产蛋量属于限制性状和低遗传力性状，是家禽的一个极为重要的数量性状^[1]。金定鸭为福建省特色优秀地方蛋鸭品种，具有很强的抗逆、抗盐性，以耐粗饲、产青壳蛋、产大蛋、蛋品质好、耐寒而著称，是我国麻鸭品种产青壳蛋最多的品种。2000年，金定鸭入选国家级畜禽遗传资源保护名录。然而，由于福建省金定鸭品种保护方法比较单一，保护群体较小，缺乏系统选育，影响了保种质量和提纯复壮的速度，导致了种质资源退化。目前闽南一带饲养较多的是群众自繁自养、盲目杂交、未经系统选育的小型金定鸭。该鸭体型、开产、料蛋比与原种金定鸭相比，均有所改善；但由于缺乏系统选育，体型外貌和生产性能参差不齐，有的体型很大、有的很小，有的产蛋量很高、有的又很低，导致其种用价值不高，生产的商品蛋鸭体型外貌严重分离，产蛋性能高低不一，影响其生产潜能的发挥。

动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控，促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)会直接影响卵泡颗粒细胞的增生、卵泡的生长发育以及雌激素的合成与排卵，是影响雌性动物的重要激素^[2-3]。促卵泡素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)存在于卵泡颗粒细胞膜上，属于G蛋白偶联受体家族，对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用^[4]。目前对于家禽FSHR基因的研究较少，且大都集中在鸡上，该基因在鸭上的研究相对较少。仅李亨等^[5]在高邮鸭中研究发现FSHR基因外显子4上存在多态位点，且该位点与380日龄产蛋数存在显著相关(P < 0.05)，由此说明FSHR基因外显子4的基因型WW对高邮鸭繁殖生理机能有一定的促进作用。

本研究旨在对金定鸭FSHR基因进行克隆和测序，并对其进行生物信息学分析，为从分子标记方面提高金定鸭的产蛋量，培育优质高产的金定鸭新品系，促进金定鸭的规模化饲养与推广提供一定的理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

于福建省龙海市顺兴金定鸭有限公司饲养试验鸭。在福建省农业科学院畜禽分子遗传育种实验室进行相关的分子试验。

试验选取健康高产金定鸭(≥290枚·年^-1)、低产金定鸭(≤210枚·年^-1)个体各20只，采用胫静脉采血，EDTA抗凝，然后放入-20℃中保存。总DNA的提取采用基因组DNA试剂盒提取，TE溶解，提取完后放入-20℃保存备用。

1.2   主要试剂

普通琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒均购自TIANGEN公司；Platinum PCR SuperMix, High Fidelity、Nuclease-free water购自福州奥丁生物技术有限公司；pGMT载体、DNA Marker (DL5000)均购自大连TAKARA公司。

1.3   引物的设计与合成

根据在GenBank上已收录的鸭和鸡FSHR基因的DNA序列和mRNA序列，利用Primer 5.0设计相关引物5对，送大连TAKARA公司进行合成，引物序列见表 1。

表  1  用于FSHR基因SNP筛查的引物信息

Table  1.  Details of 5 primmer pairs for SNP of FSHR gene of Jinding duck

引物	引物序列	退火温度 (Tm) /℃	片段大小 /bp
P1	F: 5′-CAGTCATGTCACGCACAACATT-3′; R: 5′-GTGGCTGCATTTCTGCTCAC-3′	59; 59	330
P2	F: 5′-GCATTGCTTGAAATATCTTGACT-3′; R: 5′-GCTTAGCACAGGTTAGATGGAA-3′	56; 57	700
P3	F: 5′-GGGTATGTGGTGAAAGCCTAC-3′; R: 5′-CCCAAAATGCTATCATGAAGCT-3′	56; 59	310
P4	F: 5′-GAAATGCTTTGCCTTTACCTT-3′; R: 5′-CAACCCATTTCTGAAGAAGGA-3′	56; 57	366
P5	F: 5′-GTAATGCTGAGCTTCCCTGTTC-3′; R: 5′-GGCTTAATGATGAGAAAAAGGAA-3′	58; 58	540

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1.4   PCR扩增

应用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取产蛋量高(H)、产蛋量低(L)的健康金定鸭血液基因组DNA，分别混合形成2个DNA池，进行PCR扩增反应，PCR反应体系为50 μL：Platinum PCR SuperMix, High Fidelity 45 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA池(第一轮PCR产物稀释10倍)2 μL，ddH₂O 1 μL。PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，68℃ 30 s，共38个循环; 72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物经1%~2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。用胶回收试剂盒将目的片段回收、纯化后连接到载体pGM-T上，然后转化感受态细胞。

1.5   测序分析

将随机挑选好的5个阳性克隆子送往大连TAKARA公司进行双向测序，测序结果利用DNASTAR软件和NCBI网站的Blast分析程序与鸡的FSHR基因序列进行比对分析。

1.6   FSHR基因相关的SNP筛查

根据所获得的FSHR基因的序列进行SNP筛查。

2.   结果与分析

2.1   PCR扩增结果

分别提取低产和高产金定鸭的基因组DNA，电泳结果显示DNA浓度高(图 1)，适于PCR扩增。图 2为PCR的扩增结果，扩增产物长度分别位于200~500、500~750 bp，扩增片段长度特异性较好，没有非特异性条带，且与预期片段大小一致。PCR产物经回收、克隆，挑取阳性克隆子并进行双向测序，得到长度分别为330、700、310、366、540 bp的片段(图 2)。

图  1  DNA的电泳结果

注：L1~L8为低产金定鸭个体的DNA电泳结果；H1~H9为高产金定鸭个体的电泳结果；M为DL5000。

Figure  1.  Electrophoresis of DNA products

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图  2  PCR产物的电泳结果

注：L为低产金定鸭个体；H为高产金定鸭个体。

Figure  2.  Electrophoresis of PCR products

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2.2   序列分析

将获得的序列分别与鸡的FSHR进行BLAST比对分析，结果表明序列a包含第1外显子(185 bp)的完整序列，第1内含子(145 bp)的部分序列；序列b包含第2(75 bp)、3外显子(75 bp)、第2内含子(463 bp)的完整序列，第1(40 bp)、3内含子(47 bp)的部分序列；序列c包含第4外显子(75 bp)的完整序列，第3(180 bp)、4内含子(55 bp)的部分序列；序列d包含第5外显子(78 bp)的完整序列，第4(232 bp)、5内含子(56 bp)的部分序列；序列e包含第6(69 bp)、7外显子(75 bp)、第6内含子(117 bp)的完整序列，第5(133 bp)、7内含子(146 bp)的部分序列。

2.3   SNPs分析

金定鸭低产、高产池DNA的PCR扩增产物经回收纯化、双向测序以及拼接处理后，进行比对，结果发现在外显子1第50 bp处存在A/G突变；在外显子2第30 bp处存在A/G突变；在外显子4第33 bp处存在C/T突变；在外显子5第45 bp处存在A/G突变，第19 bp处可能存在A/T突变，33 bp处可能存在C/T突变(图 3、4)。

图  3  外显子5的突变位点

注：L代表低产金定鸭个体；H代表高产金定鸭个体。

Figure  3.  Mutations on the 5^th exon

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图  4  PCR产物的测序

Figure  4.  Sequences of PCR products

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3.   讨论

FSHR对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵有着重要的调控作用^[4]。S.You等^[6]首次从鸡卵巢组织中成功克隆出FSHR基因的cDNA序列。到2006年FSHR基因序列的分析和整合结果在鸡上已初步完成^[4]。杨孔等^[7]研究表明FSHR基因exon4和exon1在罗曼鸡和藏鸡种间存在SNP位点，且该基因的SNP与产蛋量具有显著的相关性。李亨等^[8]研究表明文昌鸡FSHR基因外显子的全部区域及中间的内含子区域存在4个SNPs，且文昌鸡exon8区的GG基因型可能为优势基因型，G为优势等位基因，该突变位点可作为研究文昌鸡繁殖性能的相关分子标记。王慧^[9]研究表明32周龄鸡卵巢组织FSHR基因的mRNA的差异表达量与产蛋数的杂种优势呈显著正相关，这可能是通过FSHR抑制卵泡闭锁、促进鸡卵泡成熟、刺激颗粒细胞增生、诱导芳香化酶的活性(与E2合成有关)、诱导黄体素受体(LHR)的产生并可诱发排卵等功能的实现。Li Kang等^[10]在cFSHR启动子片段检测出单核苷酸替换39个、TTG-CAC的核苷酸替换1个、插入缺失9个共计49个完全突变。康丽等^[11]研究表明FSHR基因5′调控区-237，-868位点的突变对新杨褐鸡37周开产日龄和总产蛋数呈显著相关，G+型与产蛋数多有关，其在高产群体中频率较高，G-型可能与开产日龄的早晚有关，这与其在开产日龄较早的地方品种中的频率较高相符，两位点间的作用机理还有待进一步的研究。杨玉等^[12]研究表明日粮的能量水平可能影响FSHR基因mRNA的表达以影响卵巢卵泡的发育，进而对鸡的性成熟起到一定的作用；饲料中适当的能量水平可提高FSHR基因mRNA的表达，22周龄的蛋鸡卵巢FSHR基因mRNA的表达量可作为后期蛋鸡产蛋量高低的预示指标。王克华等^[13]研究表明，FSHR基因与蛋鸡的蛋重、开产日龄、产蛋数等重要的繁殖性状关系密切，该基因可作为选育优质高产蛋鸡的有效分子标记。因此，本研究选取FSHR基因作为研究金定鸭产蛋性状的候选基因，进行克隆和测序，扩增出金定鸭1~7外显子的全部序列，并找出可能存在的突变位点，为后续发现与金定鸭产蛋性状显著相关的分子标记，培育优质高产的金定鸭新品系奠定基础。结果发现FSHR基因在外显子1第50 bp处存在A/G突变；在外显子2第30 bp处存在A/G突变；在外显子4第33 bp处存在C/T突变；在外显子5第45 bp处存在A/G突变，33 bp处可能存在C/T突变，第19 bp处可能存在A/T突变。

金定鸭FSHR基因第1~7外显子的克隆及1~7外显子上突变位点的发现，可为后续研究FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关性奠定理论基础。