系统饲养66 d。试验结果表明,添加海带多糖的试验组比对照组增重率提高29.03%(P < 0.05),特定生长率提高23.88%(P < 0.05),饲料系数降低15.20%(P < 0.05);试验组石斑鱼每增重1 kg的饲料成本比对照组减少1.96元,饲料成本降低了12.54%;试验组与对照组石斑鱼肌肉营养成分差异不显著(P>0.05);试验组珍珠龙胆石斑鱼免疫活性(碱性磷酸酶AKP、溶菌酶LZM、总超氧化物歧化酶T-SOD)比对照组显著提高(P < 0.05)。研究表明,海带多糖具有提高珍珠龙胆石斑鱼生长性能、增强机体免疫力的作用。Abstract: An experimentation was conducted to determine the effect of the addition of laminarin in feed on the growth, body composition and immunity of pearl gentian groupers at an aquaculture farm.Four separate 30 m2 concrete pools were used as a closed circulating water aquaculture system for the experiment. Simultaneously, approximately 1 800 groupers were placed in each of two pools for the treatment or control. The initial weight of the individual fish was (275.55±29.79) g. They were fed with either a control diet or one containing 0.6% laminarin in the pools for 66 d. At end of the feeding period, the weight gain of the groupers in the treatment group increased 29.03% (P < 0.05), the specific growth ratio increased 23.88% (P < 0.05), and the feed conversion rate decreased 15.20% (P < 0.05) over those of control, while the nutrient content in flesh of the treatment showed no significant difference as compared with control (P>0.05). For each kg weight gain on the fish, the cost of the treatment diet was 1.96 yuan less than that of control, i.e., a reduction of 12.54%. On the other hand, the activities of alkaline phosphatase, lysozyme and total superoxide dismutase enzymes of the groupers in the treatment group were significantly higher than those of control (P < 0.05). It was, thus, concluded that addition of 0.6% laminarin in the regular feed would improve the growth and enhance the immunity of pearl gentian groupers in aquaculture.
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Keywords:
- laminarin /
- pearl gentian grouper /
- growth performance /
- immunity
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石斑鱼是名贵的海水鱼类,经济价值很高,这几年在我国的养殖发展迅速,规模和产量逐年增加。珍珠龙胆石斑鱼Epinephelus Lanceolatus♀×Epinephelus fuscoguttatuss♂隶属鲈形目Perciformes、鲈亚目Percoidei、鳍科Serranodae、石斑鱼属Epinephelus,是棕点石斑鱼Epinephelus fuscoguttatus(俗称老虎斑) 与鞍带石斑鱼Epinephelus lanceolatu(俗称龙胆) 杂交的新品种,具有老虎斑抗病力强和龙胆生长速度快的优点,其肉质鲜美细嫩、营养丰富、抗逆性强、生长速度快,是目前广东、海南、福建等省石斑鱼主养区养殖比例最高的品种。海带多糖是从海带中分离提取的多糖成分,主要包括海带淀粉、褐藻胶和褐藻糖胶[1-2],具有广泛的生物活性。海带多糖具有抗氧化、增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗凝血、抗动脉粥样硬化等作用。迄今为止,海带多糖在水产养殖中的应用研究仍然很少,尚未见到在珍珠龙胆石斑鱼的应用报道,特别是在养殖场生产实际的应用。本研究在课题组前期对石斑鱼营养参数与配合饲料研究[3-5],及海带多糖在斜带石斑鱼Epinephelus coioides的应用研究[6-7]基础上,在石斑鱼配合饲料中添加海带多糖,研究其对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、免疫活性的影响,以期为海带多糖在海水鱼饲料中的应用及配制石斑鱼高效环保型功能性饲料提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验饲料配制
饲料委托福建省漳州市一家饲料公司生产,根据课题组对海带多糖在石斑鱼应用的前期研究结果,在其市售石斑鱼膨化颗粒配合饲料中添加0.6%海带多糖 (福建省动物药物工程实验室制备,用水提法工艺提取[8-10]) 作为试验组,以该公司市售石斑鱼饲料作为对照组,其主要原料组成:进口红鱼粉、发酵豆粕、啤酒酵母、面粉、复合维生素、复合矿物质、大豆卵磷脂及其他添加剂。饲料营养成分见表 1。
表 1 石斑鱼饲料营养成分Table 1. Nutrient content of basal diet for pearl gentian groupers(单位/%) 组别 水分 粗蛋白 粗脂肪 粗灰分 钙 总磷 试验饲料 8.01 48.41 9.66 12.37 1.89 1.64 对照饲料 7.83 47.87 9.91 11.88 1.86 1.58 1.2 试验地点与试验用鱼
试验在厦门小嶝水产科技有限公司的封闭式循环水饲养系统进行,每口养殖池面积30 m2,水深约在100 cm,保持循环流水状态。试验共设2组,每组设2个重复,共4口水泥池, 其中2口为对照组。试验用鱼来自小嶝水产公司,结合该公司实际养殖生产开展试验。预试验7 d后进行分组,选取规格均匀、体质健壮,平均体长 (21.61±2.06) cm,平均体重 (275.55±29.79) g·尾-1的珍珠龙胆石斑鱼,每口水泥池放养约1 800尾。
1.3 饲养管理
在试验开始、结束时,对水泥池里的珍珠龙胆石斑鱼进行计数,抽样测定体重、体长。试验期间日常的饲养管理、病害防治等工作按常规管理方法进行。每天投喂2次,投喂时间一般为上午7:30~8:00,下午17:00~17:30。投饵率控制在2%左右,投饵量根据气候、水温、水质及珍珠龙胆石斑鱼的摄食状况而定。每天详细记录各水泥池的实际投喂量。每天检查水泥池内石斑鱼的活动状况,若有死亡,做好记录,并定时测定水温,每2 d测定1次氨氮、亚硝酸氮、溶解氧、pH值。试验时间66 d,平均水温 (28.8±2.1)℃,pH值 (7.85±0.19),盐度 (35.06±1.32),溶解氧≥4.2 mg·L-1,氨氮≤0.18 mg·L-1,亚硝酸氮≤0.007 mg·L-1。
1.4 取样
在饲养试验结束时,每个水泥池随机抽取3尾石斑鱼,取背部肌肉,用组织捣碎机捣碎、混合均匀,测定每池石斑鱼肌肉中水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量。
1.5 试验测定指标
(1) 生长性能指标
饲料系数=总投饵量/总增重
尾绝对增重=试验结束尾重-试验开始尾重
增重率/%=(尾绝对增重/试验开始尾重)×100%
日增重=尾绝对增重/试验天数
特定生长率 (SGR)/%=100×(lnWt-lnW0)/t,其中Wt为试验结束时石斑鱼体重,W0为石斑鱼初始体重,t为试验天数。
成活率/%=(试验结束鱼尾数/试验开始鱼尾数)×100%
测定石斑鱼配合饲料的常规营养成分 (粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、水分、钙、总磷)。水体中的溶解氧 (DO) 采用碘量法测定,氨氮、亚硝酸氮、pH用厦门开普瑞生物科技有限公司生产的试剂盒测定。分别采用GB/T 6432-1994、GB/T 6433-2006、GB/T 6438-2007、GB/T 6435-2006、GB/T 6436-2002、GB/T 6437-2002提供的方法测定饲料和鱼体肌肉水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、钙、总磷。
(2) 免疫活性指标
总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、溶菌酶 (LZM)、碱性磷酸酶 (AKP) 等测定及计算方法均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒的方法进行,其所用试剂盒分别为T-SOD测试盒 (A001-1)、LZM测试盒 (A050)、AKP测试盒 (A059-1)。
T-SOD活性单位定义为1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个亚硝酸盐单位 (U·mL-1);
AKP活性单位定义为100 mL血清在37℃条件下与底物作用15 min, 产生1 mg酚为1个金氏单位 (U/100mL);
由于LZM能够水解细菌细胞壁上肽聚糖使细菌裂解而浓度降低,透光度增强,LZM活性可根据透光度变化来推测其含量,单位为μg·mL-1。
1.6 数据统计分析
试验数据结果采用统计软件SPSS 10.0处理。
2. 结果与分析
2.1 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响
海带多糖对石斑鱼生长性能的影响见表 2。由表 2可见,添加海带多糖的试验组与对照组平均日增重分别为2.96、2.40 g,增重率分别为73.23%、56.75%,试验组比对照组增重率提高29.03%(P < 0.05),试验组比对照组特定生长率提高23.88%(P < 0.05);饲料系数分别为1.06、1.25,试验组比对照组饲料系数降低15.20%,试验组与对照组两者差异显著 (P < 0.05)。由于本试验开始时石斑鱼规格已经较大,平均体重达到275.5 g·尾-1,这时在石斑鱼的生长阶段中已经处于死亡率很低的时候,所以试验组与对照组的成活率差异不显著 (P>0.05)。市售石斑鱼饲料价格为12 500元·t-1,添加海带多糖的试验饲料每吨成本增加400元,但是由于降低了饲料系数,添加海带多糖的试验组石斑鱼每增重1 kg的饲料成本比对照组减少1.96元,饲料成本降低了12.54%。
表 2 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长的影响Table 2. Effect of laminarin on growth of pearl gentian groupers组别 放养
数量
/尾始重/
(g·尾-1)末重/
(g·尾-1)日增重
/g平均日
增重
/g增重率
/%平均增
重率
/%特定生
长率
/%饲料
系数平均
饲料
系数成活率
/%平均成
活率
/%饲料
单价/
(元·kg-1)增重饲料
成本/
(元·kg-1)试验组
1号1810 277.4 468.2 2.89 2.96±
0.08 a68.78 73.23±
4.45 a0.83±
0.04 a1.11 1.06±
0.04 a99.78 99.87±
0.09 a12.9 13.67 试验组
2号1805 258.4 459.1 3.04 77.67 1.02 99.95 对照组
1号1820 243.6 395.3 2.30 2.40±
0.10 b62.27 56.75±
5.52 b0.67±
0.05 b1.22 1.25±
0.03 b99.84 99.91±
0.07 a12.5 15.63 对照组
2号1790 322.8 488.2 2.50 51.24 1.28 99.98 注:同行数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。表 3、4同。 2.2 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼肌肉成分的影响
由表 3可见,添加0.6%海带多糖的试验组珍珠龙胆石斑鱼肌肉粗蛋白、粗脂肪含量比对照组有提高趋势,但差异不显著 (P>0.05), 水分、粗灰分含量试验组与对照组差异也不显著 (P>0.05),说明海带多糖对石斑鱼肌肉常规营养成分没有显著影响。
表 3 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼肌肉成分的影响Table 3. Effect of laminarin on muscle nutrient content of pearl gentian groupers组别 水分 粗蛋白 粗脂肪 粗灰分 试验组 74.12±0.82 a 21.09±0.15 a 1.27±0.12 a 1.29±0.08 a 对照组 74.47±1.02 a 20.76±0.27 a 1.13±0.09 a 1.36±0.07 a 2.3 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫活性的影响
海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫活性的影响见表 4。由表 4可见,添加0.6%海带多糖的试验组珍珠龙胆石斑鱼免疫活性 (碱性磷酸酶AKP、溶菌酶LZM、总超氧化物歧化酶T-SOD) 比对照组都有显著提高 (P < 0.05)。
表 4 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫活性的影响Table 4. Effect of laminarin on immunity of pearl gentian groupers组别 每100mL碱性
磷酸酶AKP
/U溶菌酶LZM/
(μg·mL-1)总超氧化物歧
化酶T-SOD/
(U·mL-1)试验组 15.20±1.15 a 6.90±0.76 a 171.50±8.97 a 对照组 10.49±0.89 b 3.49±0.65 b 146.66±7.15 b 3. 讨论与结论
3.1 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响
我国海洋生物多糖品种很多,资源丰富,它可提高动物机体免疫力,并且具有多种生物活性。海洋生物多糖主要可分为3大类:海洋动物多糖、海洋植物多糖和海洋微生物代谢产生的多糖。海带Laminaria japonica是构成海洋水产资源的重要部分,其富含的多糖类物质结构、性质不同,具有多种生物活性。海带中的2种多糖——褐藻胶和褐藻糖胶是细胞壁的填充物,另一种多糖——褐藻淀粉广泛存在于细胞质。褐藻胶即褐藻酸盐类,在海带中的含量大约19.7%,主要成分是α-1,4-L-古罗糖醛酸和β-1,4-D-甘露糖醛酸,作为单体构成嵌段共聚物。褐藻糖胶在海带中的含量大约为2.46%,是由α-L-岩藻糖4-硫酸酯多聚物组成[11]。褐藻淀粉主要由1,3糖苷键连接葡萄糖组成葡聚糖。这3种海带多糖均具有消除自由基和抗氧化作用,可改善和增强机体免疫力。
在本试验中,试验组比对照组特定生长率提高23.88%(P < 0.05),饲料系数降低15.2%(P < 0.05),由于添加海带多糖提高了珍珠龙胆石斑鱼生长速度,降低了饲料系数,添加海带多糖的试验组石斑鱼每增重1 kg的饲料成本比对照组降低了12.54%。多糖类物质具有广泛的免疫调节作用,并可产生多种生理活性。有关免疫活性多糖对水生动物的生理调节作用研究报道,在中国对虾Penaeus Chinensis、扇贝Chlamys farreri等体内注射多糖,可提高其血清超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、溶菌酶 (LZM) 等的活性,增强抗病力,提高养殖成活率[12-13]。周永灿等[14]的试验表明,在卵形鲳鲹Trachinotus ovatus饲料中加入用量为10 mg·(kg·d)-1的嗜麦芽假单胞菌脂多糖进行投喂,提高了卵形鲳鲹的血清凝集抗体效价、白细胞吞噬活力、免疫保护率,并且可有效抵御嗜麦芽假单胞菌引起的溃疡病发生。李文武等[6]研究报道,在饲料中添加不同水平的海带多糖饲养斜带石斑鱼Epinephelus coioides 48 d,结果观察到海带多糖具有促进石斑鱼生长,提高饲料利用效率的作用,并且其功效没有随着多糖添加量增加而更加明显,多糖添加量以0.5%为合适添加量。向枭等[15]在齐口裂腹鱼Schizothorax prenanti的饲料中添加黄芪多糖,投喂体重 (6.98±0.43) g齐口裂腹鱼50 d,能提高齐口裂腹鱼的生长性能,饲料中未添加黄芪多糖组的增重率 (WGR)、特定生长率 (SGR)、饲料蛋白效率 (PER) 均显著低于黄芪多糖添加组 (P < 0.05),而饲料系数 (FCR) 显著高于黄芪多糖添加组 (P < 0.05)。刘洪丽等[16]在奥尼罗非鱼的饲料中添加0.1%的马尾藻多糖可提高奥尼罗非鱼Oreuchrumis aureus ♂×Oreochromis niloticus ♀的增重率和饲料效率 (P < 0.01)。各种生物多糖的结构不同、活性成分各异,其作用机理还研究得不够深入和清楚,但是都具有免疫调节促生长作用,可作为动物的绿色环保添加剂[17]。海带多糖在水生动物的应用研究还很少,本试验结果说明了海带多糖对水生动物具有明显的促生长作用。研究表明,多糖生理活性或者大分子糖蛋白的决定部位是其中具有特殊结构的寡糖片段或者其重复组成单元,各种不同生物多糖的功能具有共性作用[17]。
另外在本试验中,石斑鱼初始规格已经较大,成活率已很高 (99.9%),试验组与对照组差异不显著,所以对海带多糖提高养殖鱼免疫力和成活率还需今后进一步研究。
3.2 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫活性的影响
生物机体会因为各种应激反应和细胞活动而产生很多自由基,如果自由基过多,容易和细胞膜中的不饱和脂肪酸形成脂质自由基,引起脂质过氧化反应,破坏细胞的完整性,造成机体组织与细胞氧化损伤。超氧化物歧化酶活力 (SOD) 是生物机体组织中重要的抗氧化酶之一,可清除体内超氧阴离子自由基、抗氧化、预防生物分子损伤的作用,它可直接捕获O2-,其活性与生物的免疫水平密切相关[18]。溶菌酶 (LZM) 可水解革兰氏阳性细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解后被释放出来,破坏和消除侵入体内的细菌,存在于鱼体的吞噬细胞和血清中,对病原体有重要的防御作用。碱性磷酸酶 (AKP) 是磷酸酶的一种,属于膜结合蛋白,在生物体内可直接参与磷酸基团的转移和代谢生理过程,可将对应底物去磷酸化,生成磷酸根离子和自由羟基,在机体免疫反应中起着重要作用[19]。
杨福刚等[20]将葡聚糖添加到饲料中投喂凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 33 d后,发现对虾溶菌酶、SOD活性有显著提高,凡纳滨对虾的存活率升高。在本研究中,添加0.6%海带多糖的珍珠龙胆石斑鱼免疫活性 (碱性磷酸酶AKP、溶菌酶LZM、总超氧化物歧化酶T-SOD) 比对照组显著提高 (P < 0.05),说明海带多糖具有提高动物机体免疫力的作用。
据研究报道,海带多糖作为一种免疫调节剂,其作用强度和枸杞多糖、香菇多糖接近,能够免疫调节巨噬细胞、T细胞。Zvyagintseva[21]的研究发现,20 g·L-1褐藻糖胶溶解产生50%的抑制,褐藻糖胶硫化的程度不会影响其对补体旁路的作用,说明海带水溶性多糖对补体旁路的作用。王庭欣等[22]从细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫等3个方面研究了海带多糖的免疫功能,发现海带多糖可显著加强巨噬细胞吞噬功能,提高小鼠的细胞免疫力。詹林盛[23]的研究报道,海带多糖能够恢复由环磷酰胺引起免疫低下小鼠的免疫功能。本试验结果也说明了海带多糖的免疫调节作用。
海带多糖的结构复杂,很难用一种或者几种方法分析出其基本结构,对其作用机理目前研究还很少,对其起抗氧化作用和免疫作用的活性成分和结构仍然了解不多,需要今后深入研究。多糖的分离、纯化十分复杂,很难得到均一的活性多糖组分,并且其重现性较差。本研究应用的是海带粗多糖,今后应加强研究多糖的分离提取工艺,对其进一步纯化,以降低在配合饲料中的添加量。要扩大海带多糖的量产规模,以进一步降低其生产成本和使用价格,促进海带多糖在名优海水鱼及其他水生动物的应用。
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表 1 石斑鱼饲料营养成分
Table 1 Nutrient content of basal diet for pearl gentian groupers
(单位/%) 组别 水分 粗蛋白 粗脂肪 粗灰分 钙 总磷 试验饲料 8.01 48.41 9.66 12.37 1.89 1.64 对照饲料 7.83 47.87 9.91 11.88 1.86 1.58 表 2 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼生长的影响
Table 2 Effect of laminarin on growth of pearl gentian groupers
组别 放养
数量
/尾始重/
(g·尾-1)末重/
(g·尾-1)日增重
/g平均日
增重
/g增重率
/%平均增
重率
/%特定生
长率
/%饲料
系数平均
饲料
系数成活率
/%平均成
活率
/%饲料
单价/
(元·kg-1)增重饲料
成本/
(元·kg-1)试验组
1号1810 277.4 468.2 2.89 2.96±
0.08 a68.78 73.23±
4.45 a0.83±
0.04 a1.11 1.06±
0.04 a99.78 99.87±
0.09 a12.9 13.67 试验组
2号1805 258.4 459.1 3.04 77.67 1.02 99.95 对照组
1号1820 243.6 395.3 2.30 2.40±
0.10 b62.27 56.75±
5.52 b0.67±
0.05 b1.22 1.25±
0.03 b99.84 99.91±
0.07 a12.5 15.63 对照组
2号1790 322.8 488.2 2.50 51.24 1.28 99.98 注:同行数据后不同小写字母表示差异显著 (P < 0.05)。表 3、4同。 表 3 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼肌肉成分的影响
Table 3 Effect of laminarin on muscle nutrient content of pearl gentian groupers
组别 水分 粗蛋白 粗脂肪 粗灰分 试验组 74.12±0.82 a 21.09±0.15 a 1.27±0.12 a 1.29±0.08 a 对照组 74.47±1.02 a 20.76±0.27 a 1.13±0.09 a 1.36±0.07 a 表 4 海带多糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫活性的影响
Table 4 Effect of laminarin on immunity of pearl gentian groupers
组别 每100mL碱性
磷酸酶AKP
/U溶菌酶LZM/
(μg·mL-1)总超氧化物歧
化酶T-SOD/
(U·mL-1)试验组 15.20±1.15 a 6.90±0.76 a 171.50±8.97 a 对照组 10.49±0.89 b 3.49±0.65 b 146.66±7.15 b -
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