Effect of Chinese Milk Vetch (Astragalus sinicus L.) as a Green Manure on Grape Productivity and Quality, Nutrient Contents, and Microbiologic Properties of Vineyard Soils
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摘要: 为探求紫云英绿肥翻压对葡萄园土壤养分、土壤酶活性及葡萄产量和品质的影响，连续4年在葡萄园内开展不同紫云英绿肥翻压量试验，对果实品质指标、土壤有机碳、土壤氮磷钾、土壤酸性磷酸酶、土壤脲酶、土壤蔗糖酶以及土壤过氧化氢酶等指标进行测定。结果表明：在施用等量NPK条件下，紫云英绿肥翻压量在6 000~22 500 kg·hm-2，土壤酶活性和微生物数量随着紫云英绿肥鲜草翻压量的增加而增强，有效促进了葡萄园土壤中养分的转化，从而提高葡萄产量和各项品质指标。紫云英鲜草翻压量为22 500 kg·hm-2时达到最佳土壤培肥效果，葡萄产量最高，达16 530 kg·hm-2，且口感达最佳。与单施NPK肥相比，土壤各项酶活性指标提高了11.7%~39.5%；土壤中各类菌数量增幅12.0%~147.8%；产量提高了15.3%，中心糖含量、维生素C含量及黄酮类化化合物分别提高了13.5%、8.8%、11.9%。此外，研究还表明，紫云英鲜草翻压量大于22 500 kg·hm-2对土壤肥力、葡萄品质的提升效果不显著。Abstract: In order to explore the effect of overturning Astragalus sinicus L. on soil nutrient, microbial characteristics, grape yield and quality, a 4-year experiment of overturning different amount of milk vetch green manure in vineyards was conducted. Meanwhile, fruit quality, soil organic carbon, acid phosphatase, urease, invertase and catalase were measured. The results showed that the activities of these vineyards' acid phosphatase, urease, invertase, catalase were increased with incrasing levels of green manure under the treatments received different amount of green manure (6 000-30 000 kg·m-2). Additionally, in comparison with NPK treatment, soil enzymatic activities under the treatments received different amount of green manure (6 000-30 000 kg·m-2) increased by 11.7%~39.5%, the amount of microbial communities increased by 12.0%-147.8%, grape yield increased by 15.3%, soluble sugar, Vitamin C and flavonoid content in grape fruits increased by 13.5%, 8.8%, 11.9%, respectively. Moreover, the maximal tea yields of 16 530 kg·hm-2 was obtained under the treatment at an application dose of 22 500 kg·hm-2. Therefore, the amounts of bacteria, fungi and actinomycetes in the vineyard soils were increased, soil nutrient transformations were promoted, and grape productivity and quality were improved, especially for the treatment at an application dose of 22 500 kg·hm-2.
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Keywords:
- milk vetch /
- vineyard /
- soil nutrient contents /
- microbial characteristics /
- quality
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0. 引言
【研究意义】胰岛素样生长因子结合蛋白2（Insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2）属于IGFBPs家簇，在动物外周循环和细胞外液中广泛存在，在脂肪形成过程中发挥着十分重要的作用[1-2]。IGFBP2与胰岛素样生长因子2（IGF2）有较高的亲和力，与IGF2结合后将其转运到溶酶体降解，以调节IGF2的含量，并能抑制IGF2与MDBK细胞表面结合，进而抑制它们促有丝分裂活性功能[3]。【前人研究进展】目前，有研究报道IGFBP2基因多态性与动物生产性能、经济性状间存在关联，发现了一些影响肉质性状的SNPs与QTLs。杨华等[4]检测发现在大白猪×梅山猪杂交猪试验群体中IGFBP2基因第2内含子内存在1个C-T碱基突变，引起Msp Ⅰ酶切位点的改变，关联研究发现该多态位点与胴体性状、肉质性状间存在显著相关关系。Rohrer等[5]采用182个微卫星标记扫描了370头杜洛克猪×长白猪F2代群体的基因组，发现并证实猪15号染色体上IGBFP2基因所在区域内与大理石纹和嫩度相连锁的QTL位点可以用来提高猪肉品质。Prasongsook等[6]在美国密歇根州立大学杜洛克猪×皮特兰猪F2代资源群体中研究发现，IGFBP2基因不同基因型对失水率、pH24、肉色、多汁性和嫩度等肉质性状有显著影响。【本研究切入点】苏姜猪是以地方品种姜曲海猪为母本，导入杜洛克猪血统，运用常规育种与现代分子遗传育种手段相结合的方法培育而成的瘦肉型新品种猪，并于2013年成功通过国家畜禽遗传资源委员会审定，获得畜禽新品种证书。目前，关于苏姜猪的研究主要集中在生产性能、屠宰测定等方面[7-8]，候选基因及其多态性与肉质性状等性能之间相关关系的研究报道较少。【拟解决的关键问题】为了寻找与苏姜猪肉质性状相关的遗传标记，本试验采用PCR-RFLP技术检测3个猪种IGFBP2基因Msp Ⅰ酶切片断多态性，并分析了苏姜猪不同基因型间肉质性状的差异，以期为苏姜猪持续选育及分子标记辅助选择研究提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
苏姜猪447头饲养于江苏苏姜种猪有限公司，姜曲海猪109头饲养于江苏姜曲海种猪场，杜洛克猪218头饲养于常州市康乐农牧有限公司。同一公司内饲养的育肥期试验猪日龄、体重相近，公母各半，饲粮营养水平相同，饲养管理方式一致。
1.1.2 主要试剂与仪器
Msp Ⅰ限制性内切酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker购自北京华越洋生物科技有限公司，KAPA DNA快速提取试剂盒购自上海捷易生物科技有限公司。主要仪器包括Q5000超微量核酸蛋白测定仪、ABI Veriti 96梯度PCR仪、WSC-S测色色差计。
1.2 试验方法
1.2.1 组织样采集与DNA提取
所有试验猪在育肥结束销售前逐头采集耳组织样0.5 g，置于装有70%酒精的Eppendorf管内，冰盒保存带回实验室。按照DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，采用超微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和纯度，−20℃保存备用。
1.2.2 肉质性状测定
苏姜猪体重达100 kg左右时，每个基因型选取8头进行屠宰，从左半侧胴体倒数第3～4胸椎处向后采集背最长肌20～30 cm，按照“NY/T821-2004猪肌肉品质测定技术规范”测定剪切力、失水率、肉色、pH24、大理石纹等肉质性状指标。其中肉色采取5分制比色板评分法和WSC-S色差仪法2种方法测量，色差仪测的L值代表光反射值，a值和b值分别代表红度和黄度值。
1.2.3 PCR扩增
根据杨华等[4]研究成果，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成一对引物，扩增IGFBP2基因第2内含子内245 bp片段。引物序列分别为：上游，5′-GGTCT GATTG GAGGG GTGT-3′；下游，5′-AGCCA AGGAG AAATG TGAAG G-3′。PCR 扩增反应体系包括：DNA模板2.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L−1）各 1.0 μL，加ddH2O至总体积25.0 μL。PCR 反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s，共计35个循环；72℃延伸10 min，并在4℃条件下保存备用。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察扩增效果。
1.2.4 PCR-RFLP-Msp Ⅰ酶切分析
符合要求的PCR扩增产物用Msp Ⅰ进行酶切，酶切反应体系包括1×Buffer 1.5 μL，Msp Ⅰ限制性内切酶0.2 μL（5 U），PCR产物5 μL，加ddH2O至总体15 μL，37℃酶切反应2 h。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测经过限制性内切酶Msp Ⅰ酶切的产物，并凝胶成像系统下判断基因型类型。按照刘海霞等[9]研究方法计算3个猪种试验群体内的纯合度（H0）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC），并比较分析IGFBP2基因不同基因型对苏姜猪肉质性状的影响。
1.3 数据处理
采用SPSS 16.0 GLM对数据进行统计学分析。
2. 结果与分析
2.1 IGFBP2基因PCR扩增产物
IGFBP2基因第2内含子目标片段的PCR扩增产物电泳检测结果见图1。从图1可见PCR产物的特异性非常好，扩增片段与目标片段大小一致，长度245 bp，可以直接用来进行RFLP分析。
2.2 IGFBP2基因PCR-RFLP检测分型
对3个猪种IGFBP2基因目标片断的PCR扩增产物进行RFLP-Msp Ⅰ分析，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。结果发现，IGFBP2基因PCR产物在3个猪种试验群体中均检测到了Msp Ⅰ酶切多态性，存在AA、AB和BB 3种基因型。
2.3 IGFBP2基因遗传多态性分析
2.3.1 等位基因和基因型频率
统计3个猪种试验群体IGFBP2基因目标片段的等位基因和基因型频率（表1）。由表1可知，3个猪种试验群体中优势基因型均为AB，优势等位基因为B。
表 1 IGFBP2基因基因型频率和基因频率Table 1. Genotype and frequency distribution of IGFBP2 gene品种 Breed 基因型频率 Genotype frequency 等位基因频率 Allele frequency AA AB BB A B 苏姜猪 Sujiang pig 0.16（76） 0.48（229） 0.36（172） 0.40 0.60 姜曲海猪 Jiangquhai pig 0.10（11） 0.59（64） 0.31（34） 0.39 0.61 杜洛克猪 Duroc pig 0.13（29） 0.61（132） 0.26（57） 0.44 0.56 注：括号内数字为个体数，括号外数字为频率。
Note: Number of individuals outside parentheses, frequency in parentheses.2.3.2 纯合度、杂合度、有效等位基因数及多态信息含量
3个猪种试验群体H0、He、Ne及PIC的统计结果见表2。由表2可知，3个猪种试验群体的PIC均呈现中度多态，且姜曲海猪试验群体的遗传多样性高于苏姜猪、杜洛克猪试验群体。
表 2 IGFBP2基因多态位点纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量Table 2. Genetic polymorphism parameters ( Ho, He, Ne and PIC ) of IGFBP2 gene品种 Breed 纯合度 H0 杂合度 He 有效等位基因数 Ne 多态信息含量 PIC 苏姜猪 Sujiang pig 0.52 0.48 1.92 0.36 姜曲海猪 Jiangquhai pig 0.52 0.48 1.92 0.41 杜洛克猪 Duroc pig 0.50 0.50 2.00 0.38 注：PIC＜0.25：低度多态；0.25＜PIC＜0.5：中度多态；PIC＞0.5：高度多态。
Note: PIC＜0.25: low polymorphism; 0.25＜PIC＜0.5: moderate polymorphism; PIC＞0.5: high polymorphism.2.4 IGFBP2不同基因型对苏姜猪肉质性状的影响
苏姜猪IGFBP2基因不同基因型个体间肉质性状的关联分析见表3。由表3可知，AA、AB型个体大理石纹显著高于BB型（P＜0.05），AB、BB型与AA型个体的五分制肉色和色差仪测得的a值间的差异达到显著水平（P＜0.05），其余指标间的差异均不显著（P＞0.05）。
表 3 苏姜猪IGFBP2基因不同基因型肉质性状间的差异分析Table 3. Comparison of meat quality of Sujiang pigs with varied IGFBP2 gene基因型 Genotype pH 失水率
Water loss rate /%大理石纹评分
Marbling score肉色评分
Meat color score肉色 Meat color L a b AA 5.57±0.04 20.94±2.04 3.83±0.45a 3.87±0.23a 43.81±0.64 15.92±0.42a 20.08±0.36 AB 5.53±0.02 23.92±0.96 3.78±0.23a 2.63±0.10b 44.17±0.54 14.01±0.37b 20.39±0.27 BB 5.61±0.05 21.83±1.25 2.34±0.18b 2.73±0.15b 44.78±0.60 13.95±0.38b 20.41±0.32 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Note: Different lowercase letters in the same column represented significant difference (P＜0.05).3. 讨论与结论
IGFBP2是胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor, IGF）家族中的一种结合蛋白，主要存在于动物组织和体液中，可参与调控细胞的生长和代谢，与细胞粘附、瘤血管形成密切相关[10]。IGFBP2的研究主要集中在人类医学方面，许多肿瘤组织都有IGFBP2表达或表达水平升高，表明IGFBP2可能是一种肿瘤的分化程度的标志物[11-12]。
前期IGFBP2基因的研究主要集中在其结构与功能方面，目前有关IGFBP2基因多态性与经济性状的关联研究逐渐增多。Zhao等[13]测序发现IGFBP2基因第2内含子区域内存在2个SNPs（C1107G、C1130T）与两个插入/缺失片段（552 bp后TC，1 115 bp后GCCAGGT），京海黄鸡试验群体中AA型个体的出雏重、12周龄体重显著高于AB型个体，A等位基因对个体体重有正面影响，并由此推测IGFBP2基因内含子2区域的突变可以用作京海黄鸡体重的遗传标记。Wang等[14]将猪IGFBP2基因定位于15号染色体（15q22-23），中国地方猪种携带的A等位基因（50%以上）比欧洲猪种要高，不同基因型个体间在前躯重、后躯重、前肢重、后肢重等生产性能间差异均达到显著或极显著水平。
本研究在苏姜猪、姜曲海猪、杜洛克猪等3个试验群体中均发现IGFBP2基因第2内含子区域内存在着1个Msp Ⅰ酶切位点多态性，获得A、B 2个等位基因，AB、AB、BB 3种基因型。苏姜猪试验群体的多态信息含量为0.36，呈现出中度多态，由此可见苏姜猪群体具备进一步选育的潜力。苏姜猪IGFBP2基因不同基因型个体在大理石纹、肉色两个指标中存在显著差异，AA型个体的大理石纹、肉色均显著高于BB型，这些结果与杨华等[4]、刘海霞等[9]的研究结论相似，但与Prasongsook等[6]在部分肉质指标间存在差异。Prasongsook等研究发现国外杂交商品猪群体中IGFBP2基因不同基因型的失水率、pH值、肉色等性状均达到了显著水平，而本试验中却没有发现苏姜猪试验群体在不同基因间的失水率、pH值存在显著差异，这可能与试验猪的品种、数量、饲养管理、测定方法等因素存在着一定的关系。由于试验条件的限制，本研究无法分析IGFBP2基因第2内含子内PCR-RFLP-Msp Ⅰ多态位点对姜曲海猪、杜洛克猪肉质性状的影响，等试验条件具备后可作进一步的分析与探讨。
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图 2 紫云英绿肥翻压对中心糖含量的影响
Figure 2. Effect of overtunming Milk vetch green manure on central sugar content of grape
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图 3 紫云英绿肥翻压对可滴定酸含量的影响
Figure 3. Effect of overtunming Milk vetch green manure on titratable acid of grape
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图 4 紫云英绿肥翻压对固酸比值的影响
Figure 4. Effect of overtunming Milk vetch green manure on solid acid ratio of grape
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图 5 紫云英绿肥翻压对维生素C含量的影响
Figure 5. Effect of overtunming Milk vetch green manure on Vc of grape
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图 6 紫云英绿肥翻压对总黄酮含量的影响
Figure 6. Effect of overtunming Milk vetch green manure on total favonoid content of grape
表 1 紫云英翻压量对葡萄外观品质指标的影响
Table 1 Effect of overturning Milk vetch green manure on grape appearance index
试验处理 纵径/mm 横径/mm 果形指数 果实硬度/(kg·cm-3) 单粒重/ g 产量/(×103kg·hm-2) NPK(CK) 23.16±0.28 a 18.18±0.35 a 1.27±0.05 a 1.89±0.05 c 7.59±0.12 c 14.33±0.37 b NPK+MV6000 23.32±0.23 a 18.13±0.26 a 1.29±0.03 a 1.96±0.07 c 8.02±0.06 b 14.68±0.74 b NPK+MV15000 23.44±0.38 a 17.98±0.36 a 1.30±0.10 a 2.09±0.05 a 8.08±0.03 ab 16.00±0.69 ab NPK+MV22500 23.60±0.34 a 17.90±0.20 a 1.32±0.07 a 2.07±0.06 ab 8.16±0.03 a 16.53±1.50 a NPK+MV30000 23.49±0.45 a 18.16±0.23 a 1.29±0.06 a 1.97±0.07 bc 8.15±0.06 a 15.82±1.13 ab 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，表 2、3同。 
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表 2 葡萄套种紫云英绿肥翻压量试验各处理土壤养分状况
Table 2 Soil nutrient status of each treatment test on interplanting grape milk vetch green manure
试验处理 有机碳/(g·kg-1) 全氮/(g·kg-1) 全磷/(g·kg-1) 全钾/(g·kg-1) 碱解氮/(mg·kg-1) 速效磷/(mg·kg-1) 速效钾/(mg·kg-1) NPK(CK) 5.71±1.00c 1.01±0.03c 0.83±0.04b 13.93±0.95b 101.05±4.65c 40.48±2.47b 114.53±2.68b NPK+MV6000 5.86±1.67bc 1.12±0.04b 0.86±0.02ab 14.33±0.38b 111.45±9.25bc 44.92±1.44a 120.29±4.56ab NPK+MV15000 6.05±2.00ab 1.19±0.07ab 0.89±0.03a 15.20±0.60ab 124.86±8.47ab 44.82±1.09a 121.57±3.36a NPK+MV22500 6.20±0.11a 1.24±0.03a 0.92±0.04a 16.73±1.50a 130.37±4.08a 47.10a±0.81a 122.36±2.16a NPK+MV30000 5.98±0.03b 1.25±0.03a 0.90±0.03a 16.77±0.45a 137.07±8.32a 47.10a±0.88a 122.98±3.25a
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表 3 紫云英翻压量对葡萄园土壤酶活性和微生物数量的影响
Table 3 Soil enzymatic activity and Soil microbial quantity of each treatment test on interplanting grape milk vetch green manure
处理 酸性磷酸酶/(μmol·g-1·h-1) 脲酶/(μg·g-1·h-1) 蔗糖酶/(mg·g-1·h-1) 过氧化氢酶/(mmol·g-1·h-1) 细菌数量/(×107 CFU·g-1) 放线菌数量/(×107 CFU·g-1) 真菌数量/(×107 CFU·g-1) NPK(CK) 0.98±0.10b 38.33±3.51c 282±0.10c 0.13±0.01c 0.46±0.07c 0.50±0.07c 0.61±0.05d NPK+MV6000 1.06±0.05b 44.33±4.72bc 3.04±0.12b 0.13±0.01bc 0.59±0.08c 0.56±0.05bc 0.72±0.05c NPK+MV15000 1.10±0.02b 48.67±3.06ab 3.22±0.11a 0.14±0.01ab 0.92±0.13ab 0.64±0.47bc 0.96±0.07b NPK+MV22500 1.36±0.13a 53.00±3.00a 3.29±0.12a 0.14±0.01a 1.14±0.14a 1.09±0.14a 1.17±0.07a NPK+MV30000 1.25±061a 56.00±3.00a 3.12±0.07ab 0.14±0.01a 1.09±0.11b 0.95±0.09ab 1.10±0.05a
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表 4 土壤养分和土壤酶活性的相关分析
Table 4 Correlation between soil enzyme activities and soil nutrient contents
项目 酸性磷酸酶 脲酶 蔗糖酶 过氧化氢酶 全碳 0.82* 0.74 0.98** 0.90* 全氮 0.88* 0.98** 0.90* 0.98** 有机碳 0.87* 0.81 0.98** 0.94** 全钾 0.95** 0.96** 0.76 0.90* 碱解氮 0.85* 0.99** 0.83* 0.96** 速效磷 0.87* 0.94** 0.86* 0.91* 速效钾 0.78 0.93** 089* 0.94** 注：*表示差异达到5%显著水平，**表示差异达到1%显著水平。
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