Effects of Exogenous Melatonin on Cold Resistance of Green Pepper Seedlings
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摘要:目的 明确外源褪黑素(Melatonin,MT)对提高青椒幼苗耐冷性的生理机制和适宜喷施浓度。方法 以布兰妮青椒幼苗为试验材料,采用基质盆栽种植,研究全株喷施不同浓度外源MT(0、25、50、75、100 µmol·L−1)对4 ℃低温胁迫下青椒幼苗生长、抗氧化酶活性、渗透调节物质、光合特性的影响。结果 与4 ℃低温胁迫不喷施外源MT相比(CK),喷施外源MT能增强青椒幼苗叶片过氧化氢酶(CAT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、脯氨酸(Pro)含量,降低叶片丙二醛(MDA)含量、相对电导率和胞间CO2浓度(Ci),增加净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、最大量子产额(Fv/Fm)、最大光合潜能(Fv/Fo)、电子传输活性(Fm/Fo)及SPAD值含量,在以50 µmol·L−1浓度处理时作用效果最明显,地上部干重、CAT、SOD、MDA、相对电导率、Pn、Ci、SPAD值、Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo呈显著水平,Pro、Tr、Gs呈极显著水平。结论 施加外源MT可以通过提高青椒幼苗抗氧化酶活性、光合速率,降低细胞膜质过氧化并调节渗透物质含量来减轻低温冷害的影响,从而提高青椒幼苗耐冷性,且以50 µmol·L−1浓度进行喷施最佳。Abstract:Objective Physiological mechanism and exogenous melatonin (MT) application to improve cold tolerance of green pepper seedlings were investigated.Method Seedlings of green pepper cultivar, Britney, were planted in matrix pots and sprayed with a MT solution of 0 (CK), 25, 50, 75, or 100 µmol·L−1. Effects on the growth, antioxidant enzyme activity, osmotic regulatory substances, and photosynthetic characteristics of the seedlings under chilling at 4 ℃ were determined.Result Comparing to CK, spraying MT increased the contents of catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), and proline (Pro), as well as the net photosynthetic rate (Pn), transpiration rate (Tr), stomatal conductance (Gs), maximum quantum yield (Fv/Fm), maximum photosynthetic potential (Fv/Fo), electron transport activity (Fm/Fo), leaf SPAD, while decreased malondialdehyde (MDA), relative electrical conductivity, and intercellular CO2 concentration in leaf. At 50 µmol·L−1 level, the MT spray showed the greatest effect in alleviating cold injury on the seedlings. The treatment also allowed the underground dry weight, CAT, SOD, MDA, relative conductivity, Pn, Ci, leaf SPAD, Fv/Fm, Fv/Fo, and Fm/Fo to reach significant heights and Pro, Tr, and Gs at extremely significant levels.Conclusion The exogenous MT spray mitigated injury by chilling temperature and improved cold tolerance of the green pepper seedlings through mechanisms such as a heightened antioxidant enzyme activity and photosynthetic rate as well as suppressed membrane lipid peroxidation and regulated osmotic substances. The optimum MT application on the green peeper plants was determined to be at 50 µmol·L−1.
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Keywords:
- Green pepper /
- seedlings /
- melatonin /
- cold stress /
- physiological mechanism
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0. 引言
【研究意义】青椒(Capsicum annuum L.)又称甜椒、菜椒、灯笼椒、柿子椒,由中南美洲热带地区的辣椒在北美演化而来[1],其果实富含维生素C、类胡萝卜素、酚类化合物、类黄酮等抗氧化剂[2-3]。中国于100多年前引入[4],福建地区年种植青椒面积达7000 hm2以上。青椒对低温(0~4 ℃)非常敏感,超过24 h的低温会造成青椒生长点与嫩叶受伤的现象[5]。近年来极端寒潮天气频发,夜间温度降至4 ℃以下,白天平均温度15 ℃,特别2021年初极端寒潮低温给福建诏安青椒产业稳定发展带来重大不确定性。如何应对青椒低温胁迫一直是椒农们关注的问题。目前预防及缓解低温胁迫的方法有选用抗寒性强的品种[6-7]、加强田间管理[4]、喷施外源物质[8-9],其中喷施外源物质是提高农作物抗逆性的简单、有效、可行的方法之一[10],合理利用外源物质对抵御青椒低温伤害具有重要意义。【前人研究进展】褪黑素(Melatonin,MT)是一种植物激素,具有极强的抗氧化作用,在提高植物抗逆性中具有重要的调控作用[11-13]。研究发现外源MT可以缓解植物受低温胁迫的影响。吴雪霞等[14]发现喷施外源MT可有效增强低温胁迫下茄子幼苗叶片超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、抗坏血酸(Ascorbic acid,ASA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、脯氨酸( Proline,Pro)、可溶性蛋白含量,显著抑制丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、H2O2的积累,从而提高茄子幼苗耐冷性。李贺等[15]发现MT处理可提高低温胁迫下大豆V1期光合速率、抗氧化酶活性,减轻膜脂过氧化反应并调节渗透物质含量,从而增强大豆幼苗耐冷性。朱春权等[16]发现MT处理能通过调控水稻体内抗氧化系统酶活、渗透物质含量、叶绿素含量、植物激素含量和耐冷基因表达提高水稻耐低温胁迫能力。【本研究切入点】MT抵御青椒低温伤害的研究还鲜报道,MT提高青椒幼苗耐冷性的生理机制和适宜喷施浓度有待深入研究。【拟解决的关键问题】以福建当地主栽青椒品种布兰妮为试验材料,设置不同浓度MT对基质盆栽青椒幼苗进行全株喷施,测定青椒幼苗在低温胁迫下生长、抗氧化酶活性、渗透调节物质、光合特性等指标,筛选出MT最适宜的浓度,探讨外源MT对青椒幼苗耐冷性生理机制,为合理利用外源MT抵御青椒低温伤害提供科学依据和参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
青椒品种布兰妮由福建省农业科学院亚热带农业研究所提供,盆土基质购自众耕(厦门)农业科技有限公司,基质pH5.7、有机质44.9%、碱解氮337.6 mg·kg−1、有效磷660.6 mg·kg−1、速效钾8771 mg·kg−1。过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2 试验设计
试验于2022年1月在福建省农业科学院亚热带农业研究所人工智能气候箱进行,采用基质盆栽法。在直径10 cm、高12 cm的栽培盆中装入120 g培养基质。青椒种子经0.05%高锰酸钾消毒20 min,流水冲洗数次,播种1粒于每盆中,覆土1~2 cm,白天28 ℃/12 h,夜间20 ℃/12 h,湿度70%。幼苗生长至6叶平展时,选取长势一致的幼苗进行试验。以喷施等量无菌水为对照(CK),MT浓度为25、50、75、100 µmol·L−1等4个处理,分别全株喷施布兰妮青椒幼苗,喷施程度以叶面均匀布满雾状水滴为宜,每个处理10株,3次重复。连续处理3 d后进行低温胁迫处理(白天15 ℃/14 h,夜间4 ℃/10 h,湿度60%),低温胁迫处理5 d后转移至正常生长条件下(白天25 ℃/12 h,夜间16 ℃/12 h,湿度70%)24 h后采用随机取样法取样。
1.3 测定项目与方法
1.3.1 生物量测定
植株地上部和地下部分别置于烘箱中,105 ℃杀青15 min,后80 ℃烘干至恒重,分析天平测定地上部和地下部干鲜重。每个处理设3次重复。
1.3.2 叶绿素相对含量测定
选取植株展开心叶下第3~4叶,利用SPAD-502Plus便携式叶绿素计测定叶绿素SPAD值,每个处理设 3次重复。
1.3.3 抗氧化酶活性测定
选取植株展开心叶下第3~4叶置于离心管中液氮速冻,过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性分别参照试剂盒方法测定。每个处理设3次重复。
1.3.4 渗透调节物质和膜脂过氧化水平测定
选取植株展开心叶下第3~4叶,脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量参照试剂盒方法测定,相对电导率值用DDS-11C型电导率仪测定。
1.3.5 光合气体交换参数测定
选取植株展开心叶下第3~4叶,使用便携式光合作用仪GFS-3000测定光合气体交换参数:净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2含量(Ci)。测定时间为上午8::00~11:30,测定光强为800 µmol·m−2·s−1,流速为750 µmol·s−1,CO2浓度为400 µmol·mol−1。每个处理设3次重复。
1.3.6 叶绿素荧光参数测定
选取植株展开心叶下第3~4叶,用手持式叶绿素荧光仪(FluorPenFP 110/s)测定叶片叶绿素荧光参数。将叶片表面擦净,测定前将叶片暗适应15 min后测定初始荧光(Fo),再以饱和脉冲光测定最大荧光(Fm)和可变荧光(Fv),并计算光系统II (photosystem II,PSII)的最大量子产额(Fv/Fm)、最大光合潜能(Fv/ Fo)、电子传输活性(Fm/Fo)。测定时间为上午8:00~11:30,最大光强为3000 µmol·m−2·s−1,每个处理设3次重复。
1.4 数据统计与分析
试验数据采用dps7.05软件进行差异显著性分析,采用Microsoft Excel 2007软件进行数据处理和制作图表。
2. 结果与分析
2.1 MT对低温胁迫下青椒幼苗生物量的影响
由表1可知,与CK相比,喷施外源MT对低温胁迫下青椒幼苗地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重、干重根冠比等指标均有所增加,但未达显著水平。50 µmol·L−1MT处理对青椒幼苗各生物量指标均最高,地上部干重显著高于CK,干重根冠比CK高9.1%,说明喷施50 µmol·L−1MT对缓解低温胁迫对青椒幼苗的生长性能的效果较好。
表 1 MT对低温胁迫下青椒幼苗生物量的影响Table 1. Effect of MT spray on biomass of green peppers under chilling at 4 ℃MT浓度
Melatonin concentration/(µmol·L−1)地上部鲜重
Above ground fresh weight/g地上部干重
Above ground dry weight/g地下部鲜重
Under ground fresh weight/g地下部干重
Under ground dry weight/g干重根冠比
root-shoot ratio0(CK) 4.85±0.47 a 0.52±0.02 b 2.14±0.14 a 0.17±0.02 a 0.33±0.05 a 25 4.87±0.22 a 0.53±0.01 b 2.18±0.15 a 0.18±0.02 a 0.34±0.03 a 50 5.03±0.23 a 0.63±0.02 a 2.54±0.39 a 0.23±0.06 a 0.36±0.01 a 75 4.94±0.49 a 0.62±0.06 a 2.50±0.48 a 0.22±0.05 a 0.35±0.06 a 100 4.91±0.17 a 0.58±0.01 ab 2.26±0.07 a 0.20±0.02 a 0.35±0.02 a 同列数据后不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。
The lowercase letters indicate significant differences within the row at the 0.05 probability level.2.2 MT对低温胁迫下青椒幼苗叶片生理特性的影响
由表2可知,与CK相比,喷施不同浓度外源MT增加了低温胁迫下青椒幼苗叶片CAT、SOD活性和Pro含量,呈先升高后下降的趋势,MT还降低了MDA和相对电导率,呈先下降后升高的趋势;50 µmol·L−1MT喷施处理CAT、SOD、MDA和相对电导率达显著水平,Pro达极显著水平,CAT、SOD活性和Pro含量分别为CK的3.3倍、11.7倍和1.4倍,MDA和相对电导率分别比CK降低了37.8%和44.4%,说明喷施50 µmol·L−1MT更有利于保护青椒叶片生理特性稳定。
表 2 MT对低温胁迫下青椒幼苗叶片生理特性的影响Table 2. Effect of MT spray on physiological characteristics of green pepper leaves under chilling at 4 ℃MT浓度
Melatonin
concentration/
(µmol·L−1)CAT
Catalase/
(U·g−1·min−1)SOD
Superoxide dismutase/
(U·g−1)Pro
Proline/
(µg·mL−1)MDA
Malonaldehyde/
(nmol·g−1)相对电导率
Relative
conductivity/%0(CK) 1518.7±20.34 d 15.3±3.47 d 19.2±0.67 b 167.9±3.89 a 27.0±1.18 a 25 2305.2±106.60 c 33.5±3.74 c 19.5±0.49 b 134.1±8.03 b 23.4±0.88 b 50 5021.7±283.33 a 179.7±3.26 a 26.7±0.56a** 104.4±2.61 c 15.0±1.55 c 75 4278.2±436.45 b 68.6±7.65 b 21.4±0.99 b 117.2±3.81 c 22.0±0.75 b 100 1728.9±55.50 cd 32.3±3.27 c 19.6±1.16 b 138.3±9.20 b 24.7±1.83 ab 小写字母表示在P<0.05水平差异显著;**表示在P<0.01水平差异极显著。下同
The lower case letters indicate significant differences within the row at the 0.05 probability level; Double asterisks (**) indicate highly significant differences within the row at the 0.01 probability level. Same as below2.3 MT对低温胁迫下青椒幼苗叶片光合作用的影响
由图1可知,低温胁迫条件下,喷施不同浓度外源MT青椒幼苗叶片Pn、Tr和Gs均高于CK,且在50 µmol·L−1处理下,叶片Pn、Tr和Gs均达到最大值,分别为CK的3.73倍、2.57倍、1.90倍,与CK相比Pn呈显著水平,Tr、Gs呈极显著水平。同时,各处理Ci低于CK,胞间CO2的固定和转化效率提高,使得细胞间隙中CO2浓度均降低,并以50 µmol·L−1 MT处理固定和转化胞间CO2效率最高。结果说明喷施50 µmol·L−1 MT更有利于保护低温胁迫下青椒叶片光合系统。
图 1 褪黑素对低温胁迫下青椒幼苗叶片光合作用的影响不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著;不同大写字母表示在P<0.01水平差异极显著。Figure 1. Effect of MT spray on photosynthesis of green pepper leaves under chilling at 4 ℃The different lowercase letters indicate significant differences within the row at the 0.05 probability level; the different capital letters indicate highly significant differences within the row at the 0.01 probability level.2.4 MT对低温胁迫下青椒幼苗叶绿素含量及其荧光参数影响
叶绿素含量是一种判断植物生活活力的重要指标,而叶绿素荧光是一种用来研究植物的光合作用的非损伤探针[17]。由图2和表3可知,与CK相比,喷施外源MT增加了低温胁迫下青椒幼苗叶片SPAD值、最大量子产额Fv/Fm、最大光合潜能Fv/Fo、电子传输活性Fm/Fo,且喷施50 µmol·L−1MT青椒幼苗叶片SPAD值、Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo与CK呈显著差异,分别比CK高15.2%、5.4%、25.8%和14.5%。结果说明喷施50 µmol·L−1 MT对低温胁迫下青椒幼苗促进效果最明显。
表 3 褪黑素对低温胁迫下青椒幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响Table 3. Effect of MT spray on chlorophyll fluorescence parameters of green pepper leaves under chilling at 4 ℃MT浓度
Melatonin
concentration/
(µmol·L−1)最大量子产额Fv/Fm
Maximum
quantum
yield最大光合潜能Fv/Fo
Maximum
light and
potential电子传输活性Fm/Fo
Electron
transport
activityCK 0.56±0.02 b 1.28±0.11 b 2.28±0.11 b 25 0.57±0.02 b 1.30±0.09 b 2.30±0.09 b 50 0.62±0.01 a 1.61±0.05 a 2.61±0.05 a 75 0.59±0.01 ab 1.39±0.01 b 2.35±0.02 b 100 0.57±0.02 b 1.30±0.11 b 2.30±0.11 b 3. 讨论与结论
低温胁迫会抑制青椒生长发育和光合作用[18-19],导致落叶、落花和落果,造成不可逆的伤害,给生产造成不可挽救的损失。本研究结果表明,不同浓度外源MT处理有效缓解了低温对于青椒幼苗生长的抑制作用,其中以50 µmol·L−1MT处理的缓解效果最好,这与和秋兰等[20]在外源MT对低温胁迫下马铃薯幼苗缓解作用中得出的结论一致。Shaheen等[21]认为逆境胁迫影响植物地上部分和地下部分的生物量,反映植物对逆境因子的需求和竞争能力。MT参与调控植物根部发育,Chen等[22]发现100 µmol·L−1MT对芥菜幼苗根部生长具有促进作用,植物根冠比大小也反映了植物地下部分与地上部分的相关性。本试验中喷施不同浓度MT能促进低温胁迫下青椒幼苗地下部分根系生长,进而促进地上部分茎、叶生长量,从而增大根冠比,其中以50 µmol·L−1MT处理效果较好。
SOD是氧自由基清除剂,CAT具有清除H2O2毒害作用[23];Pro能够维持细胞的渗透压,增强细胞对低温的抵抗能力[24];逆境条件下植物产生的MDA含量高,说明植物细胞膜质过氧化程度高,细胞膜受到的伤害严重[25];低温胁迫引起细胞膜半透性丧失,电解质外渗,相对电导率变高[26]。MT可提高植物的抗氧化能力,降低逆境引发的氧化胁迫对植物生长发育的影响[27]。本研究喷施不同浓度MT引起青椒幼苗叶片抗氧化酶(CAT、SOD)活性、渗透调节物质(Pro)含量增加,膜脂过氧化产物(MDA)、相对电导率降低,CAT、SOD活性和Pro含量随着MT的浓度增加呈先上升后下降趋势,MDA和相对电导率呈先下降后上升趋势,说明外源MT能够激活青椒叶片的抗氧化系统、维持细胞渗透压、减少细胞膜质过氧化,进而保护青椒生物量不受低温胁迫的影响。Bawa等[28]研究表明,外源MT可增强低温胁迫下大豆幼苗CAT、SOD活性和Pro含量,减少MDA的积累,提高大豆幼苗的耐低温能力,与本研究结果一致。
光合作用是植物生长发育的基础[29],低温胁迫会影响植物的叶绿素含量和光合功能。光合气体交换参数Pn、Tr、Gs、Ci反映光合作用的表观性,而叶绿素荧光参数Fo、Fm、Fv、Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo更能反映光合作用的内在变化[30]。Su等[31]研究发现低温胁迫引起葡萄叶片PSII的损伤,降低电子传输活性,Marta等[32]研究报道了MT可以减轻低温胁迫下黄瓜的光合损伤。本试验中,外源MT提高了低温胁迫下青椒叶片SPAD值、光合速率和PSII的Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo,说明MT可以降低叶片PSII的损伤,对光合系统起到一定的保护作用。本研究中以50 µmol·L−1MT提高青椒幼苗光合作用最强,这与Zhang等[33]在研究发现外源MT降低逆境胁迫对大豆光合作用的抑制的结果一致。此外,低温胁迫下喷施不同浓度MT青椒叶片Ci随MT浓度的增加呈先降后升的趋势,胞间CO2的固定和转化效率以50 µmol·L−1MT处理最强,使叶片细胞间隙中CO2浓度降低。
低温胁迫下不同作物在不同浓度MT的作用下效果存在差异。张立业等[34]发现在低温胁迫下喷施150 μmol·L−1 MT可更有效地提高红树莓耐冷能力,尉欣荣等[35]发现叶面喷施100 μmol·L−1 MT可显著缓解低温对黑麦草幼苗的生长抑制。在本试验中,外源MT可以有效缓解青椒幼苗低温伤害,且以50 µmol·L−1 MT处理效果最好,为合理利用和推广外源MT抵御青椒低温伤害提供了科学依据和参考。
综上,与低温胁迫不喷施MT相比,喷施MT处理能增强低温胁迫下青椒幼苗叶片CAT、SOD活性和Pro含量,降低叶片MDA含量、相对电导率和Ci,增加Pn、Tr、Gs、Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo及SPAD值含量,在以50 µmol·L−1浓度处理时作用效果最明显,地上部干重、CAT、SOD、MDA、相对电导率、Pn、Ci、SPAD值、Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo呈显著水平,Pro、Tr、Gs呈极显著水平。外源MT提高了青椒幼苗抗氧化酶活性、光合速率,减轻细胞膜质过氧化并调节渗透物质含量,缓解低温胁迫伤害,从而提高了青椒幼苗耐冷能力。
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图 1 褪黑素对低温胁迫下青椒幼苗叶片光合作用的影响
不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著;不同大写字母表示在P<0.01水平差异极显著。
Figure 1. Effect of MT spray on photosynthesis of green pepper leaves under chilling at 4 ℃
The different lowercase letters indicate significant differences within the row at the 0.05 probability level; the different capital letters indicate highly significant differences within the row at the 0.01 probability level.
表 1 MT对低温胁迫下青椒幼苗生物量的影响
Table 1 Effect of MT spray on biomass of green peppers under chilling at 4 ℃
MT浓度
Melatonin concentration/(µmol·L−1)地上部鲜重
Above ground fresh weight/g地上部干重
Above ground dry weight/g地下部鲜重
Under ground fresh weight/g地下部干重
Under ground dry weight/g干重根冠比
root-shoot ratio0(CK) 4.85±0.47 a 0.52±0.02 b 2.14±0.14 a 0.17±0.02 a 0.33±0.05 a 25 4.87±0.22 a 0.53±0.01 b 2.18±0.15 a 0.18±0.02 a 0.34±0.03 a 50 5.03±0.23 a 0.63±0.02 a 2.54±0.39 a 0.23±0.06 a 0.36±0.01 a 75 4.94±0.49 a 0.62±0.06 a 2.50±0.48 a 0.22±0.05 a 0.35±0.06 a 100 4.91±0.17 a 0.58±0.01 ab 2.26±0.07 a 0.20±0.02 a 0.35±0.02 a 同列数据后不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。
The lowercase letters indicate significant differences within the row at the 0.05 probability level.表 2 MT对低温胁迫下青椒幼苗叶片生理特性的影响
Table 2 Effect of MT spray on physiological characteristics of green pepper leaves under chilling at 4 ℃
MT浓度
Melatonin
concentration/
(µmol·L−1)CAT
Catalase/
(U·g−1·min−1)SOD
Superoxide dismutase/
(U·g−1)Pro
Proline/
(µg·mL−1)MDA
Malonaldehyde/
(nmol·g−1)相对电导率
Relative
conductivity/%0(CK) 1518.7±20.34 d 15.3±3.47 d 19.2±0.67 b 167.9±3.89 a 27.0±1.18 a 25 2305.2±106.60 c 33.5±3.74 c 19.5±0.49 b 134.1±8.03 b 23.4±0.88 b 50 5021.7±283.33 a 179.7±3.26 a 26.7±0.56a** 104.4±2.61 c 15.0±1.55 c 75 4278.2±436.45 b 68.6±7.65 b 21.4±0.99 b 117.2±3.81 c 22.0±0.75 b 100 1728.9±55.50 cd 32.3±3.27 c 19.6±1.16 b 138.3±9.20 b 24.7±1.83 ab 小写字母表示在P<0.05水平差异显著;**表示在P<0.01水平差异极显著。下同
The lower case letters indicate significant differences within the row at the 0.05 probability level; Double asterisks (**) indicate highly significant differences within the row at the 0.01 probability level. Same as below表 3 褪黑素对低温胁迫下青椒幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响
Table 3 Effect of MT spray on chlorophyll fluorescence parameters of green pepper leaves under chilling at 4 ℃
MT浓度
Melatonin
concentration/
(µmol·L−1)最大量子产额Fv/Fm
Maximum
quantum
yield最大光合潜能Fv/Fo
Maximum
light and
potential电子传输活性Fm/Fo
Electron
transport
activityCK 0.56±0.02 b 1.28±0.11 b 2.28±0.11 b 25 0.57±0.02 b 1.30±0.09 b 2.30±0.09 b 50 0.62±0.01 a 1.61±0.05 a 2.61±0.05 a 75 0.59±0.01 ab 1.39±0.01 b 2.35±0.02 b 100 0.57±0.02 b 1.30±0.11 b 2.30±0.11 b -
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