Molecular Mechanism of traf6 like Gene in Innate Immunity of Procambarus clarkii
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摘要:目的 深入研究克氏原螯虾（Procambarus clarkia）traf6 like基因参与先天免疫调节的功能。方法 以Pc-traf6 like基因为研究对象，利用RNAi技术干扰目的基因表达量之后，进行细菌模拟刺激，并且通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测细胞凋亡相关基因表达量的变化情况。结果 干扰Pc-traf6 like基因，通过干扰效果检测，显示48 h时干扰效果良好，可用于后续试验。在目的基因干扰后，进行金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激，检测表明促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl 2、细胞凋亡关键基因Caspase 3不同程度上调表达；在目的基因干扰后，进行鲶爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri ）刺激，检测表明促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl 2、细胞凋亡关键基因Caspase 3不同程度上调表达。结论 Pc-traf6 like基因被干扰，机体在受到金黄色葡萄球菌及鲶爱德华氏菌刺激后，Bax、Bcl 2和Caspase 3基因的相对表达量上调，推测Pc-traf6 like基因通过调控细胞凋亡参与了先天免疫反应。Abstract:Objective Role of traf6 like gene in innate immunity regulation of Procambarus clarkia(Pc-traf6 like) was investigated.Methods RNAi technology was employed to interfere the expression of Pc-traf6 like gene. Bacterial simulation was performed to determine the changes of apoptosis-related gene expression by real-time quantitative PCR (qRT-PCR).Result The interference on the gene was effective after 48 h for the subsequent experiments. The interference-induced pro-apoptotic gene Bax, anti-apoptotic gene Bcl 2, and apoptotic protease Caspase 3 were upregulated in varying degrees with the stimulation of Staphylococcus aureus or Edwardsiella ictaluri.Conclusion After the Pc-traf6 like gene was effectively interfered, the relative expressions of Bax, Bcl 2, and
Caspase 3 were upregulated after the P. clarkia was stimulated by either S. aureus or E. ictaluri indicating an involvement of Pc-traf6 like gene in the innate immune response by the regulating apoptosis. -
Keywords:
- Procambarus clarkii /
- RNA interference /
- apoptosis /
- innate immunity
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0. 引言
【研究意义】克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗称淡水小龙虾，因其肉质鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱。小龙虾是我国重要的水产养殖种类，但是近年来由于多种细菌性病害的出现，给小龙虾的养殖业带来了巨大的经济损失，研究克氏原螯虾的免疫学防病抗病机制具有重要意义[1]。在无脊椎动物中，先天免疫是对抗病原微生物侵染的关键[2-3]，选择先天免疫相关的基因进行研究具有重要的理论指导意义。【前人研究进展】近年来，肿瘤坏死因子受体相关因子6（traf6）被广泛研究。Li等[4]于2021年获得克氏原螯虾的traf6 like基因的全长cDNA序列，并进行抗细菌先天免疫的研究。Wang等[5]研究结果显示，凡纳滨对虾Traf6基因对溶藻弧菌和白斑综合征病毒的感染有应答，且可以激活抗菌肽基因从而参与先天免疫反应。Lin等[6]提出香港牡蛎的traf6同源物可以抑制p53的活性，并抑制凋亡过程，参与了先天免疫和适应性免疫。Szymon[7]的研究结果显示，细胞凋亡在免疫机制中发挥重要作用。细胞凋亡是在动物中发现的一种程序性细胞死亡，在1972年首次被描述[8]。因凋亡的形态学和生化特征，故人们很容易将其与其他类型的细胞死亡区分开来。当细胞凋亡开始时，会出现膜通透性转变，其特征是线粒体内部跨膜电位的破坏[9]。和四梅等[10]通过对Caspase细胞凋亡通路进行研究，详细介绍了水生无脊椎动物的细胞凋亡通路。Arlette等[11]对Bcl 2凋亡家族的基因进行研究，详细说明各基因发挥的作用。【本研究切入点】然而在克氏原螯虾中，traf6 like基因是如何通过调控细胞凋亡来参与抗细菌先天免疫反应的研究尚有待深入探讨。【拟解决的关键问题】通过对克氏原螯虾traf6 like基因（Pc-traf6 like）干扰后，进行细胞凋亡相关基因的检测，初步研究Pc-traf6 like参与抗细菌先天免疫的分子机制，为进一步研究无脊椎动物抗细菌先天免疫提供理论参考，同时也为提高克氏原螯虾抗病能力的相关研究提供理论与技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
健康克氏原螯虾（每只20～25 g），购于包头市友谊海鲜市场瑞福祥水产门店，原产地为江苏省淮安市盱眙县。试验所用克氏原螯虾在实验室进行为期一周的预养，淘汰不健康克氏原螯虾；在正式试验前，对小龙虾进行了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）及鲶爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）的病原检测。
1.2 试验方法
1.2.1 PCR扩增目的基因干扰片段
将含有Pc-traf6 like目的基因的大肠杆菌提前接菌活化，进行PCR扩增干扰片段。根据前期转录组测序得到的序列，设计目的基因的干扰引物Pc-traf6 like-F（5′-gcgtaatacgactcactataggaggagcaccttcagagta-3′）和Pc-traf6 like-R（5′-gcgtaatacgactcactataggcaacgcattcgtagttgt-3′）。PCR反应程序如下：预变性94 ℃，5 min；变性，94 ℃，30 s（35 cycle）；退火55 ℃，45 s（35 cycle）；延伸72 ℃，40 s（35 cycle）；后延伸72 ℃，10 min。
使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（索莱宝生物科技有限公司），将上述含有PCR产物的琼脂糖凝胶进行胶回收，回收得到的DNA模板−40 ℃保存。
1.2.2 体外转录
使用In vitro Transcription T7 Kit试剂盒（宝生物有限责任公司），将上述DNA进行体外转录，制备Pc-traf6 like双链RNA，置于−80 ℃保存备用。
1.2.3 RNA干扰
按照上述方法准备Pc-traf6 like双链RNA和GFP（绿色荧光蛋白）双链RNA，使用无菌1×PBS缓冲液分别将金黄色葡萄球菌和鲶爱德华氏菌进行稀释。试验分为4组：GFP干扰组、Pc-traf6 like干扰组、GFP干扰+细菌刺激组、Pc-traf6 like干扰+细菌刺激组，每尾虾于血窦处注射双链RNA，注射量为20～25 μL（3000 ng·μL−1），于第二腹节处分别注射2种细菌，注射量为100 μL（2×107 CFU），并在0、2、6、12、24、48 h解剖小龙虾，取血淋巴、肝胰腺等组织，每个时间点取3尾虾。
取上述肝胰腺样品50～80 mg置于无菌玻璃匀浆器中，分别加入于4 ℃保存的TRIzol试剂，进行冰浴匀浆，提取总RNA，并使用NANO Drop 2000仪器进行浓度检测，提取总RNA置于−80 ℃保存。
使用逆转录试剂盒，将上述提取的总RNA进行逆转录，得到cDNA，并使用NANO Drop 2000仪器进行浓度检测，合成的cDNA置于−80 ℃保存。
1.2.4 实时荧光定量PCR检测
利用荧光定量PCR进行干扰效果、干扰及细菌刺激后的相关基因表达模式的检测。目的基因特异性引物为Pc-traf6 like-RT-F（5′-gcatctgggacccgactc-3′）和Pc-traf6 like-RT-R（5′-ctactaccaccaccgaatc-3′），18S内参基因特异性引物为18S rRNA-RT-F（5′-tcttcttagagggattagcgc-3′）和18S rRNA-RT-R（5′-aaggggattgaacgggtta-3′）。PCR反应程序如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s（40 cycle）；60 ℃，34 s（40 cycle）；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。设3次生物学重复，采用2−ΔΔCT算法计算相对表达量并进行数据统计分析。
2. 结果与分析
2.1 Pc-traf6 like双链PCR扩增
将制备得到的Pc-traf6 like双链RNA进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果显示：在250～500 bp处有明亮条带，与理论值449 bp相符合（图1）。
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图 1 Pc-traf6 like基因双链RNA电泳M：标准DNA Marker；1～2：目的基因双链RNA条带。Figure 1. Electrophoresis on double-stranded RNA validation of Pc-traf6 like geneM: standard DNA marker; 1–2: target gene double-stranded RNA bands.2.2 RNA干扰效果检测
利用实时荧光定量PCR进行RNA干扰效果检测，结果显示，在干扰后48 h时，干扰率约为28%，表明目的基因Pc-traf6 like干扰效果良好，制备的Pc-traf6 like双链RNA可用于后续试验（图2）。
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图 2 Pc-traf6 like基因双链RNA干扰效果检测Figure 2. Detection of interference on double-stranded RNA of Pc-traf6 like gene2.3 金黄色葡萄球菌刺激后细胞凋亡相关基因检测
利用实时荧光定量PCR进行细胞凋亡相关基因的检测，结果显示，干扰Pc-traf6 like基因后，利用金黄色葡萄球菌进行刺激，检测Bax（图3-A）、Bcl 2（图3-B）、Caspase 3（图3-C）基因的表达情况。结果显示，与对照组相比，Bax、Bcl 2、Caspase 3基因表达分别呈现上调趋势；不同时间点之间，Bax基因表达整体呈升高趋势，12 h表达量最高；Bcl 2基因表达整体呈升高趋势，2 h表达量最高；Caspase 3基因表达整体呈升高趋势，6 h及48 h表达量较高。
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2.4 鲶爱德华氏菌刺激后细胞凋亡相关基因检测
利用实时荧光定量PCR进行细胞凋亡相关基因的检测，干扰Pc-traf6 like基因后，利用鲶爱德华氏菌进行刺激，检测Bax（图4-A）、Bcl 2（图4-B）、Caspase 3（图4-C）基因的表达情况。结果显示，与对照组相比，Bax、Bcl 2、Caspase 3基因表达分别呈现上调趋势；不同时间点之间，Bax基因表达整体呈升高趋势，12 h表达量最高；Bcl 2基因表达整体呈升高趋势，2 h表达量最高；Caspase 3基因表达整体呈升高趋势，6 h及48 h表达量较高。
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图 4 鲶爱德华氏菌刺激后细胞凋亡相关基因的表达模式Figure 4. Expressions of apoptosis-related genes after E. ictaluri stimulation3. 讨论
肿瘤坏死因子受体相关因子6（traf6）是E3泛素连接酶，参与先天免疫反应和适应性免疫反应，并调节凋亡过程[12-14]，近年来被广泛研究。2011年，Wang等[5]在研究中得到凡纳滨对虾（Litopenaeus Vannamei）traf6（Lv-traf6）的全长cDNA序列，并推测该基因可能通过调节AMP基因表达在抗菌和抗病毒反应中发挥重要作用。同样，在本研究中发现了克氏原螯虾traf6 like基因在抗细菌先天免疫中发挥重要作用。2009年，Qiu等[15]在栉孔扇贝（Chlamys Farreri）中发现了traf6基因（Cf-traf6），通过肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）处理后，Cf-traf6在1.5～3 h mRNA的表达水平下调，后恢复到原有水平，表明Cf-traf6可能参与了扇贝的信号转导和免疫应答。2020年，Lin等[6]通过RNAi等试验，发现traf6的同源物能抑制香港牡蛎（Crassostrea Hongkongensis）中的p53活性，Ch-traf6在上游通过激活Pellino抑制血细胞凋亡，在细胞凋亡过程发挥作用。本研究中，通过使用RNAi技术对克氏原螯虾traf6 like基因进行沉默，发现该基因通过调控细胞凋亡从而参与了抗细菌免疫应答。2017年，Fan等[16]通过对长牡蛎（Crassostrea gigas）中的traf6基因进行干扰，结果表明Cg-traf6可能参与了抵御细菌和病毒的先天免疫防御系统。同样，在本研究中发现克氏原螯虾traf6 like基因参与了抗细菌先天免疫反应。
本研究采用RNA干扰目的基因的方法开展研究，通过检测细胞凋亡相关基因，研究先天免疫防御反应。Ayllón等[17]通过RNA干扰的方法，将Bcl 2和凋亡抑制蛋白IAP的dsRNA注射到肩突硬蜱中，发现会严重影响蜱的饱血率和吸血体重，其中注射Bcl 2分子dsRNA的蜱几乎不能完成吸血过程直至死亡，推测Bcl 2分子在蜱内源性细胞凋亡中可能起到关键作用。在本研究中，干扰目的基因后，Bcl 2基因表达量有相应的变化，推测Bcl 2在小龙虾抗细菌先天免疫中发挥作用。目前，在贝类、甲壳类、文昌鱼和水螅等物种中均有文献报道肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）和caspase的表达情况，主要对免疫过程中细胞凋亡的作用和肿瘤坏死因子受体（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）、Caspase等表达情况进行分析[18-19]。Chang等[20]的研究结果显示凋亡敏感基因（Sensitive to apoptosis gene，SAG）的下调表达会导致促凋亡蛋白Bax增多，使线粒体中Bax/Bcl 2失衡，诱导Caspase 9和Caspase 3激活，从而促进细胞发生凋亡。本试验通过对Pc-traf6 like基因进行RNA干扰后进行细菌刺激（金黄色葡萄球菌、鲶爱德华氏菌），进行实时荧光定量PCR检测，结果显示促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl 2均上调表达，下游细胞凋亡关键基因Caspase 3上调表达，引起细胞凋亡，从而调控免疫应答。曾高淳等[21]研究表明，Bax和Bcl 2基因同属于Bcl-2家族分子，细胞凋亡取决于Bcl-2家族分子中促凋亡/抗凋亡力量组合的天平倾向。本研究中，促凋亡基因Bax上调程度高于抗凋亡基因Bcl 2，诱导Caspase 3激活，最终引起细胞凋亡。
本研究为后续Pc-traf6 like基因的重组表达、蛋白功能及其他研究提供了一定的理论依据，为小龙虾通过调控细胞凋亡参与先天免疫机制的进一步研究奠定基础。随着深入研究，无脊椎动物先天免疫系统逐渐被完善，小龙虾Pc-traf6 like基因在其抗细菌先天免疫反应的信号通路中发挥了重要作用，继续深入研究该基因对完善理论基础具有重要意义，同时可以制定合理有效的方案以减少细菌性疾病对虾类等水产动物的危害，为水产养殖业带来经济价值。
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图 1 Pc-traf6 like基因双链RNA电泳
M：标准DNA Marker；1～2：目的基因双链RNA条带。
Figure 1. Electrophoresis on double-stranded RNA validation of Pc-traf6 like gene
M: standard DNA marker; 1–2: target gene double-stranded RNA bands.
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图 2 Pc-traf6 like基因双链RNA干扰效果检测
18S RNA作为内参对照。不同字母表示不同时间点同一处理组差异显著（P＜0.05）；*、**表示同一时间点不同处理组之间差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）。图3、4同。
Figure 2. Detection of interference on double-stranded RNA of Pc-traf6 like gene
18S RNA was used as inner control; data with different letters indicate significant difference in same group at times (P＜0.05); * or ** indicates significant difference between treatment groups at 0.05 or 0.01 level. Same for Figs. 3 and 4.
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期刊类型引用(1)
1. 梁子莹，邱丽华，王鹏飞，张博，闫路路，乔秀亭，赵超. 斑节对虾新型抗菌肽ALF-like基因克隆表达及其抗菌功能分析. 南方农业学报. 2023(09): 2654-2664 . 
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