Optimization of Ultrasound/Microwave-assisted Extraction of Polysaccharides from Hibiscus sabdariffa L. by Box-Behnken Response Surface Methodology
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摘要: 在单因素试验基础上，以玫瑰茄为原料，液料比、提取时间和微波功率为自变量，玫瑰茄多糖得率为因变量，采用Box-Behnken响应面法优化超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖工艺，并和水浴浸提、微波提取、超声波提取进行比较。结果表明：超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖最佳工艺条件为：液料比（mL:g）20:1，提取时间15 min，微波功率150 W，超声波功率240 W。最佳提取条件下，玫瑰茄多糖提取率为3.51%。超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖工艺可行，操作简单。与其他提取法相比，不仅缩短了提取时间，而且提高玫瑰茄多糖的提取率。
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关键词:
- Box-Behnken响应面法 /
- 超声波-微波协同 /
- 玫瑰茄 /
- 多糖 /
- 提取
Abstract: The extraction of polysaccharides from Hibiscus sabdariffa L. utilizing both ultrasound and microwave was optimized by Box-Behnken response surface methodology. For the single factor experiment the independent variables were the solvent-substrate ratio, extraction time and microwave power applied for the process. The resulting polysaccharides yields were compared among the various processes including the water, microwave-assisted, ultrasound-assisted, and ultrasonic/microwave-assisted extractions. The combination of ultrasonic and microwave was found to improve the efficiency and time-saving for the process. It was, therefore, further optimized using the Box-Behnken response surface method to finalize the extraction that required a solvent-substrate ratio of 20:1 (mL:g), an extraction duration of 15min, and a combined application of 150 W microwave power and 240 W ultrasound to reach a 3.51% polysaccharide yield from H. sabdariffa. -
玫瑰茄Hibiscus sabdariffa L.，又名洛神花、洛神葵[1]、芙蓉煎[2]等，是一种药食两用的植物[3]。玫瑰茄花萼呈紫红色，含有丰富的多糖、黄酮类化合物、木槿酸等活性物质[4-6]。
多糖是玫瑰茄花萼重要活性成分之一。研究表明，植物多糖具有增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗血栓、抗衰老、抗病毒等作用[7-10]，因此成为近年来研究热点。植物多糖提取方法主要有超滤法、溶剂提取法、酶解法、微波提取法、超声波辅助提取法等[11-14]。近年来，超声波-微波协同提取技术因具有保护有效成分、提取效率高、节约能耗等特点[15]而被广泛应用，但应用于提取玫瑰茄多糖的研究尚未见报道。本文以玫瑰茄干花萼为原料，响应面优化超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖工艺，为玫瑰茄多糖进一步开发提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
玫瑰茄：市售；D-无水葡萄糖：美国Sigma；无水乙醇、苯酚等化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ME204梅特勒电子天平(北京欧信胜科技有限公司)；XH300B微波-超声波联合萃取仪(北京祥鹤科技发展有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器设备公司)；UV-1800-DS2紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；LGR10-4.2高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1.3 试验方法
1.3.1 样品预处理
用清水洗净无病虫害玫瑰茄花萼，将花萼55~60℃烘干10~12 h，粉碎，过70目筛，密封保存。
1.3.2 玫瑰茄多糖超声波-微波协同提取工艺流程
将玫瑰茄花萼干粉置于萃取容器中，在一定的超声波功率、液料比、提取时间和微波功率条件下提取，提取液抽滤、浓缩后，加入95%乙醇，冷冻离心15 min，收集沉淀，得玫瑰茄多糖与蛋白质混合物，用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用Sevage试剂(正丁醇:氯仿 = 4:1)脱蛋白数次，最后将上清液定容，摇匀得玫瑰茄多糖提取液。
1.3.3 标准曲线的绘制和玫瑰茄多糖得率的计算
采用苯酚-硫酸法测定多糖[16]，玫瑰茄多糖得率计算公式[17]：
多糖得率=多糖提取量×稀释倍数玫瑰茄花萼干粉质量×100% 1.4 试验设计
1.4.1 单因素试验
以水为提取剂，选取超声波功率、液料比、提取时间、微波功率4个因素，以玫瑰茄多糖得率为衡量指标，进行单因素试验。
1.4.2 响应面优化试验设计
根据单因素试验结果，选取对玫瑰茄多糖得率影响显著的液料比、提取时间、微波功率为自变量，玫瑰茄多糖得率为因变量，进行Box-Behnken响应面优化试验设计。试验因素与水平设计如表 1所示。
表 1 响应面试验因素水平Table 1. Factors and levels of RAS test水平 A液料比/(mL:g) B提取时间/min C微波功率/W -1 15:1 10 100 0 20:1 15 150 1 25:1 20 200 1.5 数据分析
所有试验均重复3次，结果取平均值，运用Excel 2016软件进行数据处理，运用SPSS 22.0软件进行单因素显著性分析，运用Design-Expert 8.0.5软件进行响应面数据分析。
2. 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线回归方程y = 6.9821x+0.0005，R2 = 0.9996，式中：x为葡萄糖质量浓度mg·mL-1，y为吸光值，R2值表明葡萄糖质量浓度为0.00~0.06 mg·mL-1时，吸光值与质量浓度线性关系良好。
2.2 单因素试验
2.2.1 超声波功率对玫瑰茄多糖得率的影响
在微波功率100 W，提取时间5 min，液料比(mL:g) 20:1的条件下，研究超声波功率(150、180、210、240、270 W)对玫瑰茄多糖得率的影响结果见图 1。由图 1可知，玫瑰茄多糖得率随着超声波功率增大先增加后减少，超声波功率为240 W时，玫瑰茄多糖得率最大。其原因是超声波的机械振动破坏多糖细胞壁结构，使多糖溶出，但是过大的机械振动会破坏多糖的活性成分，使多糖得率降低。因此，选定超声波功率为240 W。
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图 1 超声波功率对玫瑰茄多糖得率的影响Figure 1. Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield from H. sabdariffa2.2.2 液料比对玫瑰茄多糖得率的影响
在超声波功率240 W，微波功率100 W，提取时间5 min的条件下，研究液料比(mL:g)10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1对玫瑰茄多糖得率的影响结果见图 2。由图 2可知，玫瑰茄多糖得率随着液料比增大呈先增加后减少，当液料比为20:1(mL:g)时，多糖得率最大。其原因是提取溶剂用量越大，介质推动力越大，玫瑰茄多糖溶出越多，但提取溶剂用量过大，会导致其他水溶性物质溶出，增加能耗，降低多糖得率。因此，选定液料比(mL:g)为20:1。
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图 2 液料比对玫瑰茄多糖得率影响Figure 2. Effect of solvent-substrate ratio on polysaccharides yield from H. sabdariffa2.2.3 提取时间对玫瑰茄多糖得率的影响
在超声波功率240 W，微波功率100 W，液料比(mL:g)为20:1的条件下，研究提取时间(5、10、15、20、25 min)对玫瑰茄多糖得率的影响结果见图 3。由图 3可知，玫瑰茄多糖得率随着提取时间延长呈现先增加后减少趋势，提取时间为15 min时，玫瑰茄多糖得率最高，其原因是随着时间的延长，玫瑰茄多糖中敏感物质失去活性。因此，选定提取时间15 min。
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图 3 提取时间对玫瑰茄多糖得率的影响Figure 3. Effect of extraction time on polysaccharides yield from H. sabdariffa2.2.4 微波功率对玫瑰茄多糖得率的影响
在超声波功率240 W，提取时间15 min，液料比(mL:g)为20:1的条件下，研究微波功率(100、150、200、250、300 W)对玫瑰茄多糖得率的影响结果见图 4。由图 4可知，玫瑰茄多糖得率随着微波功率增大先增加后减少，其原因是微波升温快速，加快多糖溶出，但是微波功率过大，会阻碍介质渗入[18]。因此，选定微波功率150 W。
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图 4 微波功率对玫瑰茄多糖得率的影响Figure 4. Effect of microwave power on polysaccharides yield from H. sabdariffa2.3 玫瑰茄多糖提取条件响应面分析
2.3.1 响应面试验结果
Box-Behnken设计方案及试验结果见表 2，回归方程的方差分析见表 3。
表 2 Box-Behnken设计方案及试验结果Table 2. Box-Behnken design and results试验号 液料比/(mL:g) 提取时间/min 微波功率/W 多糖得率/% 1 -1 -1 0 2.16 2 1 -1 0 0.87 3 -1 1 0 1.02 4 1 1 0 1.56 5 -1 0 -1 1.99 6 1 0 -1 1.34 7 -1 0 1 1.94 8 1 0 1 1.53 9 0 -1 -1 1.63 10 0 1 -1 0.96 11 0 -1 1 1.44 12 0 1 1 1.50 13 0 0 0 3.46 14 0 0 0 3.61 15 0 0 0 3.44 16 0 0 0 3.46 17 0 0 0 3.52 表 3 回归方程的方差分析Table 3. Analysis of variance on regression equation方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr > F 显著性 模型 15.98 9 1.78 310.64 < 0.0001 *** A 0.41 1 0.41 71.66 < 0.0001 *** B 0.14 1 0.14 24.58 0.0016 ** C 0.030 1 0.030 5.25 0.0557 AB 0.84 1 0.84 146.50 < 0.0001 *** AC 0.014 1 0.014 2.52 0.1565 BC 0.13 1 0.13 23.31 0.0019 ** A2 3.33 1 3.33 582.27 < 0.0001 *** B2 6.13 1 6.13 1072.44 < 0.0001 *** C2 3.48 1 3.48 608.76 < 0.0001 *** 残差 0.040 7 5.715×10-3 失拟项 0.021 3 6.908×10-3 1.43 0.3576 纯误差 0.019 4 4.820×10-3 所有项 16.02 16 注：A为液料比，B为提取时间，C为微波功率。***为差异极显著(P < 0.001)，**为差异高度显著(P < 0.01)*为差异显著(P < 0.05)。 由表 2可知，不同试验条件下所测定的玫瑰茄多糖得率，对试验数据进行多元回归拟合，得到玫瑰茄多糖得率对液料比(A)、提取时间(B)、微波功率(C)二次多项回归方程为Y = 3.50-0.23A-0.13B+0.061C+0.46AB+0.060AC+0.18BC-0.89A2-1.21B2-0.91C2(R2 = 0.994 3)。R2 = 0.994 3，表明该模型与实际试验误差较小。由表 3可知模型的P < 0.0001，表明回归模型极显著；并且该模型的失拟项P>0.05，不显著，表明可以通过此模型来预测多糖最优提取条件。在回归方程中，A、B、AB、BC、A2、B2、C2 对多糖得率影响极显著，C、AC对多糖得率影响不显著。液料比对多糖得率影响最大，其次是提取时间，微波功率对多糖得率影响最小。
2.3.2 响应面和等高线分析因素间的相互作用
三维空间的响应面及二维平面上的等高线图结果见图 5~7。图 5响应面曲线较陡，等高线为椭圆形可得，液料比和提取时间交互作用对多糖得率影响显著，分别在液料比(mL:g)19:1~20:1和提取时间14~15 min出现最大值。由图 6响应面曲线较平滑，等高线为圆形可得，液料比和微波功率交互作用对多糖得率影响不显著，分别在液料比(mL:g)为19:1~20:1和微波功率150~152 W出现最大值。由图 7响应面曲线较陡，等高线为椭圆形可得，提取时间和微波功率交互作用对多糖得率影响显著，分别在提取时间14~15 min和微波功率150~152 W出现最大值。
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图 6 液料比和微波功率对玫瑰茄多糖得率影响的响应面和等高线Figure 6. Response surface and contour plot showing interactive effect of solvent-substrate ratio and microwave power on polysaccharides yield from H. sabdariffa![]()
图 7 提取时间和微波功率对玫瑰茄多糖得率影响的响应面和等高线Figure 7. Response surface and contour plot showing interactive effect of extraction time and microwave power on polysaccharides yield from H. sabdariffa等高线变化越密集，表明因素对响应值峰值影响越大，等高线变化越稀疏，表明因素对响应值峰值影响越小[19]。由图 5~7等高线疏密程度可知，液料比、提取时间对多糖得率影响显著，微波功率对多糖得率影响不显著，三者影响程度的大小依次为：液料比>提取时间>微波功率，与表 3的分析结果吻合。
2.4 响应面试验模型的验证
优化后的最佳提取工艺条件为：超声波功率240 W、液料比(mL:g) 19.26:1、提取时间14.59 min、微波功率151.07 W，玫瑰茄多糖得率预测值为3.52%。根据响应面试验结果，考虑到操作简便，确定超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖最优工艺条件为：超声波功率240 W、液料比(mL:g) 20:1、提取时间15 min、微波功率150 W，在此条件下玫瑰茄多糖得率为3.51%，与预测值相对误差为0.28%。
2.5 不同提取方法的玫瑰茄多糖得率比较
不同提取方法对玫瑰多糖得率的影响见表 4。由表 4可得超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖得率最高，为3.51 %，表明超声波-微波协同提取法具有节约能耗，缩短提取时间、提高多糖得率和不易破坏有效成分等优点[20]。
表 4 不同提取方法对玫瑰茄多糖得率的影响Table 4. Effect of extraction methods on polysaccharides yield from H. sabdariffa方法 提取时间/min 多糖得率/% 水浴浸提 240 1.80 微波提取 20 2.04 超声波提取 30 2.58 超声波-微波协同提取 15 3.51 3. 讨论与结论
超声波-微波协同提取是近年来发展起来的新技术。超声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物细胞，使溶剂渗透到细胞中，具有缩短提取时间、提高得率、节约能耗、操作简便等优点。微波提取是利用电磁场的作用使固体物质中的有效成分与基体分离，具有省时、节能、污染小、提取效率高等优点。尽管以上两种提取技术各具优点，但超声波提取在提取过程中很难达到提取所需高温；微波提取则存在加热不均、升温太快等问题，而采用超声波-微波协同提取可以扬长避短，即超声波产生的空化效应和搅拌作用能有效弥补微波传热、传质不均等缺陷，而微波极佳的热效应能有效地弥补超声波产热不足的问题[21]。超声波-微波协同提取极大节省提取时间，是一种高效、快速、节能、环保的提取方法。与水浴浸提、微波提取、超声波提取相比，超声波-微波协同提取玫瑰茄多糖缩短了提取时间，多糖得率分别提高1.71%、1.47 %和0.93 %。
通过Box-Behnken响应面试验对玫瑰茄进行超声波-微波协同提取多糖条件优化，确定最佳工艺条件为液料比(mL:g)20:1，提取时间15 min，微波功率150 W，超声波功率240 W。在此条件下，玫瑰茄多糖得率最高，为3.51 %。结果表明，采用响应面优化建立的回归模型拟合良好，优化得到的提取工艺条件具有实际应用价值。
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图 1 超声波功率对玫瑰茄多糖得率的影响
Figure 1. Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield from H. sabdariffa
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图 2 液料比对玫瑰茄多糖得率影响
Figure 2. Effect of solvent-substrate ratio on polysaccharides yield from H. sabdariffa
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图 3 提取时间对玫瑰茄多糖得率的影响
Figure 3. Effect of extraction time on polysaccharides yield from H. sabdariffa
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图 4 微波功率对玫瑰茄多糖得率的影响
Figure 4. Effect of microwave power on polysaccharides yield from H. sabdariffa
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图 6 液料比和微波功率对玫瑰茄多糖得率影响的响应面和等高线
Figure 6. Response surface and contour plot showing interactive effect of solvent-substrate ratio and microwave power on polysaccharides yield from H. sabdariffa
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图 7 提取时间和微波功率对玫瑰茄多糖得率影响的响应面和等高线
Figure 7. Response surface and contour plot showing interactive effect of extraction time and microwave power on polysaccharides yield from H. sabdariffa
表 1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of RAS test
水平 A液料比/(mL:g) B提取时间/min C微波功率/W -1 15:1 10 100 0 20:1 15 150 1 25:1 20 200 
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表 2 Box-Behnken设计方案及试验结果
Table 2 Box-Behnken design and results
试验号 液料比/(mL:g) 提取时间/min 微波功率/W 多糖得率/% 1 -1 -1 0 2.16 2 1 -1 0 0.87 3 -1 1 0 1.02 4 1 1 0 1.56 5 -1 0 -1 1.99 6 1 0 -1 1.34 7 -1 0 1 1.94 8 1 0 1 1.53 9 0 -1 -1 1.63 10 0 1 -1 0.96 11 0 -1 1 1.44 12 0 1 1 1.50 13 0 0 0 3.46 14 0 0 0 3.61 15 0 0 0 3.44 16 0 0 0 3.46 17 0 0 0 3.52
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表 3 回归方程的方差分析
Table 3 Analysis of variance on regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Pr > F 显著性 模型 15.98 9 1.78 310.64 < 0.0001 *** A 0.41 1 0.41 71.66 < 0.0001 *** B 0.14 1 0.14 24.58 0.0016 ** C 0.030 1 0.030 5.25 0.0557 AB 0.84 1 0.84 146.50 < 0.0001 *** AC 0.014 1 0.014 2.52 0.1565 BC 0.13 1 0.13 23.31 0.0019 ** A2 3.33 1 3.33 582.27 < 0.0001 *** B2 6.13 1 6.13 1072.44 < 0.0001 *** C2 3.48 1 3.48 608.76 < 0.0001 *** 残差 0.040 7 5.715×10-3 失拟项 0.021 3 6.908×10-3 1.43 0.3576 纯误差 0.019 4 4.820×10-3 所有项 16.02 16 注：A为液料比，B为提取时间，C为微波功率。***为差异极显著(P < 0.001)，**为差异高度显著(P < 0.01)*为差异显著(P < 0.05)。
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表 4 不同提取方法对玫瑰茄多糖得率的影响
Table 4 Effect of extraction methods on polysaccharides yield from H. sabdariffa
方法 提取时间/min 多糖得率/% 水浴浸提 240 1.80 微波提取 20 2.04 超声波提取 30 2.58 超声波-微波协同提取 15 3.51
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