0.   引言

【研究意义】环糊精是生物酶催化淀粉等相关基质经环化形成的环状寡聚糖，由6个以上葡萄糖通过α-1，4-糖苷键联结而成，通常由6、7、8个D-吡喃葡萄糖单元构成，称为α-、β-、γ-环糊精。由于环糊精分子具有特殊的外表亲水、内里疏水的中空圆筒结构，能与许多客体分子形成包络物，进而改变客体分子的溶解度、稳定性等物理化学性质，在农药、食品、医药、化妆品和环保等领域具有广泛的应用^[1]。环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase, 简称CGTase)是生产环糊精的重要工业用酶，鉴于环糊精的巨大应用价值，生产环糊精所必需的CGTase的制备成为了当今研究的热点。环糊精酶催化产物通常包含α-、β-、γ-环糊精3种环糊精，根据主要产物的不同，将环糊精酶分类为α-、β-、γ-环糊精酶。总结现有的报道，环糊精酶的获取方式大致归纳为3种：从自然界中筛选野生菌株；根据基因文库进行克隆表达；对已知目的基因片段进行蛋白质工程改良。其中野生菌株筛选不仅最为直接有效，而且也是后两种方式的基础^[2]。有关CGT酶的研究已经跨越了一个世纪，人们对环糊精酶也逐步提出了更高的要求：更高的产物专一性、更高的热稳定性、更稳定的耐碱性，甚至更强的抗有机试剂性能。【前人研究进展】为了降低环糊精生产成本，提高CGTase的产量和催化特性, 将CGTase基因采用基因工程方法进行异源表达被认为是最有效的途径之一。目前常见的基因表达系统主要有大肠杆菌、芽胞杆菌及酵母表达系统。其中大肠杆菌表达环糊精酶多有报道^[3-5]，酵母表达系统报道较少^[6-7]，并且效果不甚理想。而枯草芽胞杆菌表达系统，与其他表达系统相比具有明显的优势：首先，相对于大肠杆菌表达系统：枯草芽胞杆菌为非致病性、细胞壁组成简单、重组表达的蛋白内毒素低、较低密码子偏爱性、表达蛋白可溶性高、生物活性好^[8-9]。其次，相对于真核表达系统，其表达周期短，成本低，表达量较高。【本研究切入点】本课题组在前期工作中从Gebacillius sp.CHB1中分离获得了1种α-环糊精酶，该酶最适反应温度达到65℃，有较好的热稳定性，应用潜力巨大，并且该CGT基因在大肠杆菌 E. coli及毕赤酵母中成功克隆表达^[10-12]。大肠杆菌表达量虽高，但易形成包涵体，对环糊精酶的分离造成困难，而毕赤酵母表达量较低。【拟解决的关键问题】本研究尝试选用枯草芽胞杆菌分泌表达系统表达嗜热芽胞杆菌CHB1 α-CGTase，以期实现α-CGTase的安全高效表达，并对该工程菌的发酵温度、pH和培养基等进行优化，为环糊精酶工程菌株的规模化生产奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   菌种和质粒

嗜热芽孢杆菌Gebacillius sp.CHB1(含新型环糊精酶基因)、大肠杆菌Escherichia coli JM109为福建省农业科学院土壤肥料研究所保存；枯草芽胞杆菌B. subtilis strain RIK1285、大肠杆菌E. coli穿梭载体pBE-S DNA购自大连宝生物工程(TaKaRa)公司。

1.2   试剂与仪器

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA Mark、T₄DNA连接酶及B. subtilis strain RIK1285感受态细胞购自TaKaRa公司；DNA切胶回收试剂盒、PCR引物及质粒快速提取试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。3-18K超高速冷冻离心机购自Sigma公司，PCR仪购自基因有限公司，Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3   培养基

LB培养基，Amp终浓度100 μg·mL^-1。TSB(胰蛋白胨大豆肉汤培养基)：胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%。M9：葡萄糖1%，维生素B1(单独灭菌) 1 μg·mL^-1，Na₂HPO₄ 1.28%，KH₂PO₄ 0.3%, NaCl 0.05%，NH₄Cl 0.5%。TB：甘油0.5%，蛋白胨1.2%，酵母粉2.4%，K₂HPO₄ 1.64%，KH₂PO₄ 0.23%。

1.4   α-环糊精酶基因引物设计与扩增

提取嗜热芽胞杆菌Gebacillius sp. CHB1基因组DNA, 并以此为模板，在α-环糊精酶基因上下游分别添加限制性酶切位点(Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ)，设计上下游引物如下：

CGT-F：5′-CCG CTC GAGA ATA AGG TAA ATT TTA CAT CG-3′(下划线为Xho Ⅰ限制性酶切位点)；CGT-R：5′-CCG GAA TTC GTT TTG CCA ATT CAC TAT AAT-3′(下划线为EcoR Ⅰ限制性酶切位点)；用PCR扩增试剂盒进行α-CGT酶基因扩增。PCR反应条件：94℃ 4 min；94℃ 60 s，58℃ 45 s，72℃ 2 min，循环30次；72℃ 10 min。DNA切胶回收试剂盒进行CGT片段回收，备用。

1.5   重组表达质粒pBE-CGT的构建及鉴定

用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ分别对pBE载体及CGT片段进行双酶切，胶回收CGT基因片段及pBE线性载体；参照TaKaRa公司T4 DNA连接酶使用说明书，将CGT基因片段与pBES线性载体混合，进行连接反应，连接产物转化感受态细胞JM109，经100 μg·mL^-1氨苄青霉素抗性LB平板及菌落PCR鉴定，构建重组枯草芽胞-大肠杆菌穿梭表达质粒pBE-CGT；同时提取相应质粒送至上海生工生物工程有限公司测序验证。

1.6   重组芽胞杆菌的构建及筛选

采用电转化方法，冰浴融化感受态细胞枯草芽胞杆菌B. subtilis strain RIK1285，与3 μL重组表达质粒pBE-CGT混匀，设置电转化参数(电击参数1 500 V、25 μF、200 Ω)，将pBE-CGT载体导入感受态B. subtilis strain RIK1285中，于100 μg·mL^-1氨苄青霉素抗性LB平板培养至转化子出现(24~48 h)，挑取若干克隆子进行PCR验证，获得重组枯草芽胞杆菌重组B. subtilis RIK1285/pBE-CGT。

1.7   枯草芽胞杆菌的发酵培养

种子液培养：挑取重组枯草芽胞杆菌B. subtilis单克隆于LB培养基生长18 h；

发酵培养：按1%接种量将种子发酵液接种至50 mL发酵培养基，在37℃摇床培养36 h，每隔一段时间取样，将发酵液于12 000 r·min^-1离心2 min除菌体，收集上清液，测定α-环糊精酶活性。

1.8   重组枯草杆菌表达外源蛋白条件优化

1.8.1   培养时间对产酶的影响

为考察重组枯草芽胞杆菌发酵不同阶段α-环糊精酶活性变化，在温度37℃、pH7.0条件下，进行工程菌产酶培养，每隔4 h进行取样测定OD₆₀₀和环糊精酶活力，发酵持续32 h。

1.8.2   培养温度对产酶的影响

为考察不同温度对重组枯草芽胞杆菌产环糊精酶能力的影响，在pH7.0条件下分别采用25℃、30℃、37℃、40℃培养，24 h后测定OD₆₀₀和环糊精酶活力。

1.8.3   初始pH对产酶的影响

为考察不同初始pH对重组枯草芽胞杆菌产环糊精酶能力的影响，在温度37℃下，调整初始发酵pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，经过发酵24 h后，测定OD₆₀₀和环糊精酶活力，考察初始pH对环糊精酶表达量的影响。

1.8.4   初始培养基对产酶的影响

为考察不同初始培养基对重组枯草芽胞杆菌重组B. subtilis RIK1285/pBE-CGT产环糊精酶能力的影响，在温度37℃、pH6.5条件下，分别对常用芽胞杆菌培养基(LB，TSB，M9，TB)，进行发酵培养24 h，筛选最适培养基。

1.9   CGTase酶活性测定

测定α-环糊精葡萄糖基转移酶活力的方法参照甲基橙褪色法^[13]，具体操作如下：取0.9 mL预先用50 mmol·L^-1磷酸钠缓冲液(pH6.0)配制的3%(w/v)可溶性淀粉溶液于试管中，置于60℃水浴锅内预热2 min，然后加入粗酶液或适当稀释的纯酶液0.1 mL，反应10 min，立即加入1.0 mL 1 mol·L^-1的盐酸终止反应，再加入1.0 mL(pH6.0)的0.1 mmol·L^-1的甲基橙溶液，混匀后于16℃下保温20 min，用酶标仪测定波长505 nm处的吸光度并根据空白计算褪色程度(ΔA)，最后根据α-环糊精标准曲线计算出α-环糊精的浓度。酶活性单位定义为：60℃，pH6.0下，每分钟催化产生1 μmol α-环糊精所需的酶量即为一个酶活力单位(U)。

2.   结果与分析

2.1   CGTase表达质粒的构建

以EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ为双酶切体系，分别对载体pBE载体及CGT片段进行双酶切，回收2 000 bp(CGT)及6 000 bp线性载体pBE。转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆子，提质粒进行单/双酶切验证，电泳结果如图 1所示，在2、6及8 kb附近出现2条预期大小的DNA亮带，说明大肠杆菌/芽胞杆菌穿梭表达质粒pBE-CGT成功构建。进一步通过电转化法将梭表达质粒pBE-CGT导入B. subtilis RIK1285感受态细胞，筛选克隆子菌落进行PCR验证(引物CGT-F/CGT-R)(图 2)，在2 kb左右出现预期大小条带；同时将质粒送上海生工进行测序验证，由测序结果可知，环糊精酶重组枯草芽胞杆菌工程菌B. subtilis RIK1285/pBE-CGT构建完成。

图  1  重组表达载体pBE-CGT单/双酶切验证

注：1为1 kb DNA标准分子量；2为重组载体单酶切；3为重组载体双酶切。

Figure  1.  Verification of pBE-CGT obtained by single and double digestion

Note:1.DL 1 kb DNA Marker; 2.Single digestion; 3.Double digestion.

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图  2  重组芽胞杆菌B. subtilis RIK1285/pBE-CGT菌落PCR验证

注：1为1 kb DNA标准分子量；2~6为CGT克隆子PCR。

Figure  2.  PCR validation on B. subtilis RIK1285/pBE-CGT colonies

Note:1.DL 1 kb DNA Marker; 2-6.Colony PCR of CGT。

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2.2   重组枯草芽胞杆菌产环糊精酶

以基础培养基LB为发酵培养基，对工程枯草芽胞杆菌菌B. subtilis RIK1285/pBE-CGT进行产酶培养，每隔4 h测定芽胞杆菌生长情况及产酶量，结果如图 3所示。随着发酵时间延长，细胞密度及酶活力均出现逐步上升的趋势，发酵16 h细胞量趋于稳定，菌体生长进入稳定期，当发酵24 h后，菌体浓度开始下降，此时α-环糊精酶酶活力达到最大值2.9 U·mL^-1，之后伴随菌体进入衰亡期，酶活力略微下降。因此，发酵24 h为该工程菌的最适发酵时间。

图  3  初始工程菌发酵环糊精酶活力和生长曲线

Figure  3.  CGTase activity and cell growth in shaking-flask fermentation

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2.3   重组枯草杆菌发酵环糊精酶条件优化

2.3.1   培养温度对产环糊精酶的影响

温度对微生物生长及生物酶活性具有重要影响；温度的改变，影响着微生物的代谢活动，过低的温度可能使微生物生长停滞，过高的温度可能导致微生物致死，因此本试验考察了4个温度下，工程菌经24 h发酵后的产酶情况，结果如表 1所示。随着温度的升高，菌体逐渐升高，生长旺盛；然而环糊精酶活性随温度的升高，呈先上升后下降的趋势，在37℃下酶活性达到最大值，为最适表达温度。分析原因，可能由于温度过低，菌体生长缓慢酶表达量低；随温度升高，菌体产酶速度加快，过高导致酶活降低，可能高温产生更多的蛋白酶对环糊精酶产生降解。

表  1  不同温度对菌体生长和产酶的影响

Table  1.  Effects of temperature on growth and enzyme production of bacteria

温度 Temperature/℃	细胞密度 OD600	环糊精酶活性 CGTase activity/(U·mL-1)
25	6.9	1.6±0.11a
30	7.3	2.1±0.16b
37	8.3	2.9±0.14c
40	9.5	1.9±0.15b
注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。表 2~3同。 Note:Values are the means±SD(n=3).Means with different letters within the same column are signi cantly different (P＜0.05).The same as Table 2-3.

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表  2  不同pH对菌体生长和产酶的影响

Table  2.  Effects of pH on growth and enzyme production of bacteria

酸碱度 pH	细胞密度 OD600	环糊精酶活性 CGTase activity/(U·mL-1)
5.5	7.3	1.9±0.13a
6.0	7.9	2.7±0.17b
6.5	8.1	3.3±0.19c
7.0	8.3	3.0±0.15c
7.5	8.4	2.7±0.15b
8.0	8.1	2.1±0.12a

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表  3  不同培养基对产环糊精酶的影响

Table  3.  Effects of culture medium on growth and enzyme production of bacteria

初始培养基 Initial medium	细胞密度 OD600	环糊精酶活性 CGTase activity/(U·mL-1)
LB	8.3	2.9±0.17a
TSB	9.2	3.5±0.16b
M9	10.5	4.1±0.13c
TB	12.3	5.3±0.21d

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2.3.2   pH对产环糊精酶的影响

pH是影响微生物生长及工程菌发酵过程中各种酶活性的一个重要因素，因此，本研究分析了不同pH下，工程菌经24 h发酵后的产酶情况，结果如表 2所示。当控制初始pH在6.0-8.0时菌体生长旺盛，pH7.5时菌体量最高；而在pH 6.5时酶活力达到最高，说明中性偏碱性有利于菌体生长，而中性偏酸性环境有利于外源环糊精酶基因的表达。因此，虽然初始pH在7.5时更有利于菌体生长，但工程菌最适表达pH为6.5。

2.3.3   不同培养基对产环糊精酶的影响

为了选择适合工程菌表达α-CGT酶并可用于下步优化的出发培养基, 将工程菌置于4种常见的枯草芽胞杆菌培养基中培养24 h，测定细胞密度及相应环糊精酶活力(表 3)。由表 3可知，经TB培养基发酵后，工程菌的细胞密度及环糊精酶活力均最高，明显高于其他3种培养基，究其原因：相对LB、TSB培养基而言，TB培养基有相对较高的pH缓冲能力，稳定的pH环境更有利于菌体生长，表达更多蛋白。相对M9而言，TB含丰富的营养成分(蛋白胨、甘油等)更适合菌体生长，因此有更多的菌体生产重组环糊精酶，更有利于α-CGT酶的表达。因此最终确定TB为最优发酵培养基。在pH6.5、37℃下，进行工程菌B. subtilis RIK1285/pBE-CGT产α-环糊精酶培养，其菌体生长及产酶曲线如图 4所示，在发酵24 h胞外酶活达到最高，为5.3 U·mL^-1，细胞密度达到(OD₆₀₀)12.3。

图  4  优化后工程菌发酵环糊精酶活力和生长曲线

Figure  4.  CGTase activity and cell growth in shaking-flask fermentation after optimization

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3.   讨论与结论

环糊精分子因其特殊的环状中空结构，具有的很强包络能力，应用广泛。随着人类生活品质的提高，对环糊精的需求量日益增长。环糊精的工业化生产主要是有环糊精酶催化合成。因此环糊精酶的产量及活性对环糊精的生产至关重要。随着现代分子生物学的飞速发展，运用基因工程手段，实现CGTase基因的异源超量表达，成为国内外研究的热点。本课题组前期已经实现了环糊精酶在大肠杆菌与酵母中的表达，取得一定进展。

为进一步提高环糊精酶表达量，探索环糊精酶最适表达系统，本研究选择枯草芽胞杆菌表达系统，成功构建了枯草芽胞杆菌B. subtilis RIK1285/pBE-CGT工程菌，并对工程菌发酵培养基种类及基础发酵条件进行了初步探索，最终确定TB为该工程菌的最适发酵培养基，在初始pH 6.5、37℃下，持续发酵24 h后，细胞密度达到12.3(OD₆₀₀)，此时测得发酵上清液α-环糊精酶环化活力同时达到最大值5.3 U·mL^-1，是野生菌Gebacillius sp.CHB1产α-环糊精酶(0.66 U·mL^-1)的8倍^[14]。目前有关α-环糊精酶的异源表达，主要集中在大肠杆菌表达系统，而枯草芽胞杆菌表达系统鲜见报道，张佳瑜等^[7]研究来源于软化芽孢杆菌的α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的表达，表达量是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍，α-环糊精酶活力为4.9 U·mL^-1。本研究结果虽最终提高倍数略低于前者，但最终酶活力更高。另外，虽然本研究枯草芽胞杆菌α-环糊精酶表达量低于其在大肠杆菌中的表达量，但相对大肠杆菌表达系统而言，枯草芽胞杆菌遗传背景清晰，属于公认的食品工业安全菌，不含内毒素，具有良好的遗传稳定性，且分离纯化工艺简单，是环糊精酶乃至其他酶蛋白高效表达、最终实现规模化生产的重要途径。后期深入研究，将考虑通过信号肽、表达载体等的优化以及对酶分子的氨基酸序列进行定点突变，最大限度提高环糊精酶在枯草芽胞杆菌中的表达量，为其规模化生产提供技术支持。