Responses of Tea Plants to Blister Blight Analyzed Using Transcriptome and Metabolome
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摘要:目的
探明茶树对茶饼病菌的抗性分子机制，挖掘抗病相关基因，为茶树抗性育种提供依据。
方法通过转录组测序和代谢组分析，比较茶树健康叶片（CK）和感染茶饼病的叶片（TB）中的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）和差异代谢物（differentially accumulated metabolites, DAMs）。
结果转录组数据显示，样品CK和TB之间共有
1009 个 DEGs；GO 富集分析表明，差异基因参与了细胞壁代谢及调控几丁质酶活性、氧化还原酶活性和木葡聚糖：木葡基转移酶活性；KEGG 代谢途经分析表明，DEGs显著富集在“类黄酮生物合成”“苯丙素生物合成”“氨基糖和核苷糖代谢”“甘油酯代谢”和“二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成”途径；DEGs 中包含47个转录因子，分属21个转录因子家族，主要包括bHLH、SBP、AP2/ERF-AP2和MYB等，这些转录因子可能是茶树抵御茶饼病侵染过程中重要的调控基因。利用广泛靶向代谢组学技术分析，共发现353个DAMs，DAMs主要富集于“类黄酮生物合成”“赖氨酸生物合成”和“丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢”途径。利用转录组联合代谢组分析发现，显著共同富集的途径是“类黄酮生物合成”“苯丙素生物合成”和“二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成”；筛选了与苯丙素类及类黄酮生物合成途径相关的20个DEGs和15个DAMs，其中，CSS0011741（4CL）、CSS0002940（DFR）、CSS0015968（DFR）和CSS0010687（ANS）等DEGs在感病叶中上调表达，根皮素、根皮苷、4-羟基苯乙烯、对香豆酰奎宁酸、二氢杨梅素、表没食子儿茶素和芍药素-3-O-葡萄糖苷等DAMs在感病叶中积累。结论“苯丙素类生物合成”和“类黄酮生物合成”等代谢途径中的 DEGs在茶树响应茶饼病侵染中发挥重要作用，根皮素、根皮苷以及表没食子儿茶素等DAMs可能是茶树抵御茶饼病侵染的重要次生代谢产物。
Abstract:ObjectiveResistance mechanism and associated genes of tea plants in response to blister blight infection were studied based on transcriptome as well as metabolome.
MethodsDifferentially expressed genes (DEGs) and differentially accumulated metabolites (DAMs) in leaves of healthy (CK) and blister blight-infected (TB) tea plants were compared by using both transcriptome and metabolome.
ResultsBetween CK and TB, 1 009 DEGs associated with the cell wall metabolism and the regulations of chitinase, oxidoreductase, and xyloglucan:xyloglucanosyltransferase activities were identified by a GO enrichment analysis. The KEGG analysis showed the DEGs significantly enriched in the pathways of flavonoid biosynthesis, phenylpropanoid biosynthesis, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, glycerolipid metabolism, and stilbenoid, diarylheptanoid, and gingerol biosynthesis. Forty-seven transcription factors in the DEGs, which belonged to 21 transcription factor families including bHLH, SBP, AP2/ERF-AP2, and MYB, might be the genes significantly involved in the resistance of a tea plant to blister blight. The 353 DAMs identified by using the widely targeted metabolomics were enriched mainly in the flavonoid biosynthesis and lysine biosynthesis as well as the alanine, aspartate, and glutamate metabolism pathways. The transcriptome and metabolome revealed significant co-enrichments in the flavonoid biosynthesis, phenylpropanoid biosynthesis, and stilbenoid, diarylheptanoid, and gingerol biosynthesis pathways. Among the selected 20 DEGs and 15 DAMs associated with the phenylpropanoids and flavonoids biosynthesis pathways, DEGs such as CSS0011741（4CL）, CSS0002940（DFR）, CSS0015968（DFR）, and CSS0010687（ANS） were upregulated, while DAMs such as phloretin, phlorizin, 4-Hydroxystyrene, p-Coumaroyl quinic acid, dihydromyricetin, epigallocatechin, and peonidin 3-O-glucoside were accumulated in the infected leaves.
ConclusionThe DEGs in the phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis pathways might play a crucial role in the response of tea plants to blister blight. And the DAMs, such as phloretin, phlorizin, and epigallocatechin, might be the secondary metabolites in tea plants that participated closely in the resistance mechanism.
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0. 引言
【研究意义】茶树[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是一种多年生叶用经济作物，发展茶产业能有效促进农民增收和农业增效。茶树病害严重制约了茶叶的产量和质量[1]，温暖和湿润的气候环境容易使茶树诱发多种病害。由坏损外担菌（Exobasidium vexans Massee）引起的茶饼病（tea blister blight）是我国近年来传播最广且危害最严重的茶树叶面病害之一[2]。发病初期叶片正面出现淡黄或淡红色半透明小斑点，随后病斑逐渐扩大且向背面凸起，并附着白色粉末状物，叶片卷曲畸形，发病后期病斑形成褐色枯斑，病芽叶制成的干茶味苦易碎，品质明显下降，影响经济效益[3]。深入解析茶树对茶饼病的抗病分子机理，挖掘抗病相关基因，对于茶树抗性育种具有重要意义。【前人研究进展】利用RNA 测序（RNA sequencing, RNA-seq）技术获取全部mRNA转录本的丰度信息，可从中挖掘参与不同生物学过程的差异表达基因[4]。近年来，RNA-seq技术被广泛应用于茶树与病原菌互作机理研究，如在研究茶树对炭疽病的抗性时发现，中茶108（ZC108）比其亲本龙井43（LJ43）对炭疽菌的抗性更强，原因可能与其黄酮类化合物合成途径中基因表达不同有关[5]。抗性（R）基因、防御相关酶类基因和转录因子、逆转录转座子、多药耐药性转运蛋白基因与茶树抗茶饼病相关[6]。此外，茶树感染茶饼病前后叶片中差异基因显著富集在信号转导、氧化应激与抗氧化、萜类生物合成、卟啉和叶绿素代谢、细胞壁合成、植物激素合成及信号传导、植物-病原体互作、MAPK信号通路和苯丙烷生物合成等途径，并且感病后表达茶树病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins, PR）、富含亮氨酸重复的受体（leucine-rich repeat, LRR）、转录因子（MYB、bHLH、AP2/ERF、WRKY、NAC家族）、几丁质酶和过氧化物酶、抗病蛋白（R protein）、水解酶、转运蛋白相关合成蛋白及光合作用天线蛋白等酶的基因被激活[1,7−11]。对植物产生的所有代谢物进行定量分析，即植物代谢组学技术，获得的代谢物结果可较直观地反映植物表型性状。研究发现，茶树感染茶饼病后黄酮类和酚酸物质显著增加，这可能与茶树抗茶饼病有关[12]。为了全面探究茶树响应逆境胁迫的相关机理，差异表达基因和差异代谢物可以通过转录组测序联合代谢组学技术进行分析，有助于准确揭示植物的代谢途径调控网络[13]。【本研究切入点】目前，基于转录组和代谢组联合分析茶树对茶饼病防御反应的关键基因及关键代谢物积累的研究报道较少。【拟解决的关键问题】采用转录组和代谢组联合分析技术对感病和未感病茶树叶片的基因表达和代谢物进行研究，分析茶树响应茶饼病病原菌侵染后，抗性相关基因的表达模式和代谢物变化情况，为进一步揭示茶树的抗病分子机制和抗病育种提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为茶树健康叶片（CK）和感染茶饼病的叶片（TB），CK与TB采自同一区域的相同品种，TB为感病中期（病斑大小约为0.5 cm ）叶片，于2023年9月6日采集自贵州省都匀市红敏茶园（26°20′18.22″N, 107°31′11.77″E），海拔800 m，年降雨量
1260 ～1450 mm。每组样品由3个重复组成。收集的样品使用75%酒精消毒及无菌水处理，储存在−80°C冰箱备用。1.2 转录组分析
取感病叶和健康叶各3次重复共6个样本进行转录组分析，使用RNA prep Pure Plant Kit（Tiangen，Beijing，China）提取叶片总RNA，之后纯化并构建测序文库，在Illumina NovaSeq平台上对文库进行测序，生成150 bp的双末端（PE）序列，该部分工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。利用HISAT2将质控数据与茶树参考基因组进行序列比对，得到样本基因，从TPIA（tea plant information achieve）数据库中获取参考基因组（Shuchazao_V2）和注释信息 [14]，主要包含茶品种舒茶早[Cultivar Shuchazao of C. sinensis var. sinensis (CSS)，登录号：GS2002008]的注释文件、转录组参考基因组文件以及蛋白质序列文件。利用FPKM值计算统计转录本的表达量。将得到的基因利用DESeq2进行筛选，FDR（false discovery rate）＜0.01和FC（fold change）≥2的基因被指定为差异表达，差异显著基因通过GO（Gene Ontology）数据库和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行基因的功能注释，分析差异基因参与的代谢途径。
1.3 代谢组分析
取感病叶和健康叶各3次重复共6个样本进行广靶代谢组分析。广靶代谢组分析由北京百迈客生物科技有限公司完成，试验方法参照Wang等[15]和Li等[16]的方法。代谢组测定使用Waters UPLC Acquity I-Class PLUS超高效液相色谱仪串联AB Sciex Qtrap
6500 +高分辨质谱仪，所使用的色谱柱购自Waters的Acquity UPLC HSS T3色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）。将得到的数据进行代谢产物的差异分析及KEGG富集分析。通过FC≥1、变量重要性投影（variable importance in projection, VIP）≥1及t检验的P＜0.05筛选差异显著变化的代谢物。1.4 实时荧光定量PCR 验证
随机选择6个差异表达基因（包含上调和下调基因）进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR），以茶树CsEF1（KA280301.1）基因作为内参基因，验证其转录组测序结果的可靠性。取样方法与上述一致，Trizol 法提取总RNA，利用Aidlab TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit逆转录试剂盒合成cDNA，参考转录组测序序列使用在线网站Primer Quest Tool （https://sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest?returnurl=%2FPrimerquest%2F）设计qRT-PCR引物（表1），按照2×SYBR® Green qPCR SuperMix（北京艾德莱生物科技有限公司）说明书进行qRT-PCR试验，每个试验3次重复，利用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。使用TBtools软件作差异表达基因热图[17]。使用GraphPad Prism 8.0.2软件制作基因相对表达量柱状图。
表 1 qRT-PCR基因及引物Table 1. Genes and primers for qRT-PCR基因
Gene正向引物
Forward primer (5'-3')反向引物
Reverse primer (5'-3')CSS0007745 CCAAGAGTGTGGAAGGGTATG CAGAGGGAGGCCAAATCTTATG CSS0013831 CATTGCTTCTTGGCCCTACTA TGACAGTGCCATCACCATAAA CSS0038049 GATGCCATGGCTTATGGATTTG GACCTATGCGGTAGACAGTTTC CSS0008562 AGTGCCTCATCAACCATCAC AGGAAGAAGAAGAGGAGGTAGAG CSS0042430 GAGACTCAGAGGACTCGAAAGA CAGACTCGGACGCCTTTATG CSS0005594 AATATGGGTGCCGGGTATTG TCTTCTCCTCCGATGGTACTT CsEF1（KA280301.1） TTGGACAAGCTCAAGGCTGAACG ATGGCCAGGAGCATCAATGACAGT 2. 结果与分析
2.1 转录组测序分析
2.1.1 转录组数据的质量评估及质控分析
对感病叶和健康叶各3次重复共6个样本进行转录组测序，结果表明，相同生物学重复样本间的Pearson相关系数R2在0.995～1.000，不同生物学重复样本间的R2在0.979～0.989 （图1A），说明相同生物学重复样本间相关性较好。主成分分析（PCA）结果表明，第一主成分（PC1）能解释总方差的34.23%，第二主成分（PC2）能解释总方差的17.28%，两者可以明显区分不同组别的样本（图1B）。原始测序数据经过质量控制分析，共得到
244595498 Clean reads，每个样本获得的Clean reads范围为4010 万～4114 万条，样本平均Clean bases约为6.10 G，Q20的范围为98.48%～98.87%，Q30的范围为95.89%～96.54%，GC含量范围为44.84%～45.42%。各样品的Reads与参考基因组的比对效率范围为87.80%～88.20%（表2）。这些结果显示样本测序数据可以满足后续的生物信息学分析要求。![]()
图 1 样本相关性热图及各样本间的主成分分析A：转录组样本相关性热图；B：转录组各样本间的主成分分析；C：代谢组样本相关性热图；D：代谢组各样本间的主成分分析。Figure 1. Heatmap of Pearson correlation between samples and principal component analysis on samplesA: heatmap of Pearson correlation between transcriptome samples; B: principal component analysis on transcriptome samples; C: heatmap of Pearson correlation between metabolome samples; D: principal component analysis on metabolome samples.表 2 样本测序数据的质量控制分析Table 2. Quality control for transcriptome sequencing样本
Sample过滤序列
Clean reads过滤碱基
Clean bases/GQ20/% Q30/% GC含量
GC Content /%匹配序列（比对效率/%）
Mapped reads (Efficiency/%)CK1 40107608 6.00 98.87 96.51 45.31 35374239 (88.20)CK2 40805448 6.10 98.72 96.33 45.11 35890315 (87.95)CK3 40738514 6.10 98.48 95.89 44.84 35837746 (87.97)TB1 41033002 6.14 98.77 96.24 45.42 36088623 (87.95)TB2 40766338 6.10 98.87 96.54 45.25 35886380 (88.03)TB3 41144588 6.16 98.71 96.28 45.21 36124713 (87.80)总计 Total 244595498 36.59 2.1.2 差异表达基因分析
通过比较健康样品（CK）和感染茶饼病样品（TB）的基因表达情况，共筛选到
1009 个差异表达基因（DEGs），其中上调表达的DEGs有526个，占52.1%，下调表达的DEGs有483个，占47.9%（图2）。2.1.3 GO和KEGG富集分析
对被注释到相应GO二级节点的765个DEGs分析发现，共有709个GO条目富集到生物学过程（biological process），其中有73个GO条目显著富集，DEGs主要涉及“细胞壁大分子分解代谢过程（cell wall macromolecule catabolic process）” “几丁质分解代谢过程（chitin catabolic process）” “对过氧化氢的响应（response to hydrogen peroxide）” “对氧化胁迫的响应（response to oxidative stress）” “对活性氧的响应（response to reactive oxygen species）” “细胞壁组织（cell wall organization）” “细胞壁生物合成（cell wall biogenesis）” “木葡聚糖代谢过程（xyloglucan metabolic process）” “基于微管的运动（microtubule-based movement）” “纤维素生物合成过程（cellulose biosynthetic process）”及“蛋白激酶活性的活化（activation of protein kinase activity）”等生物学过程（图3A）。共有165个GO条目富集到细胞组分（cellular component），其中有6个GO 条目显著富集，DEGs主要涉及“质外体（apoplast）” “微管（microtubule）” “细胞壁（cell wall）” “核小体（nucleosome）” “植物型细胞壁（plant-type cell wall）”和“宿主细胞核（host cell nucleus）”等细胞组分（图3B）。共有329个GO 条目富集到分子功能（molecular function），其中有22个GO条目显著富集，DEGs主要涉及“几丁质酶活性（chitinase activity）” “转移除氨基酰基以外的酰基转移酶活性（transferase activity, transferring acyl groups other than amino-acyl groups）” “微管结合（microtubule binding）”“纤维素合酶（形成UDP）活性[cellulose synthase (UDP-forming) activity]”“血红素结合（heme binding）” “氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）” “微管肌动活性（microtubule motor activity）” “蛋白质异源二聚化活性（protein heterodimerization activity）”“木葡聚糖:木葡基转移酶活性（xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity）”和“对苯二酚:氧氧化还原酶活性（hydroquinone: oxygen oxidoreductase activity）”等分子功能（图3C）。
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图 3 差异表达基因的GO富集分析A：生物学过程；B：细胞组分；C：分子功能。Figure 3. GO enriched analysis on DEGsA: biological process; B: cellular components; C: molecular functions.KEGG代谢通路涉及的生化反应类型中，“代谢（metabolism）”类型占比最大，其中排名前三的途径分别是“苯丙素类生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）” “类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）”和“氨基糖和核苷酸糖代谢（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）”；“遗传信息处理（genetic information processing）”类型占比次之，其以“内质网中的蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum）”途径为主；在“环境信息处理（environmental information processing）”类型中，以“植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）”和“MAPK信号转导（MAPK signaling pathway-plant）”为主；在 “细胞过程（cellular processes）”类型中，以“内吞作用（endocytosis）”为主；在“生物系统（organismal systems）” 类型中，以“植物-病原体互作（plant-pathogen interaction）”为主（图4A）。
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图 4 差异表达基因的KEGG富集分析A：KEGG代谢通路分类统计；B：KEGG前20条显著性富集代谢通路。Figure 4. KEGG enrichment analysis on DEGsA: classification of statistical KEGG metabolic pathways; B: top 20 significantly enriched metabolic pathways of KEGG.根据KEGG 富集分析结果可知，343个差异表达基因参与了102条代谢途径，富集显著性排名前5的通路依次为“类黄酮生物合成”“苯丙素类生物合成”“二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成（stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis）”“甘油酯代谢（glycerolipid metabolism）”和“氨基糖和核苷糖代谢”（图4B），分别富集到21、28、12、14、19个DEGs。富集结果说明茶饼病病原真菌主要对茶树苯丙素生物合成和类黄酮生物合成等次生代谢途径造成了复杂的分子生物学影响，这可能是茶树受到茶饼病真菌侵染的一种应激响应。
2.1.4 茶饼病侵染茶树后的转录因子分析
转录因子通过结合目标基因启动区调控基因的表达，在生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究发现有47个DEGs为转录因子，分别属于21个转录因子家族，其中占比较大的是bHLH、SBP、AP2/ERF-AP2和MYB转录因子家族（图5A），这些转录因子中有20个表达量上调、27个表达量下调（图5B）。
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图 5 茶树感染茶饼病菌后转录因子变化情况A：转录因子类别及数量统计；B：转录因子表达热图。Figure 5. Changes on transcription factors in tea plants infected by E. vexansA: classification and quantity statistics of transcription factors; B: expression heatmap of transcription factors.2.2 代谢组学分析
2.2.1 差异代谢物鉴定
代谢组相同生物学重复样本间的Pearson相关系数R2在0.994～1.000，不同生物学重复样本间的R2在0.963～0.967 （图1C），表明相同生物学重复样本间有较好的相关性。PCA结果表明，PC1能解释总方差的51.63%，PC2能解释总方差的14.42%，两者可以把不同组别的样本明显区分开（图1D）。基于广泛靶向代谢组学分析，茶饼病菌侵染茶树叶片后共检测到939个代谢物，共鉴定出353个差异代谢物（differentially accumulated metabolites, DAMs），其中161个DAMs上调，192个DAMs下调（图6）。
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图 6 CK vs. TB的差异代谢物火山图Figure 6. Volcano maps of differential metabolites in CK and TB2.2.2 差异代谢途径及差异代谢物分析
通过对DAMs进行 KEGG 富集分析发现，有102个DAMs 被注释，占所有代谢物（228个）的44.74%，被富集到71条代谢通路上。KEGG 通路富集显示，差异代谢物主要富集于“类黄酮生物合成”“赖氨酸生物合成（lysine biosynthesis）”和“丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢（alanine, aspartate and glutamate metabolism）”等代谢通路上（图7）。类黄酮生物合成途径中，二氢杨梅素、对香豆酰奎宁酸、根皮素、根皮苷和表没食子儿茶素（EGC）等差异代谢物上调表达，芹菜素、儿茶素（C）、绿原酸、二氢山柰酚、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、柚皮素查耳酮、柚皮苷和花旗松素等差异代谢物下调表达（表3）。
表 3 类黄酮生物合成途径中的差异代谢物Table 3. Differential metabolites of flavonoid biosynthesis编号
Code代谢物名称
Compound差异倍数
Fold changeP值
P value变量重要性投影
VIP差异类型
TypeNEG_q122 二氢杨梅素 Dihydromyricetin 1.10 0.00 1.33 上调 Up NEG_q260 对香豆酰奎宁酸 p-Coumaroyl quinic Acid 1.22 0.00 1.38 NEG_q264 根皮素 Phloretin 1.56 0.02 1.27 NEG_q265 根皮苷 Phlorizin 1.29 0.04 1.28 POS_q141 表没食子儿茶素 Epigallocatechin 1.05 0.02 1.29 NEG_q79 芹菜素 Apigenin 0.65 0.01 1.37 下调 Down NEG_q94 儿茶素没食子酸酯 Catechin Gallate 0.95 0.03 1.30 NEG_q160 没食子儿茶素没食子酸酯 Gallocatechin Gallate 0.95 0.02 1.30 NEG_q145 表儿茶素没食子酸酯 Epicatechin Gallate 0.73 0.01 1.27 NEG_q92 儿茶素 Catechin 0.65 0.00 1.38 NEG_q98 绿原酸 Chlorogenic Acid 0.68 0.00 1.36 NEG_q120 二氢山柰酚 Dihydrokaempferol 0.57 0.00 1.35 NEG_q158 没食子儿茶素 Gallocatechin 0.91 0.01 1.32 NEG_q240 柚皮素查耳酮 Naringenin Chalcone 0.66 0.00 1.38 NEG_q241 柚皮苷 Naringin 0.76 0.00 1.32 NEG_q307 花旗松素 Taxifolin 0.80 0.00 1.35 如图8所示，显著性上调的前10个差异代谢物分别为金圣草（黄）素（chrysoeriol）、α-菠菜甾醇（alpha-Spinasterol）、4-萜品醇（terpinen-4-ol）、水苏糖（stachyose）、3-羟基苯基脲（3-hydroxyphenylurea）、大马酮（damascenone）、氧化石竹烯（caryophyllene Oxide）、克罗坦辛（crotanecine）、异牧荆素（saponaretin）和11-酮-β-乳香酸（11-Keto-Beta-Boswellic Acid）；显著性下调的前10个差异代谢物分别为海松酸（pimaric acid）、异蒲勒醇（isopulegol）、异毛蕊花糖苷（isoacteoside）、异坡罗定（isoporoidine）、莪术二酮（curdione）、杨梅苷（myricitrin）、3-羟基-4',5-二甲氧基二苯乙烯（3-hydroxy-4'，5-dimethoxystilbene）、神经酰胺（Cer）、异海松酸（isopimaric Acid）和阿福豆（afzelin）。
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图 8 前20个差异代谢物差异倍数柱状图Figure 8. Histogram of changes on top 20 differential metabolites2.3 转录组学和代谢组学联合分析
对茶饼病病原菌侵染茶树叶片后的转录组学和代谢组学联合分析，发现共同富集的代谢通路有57条（图9A）。由图9B可知，“类黄酮生物合成”“苯丙素类生物合成”和“二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成”是转录组和代谢物共同富集显著的途径，且这些途径大多与多酚类次生代谢物质的合成与代谢有关。多酚类物质一般具有抑菌作用，这些代谢物和基因可能与茶树响应茶饼病病菌侵染密切相关。
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图 9 转录-代谢KEGG共有富集通路气泡图A：Venn 图；B：代谢通路分析。圆点代表DEGs，三角形代表DAMs。-lg (P value) 越大，富集可信度越高。Figure 9. Bubble diagram of enriched pathways shared by transcriptome and metabolome through KEGG analysisA: Venn diagram; B: metabolic pathway analysis. Triangles are DEGs; dots are DAMs. Bigger -lg (P value) indicates greater reliable enrichment.对转录代谢共同富集显著的“苯丙素类生物合成”和“类黄酮生物合成”两条途径关键的20个DEGs和15个DAMs 绘制网络图（图10）。TB样品中编码4-香豆酸辅酶A连接酶（p-coumaroyl: CoA ligase, 4CL）、莽草酸O-羟基肉桂酰基转移酶（shikimate O-hydroxycinnamoyl transferase, HCT）、二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase, DFR）和花青素合成酶（anthocyanidin synthase, ANS）的部分基因表达量上调，如CSS0011741（4CL）、CSS0002940（DFR）、CSS0015968（DFR）和CSS0010687（ANS）等。而编码无色花青素还原酶（leucoanthocyanidin reductase, LAR）的基因表达量下调，如CSS0013831（LAR）。4CL催化对香豆酸（p-coumaric acid acid）合成对香豆酰辅酶A（p-coumaroyl-CoA），通过一系列酶催化合成根皮素、根皮苷。对香豆酰辅酶A经HCT催化合成对香豆酰奎宁酸，进一步经HCT催化合成咖啡酰奎宁酸（caffeoyl quinic acid）。对香豆酰辅酶A也可以通过相应的酶转化为二氢槲皮素（dihydroquercetin），经DFR催化合成无色花青素（leucocyanidin），再经一系列酶催化合成芍药素-3-O-葡萄糖苷（peonidin 3-O-glucoside），无色花青素在LAR的催化下合成儿茶素。二氢槲皮素经二氢杨梅素在DFR和ANS等一系列酶催化下合成表没食子儿茶素，在DFR和LAR催化下合成没食子儿茶素。TB样品中酚类化合物根皮素、根皮苷、4-羟基苯乙烯（4-hydroxystyrene）、对香豆酰奎宁酸、二氢杨梅素、表没食子儿茶素和芍药素-3-O-葡萄糖苷含量增加，而儿茶素和没食子儿茶素含量降低。TB样品中芹菜素和柚皮苷积累减少，使柚皮素查尔酮代谢流转向二氢山柰酚代谢途径，并经二氢槲皮素的代谢流分别合成表没食子儿茶素和芍药素-3-O-葡萄糖苷（图10）。以上分析表明，类黄酮代谢途径可能是茶树响应茶饼病病原菌侵染后抗菌的主要次生代谢途径。
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图 10 苯丙素类和类黄酮生物合成途径的关键DEGs和DAMs流程图中红色方框表示TB中的上调代谢物，绿色方框表示TB中的下调代谢物。Figure 10. Key DEGs and DAMs in phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis pathwaysRed boxes represent upregulated, and green boxes, downregulated metabolites in TB.2.4 qRT-PCR验证基因表达
为了验证RNA-Seq试验结果，随机选择其中6个基因进行qRT-PCR分析。包括4个表达上调的基因和2个表达下调的基因，分别为黄酮醇合成酶编码基因（CSS0007745）、无色花青素还原酶编码基因（CSS0013831）、叶锈10抗病基因座受体样蛋白激酶LRK10编码基因（CSS0038049）、转录因子ERF060编码基因（CSS0008562）、转录因子ERF-RAP2-3-like编码基因（CSS0042430）及热激蛋白HSP70编码基因（CSS0005594）。qRT-PCR验证结果如图11所示，这些基因的差异表达趋势与RNA-Seq试验结果一致。
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图 11 部分差异表达基因的qRT-PCR验证分析“*” 和“**”分别代表CK与TB相比差异显著（P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）。Figure 11. qRT-PCR verification on partial DEGs* and ** represent significant differences at P＜0.05 and extremely significant differences at P＜0.01, respectively.3. 讨论与结论
茶饼病病原菌入侵茶树叶片后严重破坏海绵组织细胞壁和细胞膜的完整性，致使叶片细胞逐渐死亡[18]。增强过氧化物酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性可以增强茶树对茶饼病的抗性[19]。植物中不存在几丁质，却含有大量的几丁质酶，几丁质酶能水解几丁质形成可溶性寡聚物，感病早期，植物利用几丁质酶水解真菌细胞壁的几丁质，从而抑制真菌生长[20−22]。本研究通过GO 富集分析表明，差异基因参与了细胞壁代谢及调控几丁质酶活性、氧化还原酶活性和木葡聚糖：木葡基转移酶活性。因此，叶片中细胞壁代谢变化可能是茶树应答病原真菌的一种方式，合成的几丁质酶能有效防控真菌性病害。Chen等[23]研究发现叶锈10抗病基因座受体样蛋白激酶的转录水平在香蕉（Musa acuminata）抗枯萎病菌（Fusarium oxysporum）后代中快速上调，但在易感后代中不上调。本研究也发现编码该蛋白的基因LRK10在茶树感染茶饼病后表达上调，暗示其在抗茶饼病中发挥重要作用。
相关研究表明，CsWRKY14通过参与SA信号转导途径提高茶树对茶饼病的抗性[24,25]。Singh等[9]发现WRKY基因参与了茶树防御茶饼病的反应。Chen等[26]在研究炭疽病病原菌(Colletotrichum fructicola)侵染茶树后也发现茶树WRKY基因表达被激活。Fick等[27]发现鳄梨（Persea americana）感染樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）后，MYB、WRKY和AP2/ERF转录因子调节生长和防御相关基因表达。本研究发现转录因子HB-HD-ZIP、Trihelix、WRKY、MYB、AP2/ERF、C2C2、SBP、NAC家族的部分成员在感茶饼病叶片中上调表达，如转录因子ERF060（CSS0008562）和ERF-RAP2-3-like（CSS0042430）等，表明这些转录因子在茶树抗茶饼病过程中发挥重要调控作用。
大多数植物可以通过苯丙烷代谢途径合成黄酮类（也称类黄酮）次生代谢产物来防御病原菌入侵[28]。酚类和类黄酮物质的积累增强了葡萄和草莓对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的抗性[29]，类黄酮物质在感染白粉病（Sphaerotheca fuliginea）的黄瓜抗性品种中含量增加[30]。在本研究中，茶树感染茶饼病后，叶片中的类黄酮含量显著增加，与苯丙素和类黄酮合成相关基因的表达也显著上调，表明苯丙素化合物的代谢可能激活茶树对茶饼病的抗性。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，属于黄酮类中的二氢查耳酮类物质，能抗苹果黑星病、火疫病和灰霉病等多种病原菌[31]。本研究发现，茶树感染茶饼病后其叶片中根皮素和根皮苷含量增加，这可能与其防御茶饼病病原菌有关。
根据杂环C环的变化，黄酮类化合物可分为查尔酮、黄酮类、异黄酮类、黄烷醇类和花青素等类型[32]。DFR催化二氢槲皮素生成无色花青素，无色花青素经LAR催化形成儿茶素，经ANS催化形成花青素，而花青素经过花青素还原酶进一步催化合成表型儿茶素[33]。张琦琦[34]研究发现茶饼病菌入侵使茶树鲜叶茶多酚总量下降，儿茶素 EGCG、ECG、C、GC含量下降，CG 含量上升。而本研究结果显示，茶树叶片感染茶饼病后GCG、CG、ECG、C、GC 含量下降，EGC含量上升，部分儿茶素含量变化与本研究结果不一致，产生这种差异的原因有待进一步研究。
综上所述，通过转录组联合代谢组分析发现，差异基因和差异代谢物主要富集在类黄酮生物合成途径，此途径中关键基因的表达和代谢物差异与茶树响应茶饼病病原菌侵染有关，由苯丙素和类黄酮合成途径共筛选到20个相关基因，其中CSS0011741（4CL）、CSS0002940（DFR）、CSS0015968（DFR）、CSS0010687（ANS）对EGC的生物合成具有潜在的正向调控作用，这些基因及LRK10（CSS0038049）、ERF060（CSS0008562）、ERF-RAP2-3-like（CSS0042430）等可作为候选基因开展后续的基因功能和抗病调控机制研究。
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图 1 样本相关性热图及各样本间的主成分分析
A：转录组样本相关性热图；B：转录组各样本间的主成分分析；C：代谢组样本相关性热图；D：代谢组各样本间的主成分分析。
Figure 1. Heatmap of Pearson correlation between samples and principal component analysis on samples
A: heatmap of Pearson correlation between transcriptome samples; B: principal component analysis on transcriptome samples; C: heatmap of Pearson correlation between metabolome samples; D: principal component analysis on metabolome samples.
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图 3 差异表达基因的GO富集分析
A：生物学过程；B：细胞组分；C：分子功能。
Figure 3. GO enriched analysis on DEGs
A: biological process; B: cellular components; C: molecular functions.
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图 4 差异表达基因的KEGG富集分析
A：KEGG代谢通路分类统计；B：KEGG前20条显著性富集代谢通路。
Figure 4. KEGG enrichment analysis on DEGs
A: classification of statistical KEGG metabolic pathways; B: top 20 significantly enriched metabolic pathways of KEGG.
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图 5 茶树感染茶饼病菌后转录因子变化情况
A：转录因子类别及数量统计；B：转录因子表达热图。
Figure 5. Changes on transcription factors in tea plants infected by E. vexans
A: classification and quantity statistics of transcription factors; B: expression heatmap of transcription factors.
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图 6 CK vs. TB的差异代谢物火山图
Figure 6. Volcano maps of differential metabolites in CK and TB
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图 8 前20个差异代谢物差异倍数柱状图
Figure 8. Histogram of changes on top 20 differential metabolites
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图 9 转录-代谢KEGG共有富集通路气泡图
A：Venn 图；B：代谢通路分析。圆点代表DEGs，三角形代表DAMs。-lg (P value) 越大，富集可信度越高。
Figure 9. Bubble diagram of enriched pathways shared by transcriptome and metabolome through KEGG analysis
A: Venn diagram; B: metabolic pathway analysis. Triangles are DEGs; dots are DAMs. Bigger -lg (P value) indicates greater reliable enrichment.
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图 10 苯丙素类和类黄酮生物合成途径的关键DEGs和DAMs
流程图中红色方框表示TB中的上调代谢物，绿色方框表示TB中的下调代谢物。
Figure 10. Key DEGs and DAMs in phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis pathways
Red boxes represent upregulated, and green boxes, downregulated metabolites in TB.
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图 11 部分差异表达基因的qRT-PCR验证分析
“*” 和“**”分别代表CK与TB相比差异显著（P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）。
Figure 11. qRT-PCR verification on partial DEGs
* and ** represent significant differences at P＜0.05 and extremely significant differences at P＜0.01, respectively.
表 1 qRT-PCR基因及引物
Table 1 Genes and primers for qRT-PCR
基因
Gene正向引物
Forward primer (5'-3')反向引物
Reverse primer (5'-3')CSS0007745 CCAAGAGTGTGGAAGGGTATG CAGAGGGAGGCCAAATCTTATG CSS0013831 CATTGCTTCTTGGCCCTACTA TGACAGTGCCATCACCATAAA CSS0038049 GATGCCATGGCTTATGGATTTG GACCTATGCGGTAGACAGTTTC CSS0008562 AGTGCCTCATCAACCATCAC AGGAAGAAGAAGAGGAGGTAGAG CSS0042430 GAGACTCAGAGGACTCGAAAGA CAGACTCGGACGCCTTTATG CSS0005594 AATATGGGTGCCGGGTATTG TCTTCTCCTCCGATGGTACTT CsEF1（KA280301.1） TTGGACAAGCTCAAGGCTGAACG ATGGCCAGGAGCATCAATGACAGT 
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表 2 样本测序数据的质量控制分析
Table 2 Quality control for transcriptome sequencing
样本
Sample过滤序列
Clean reads过滤碱基
Clean bases/GQ20/% Q30/% GC含量
GC Content /%匹配序列（比对效率/%）
Mapped reads (Efficiency/%)CK1 40107608 6.00 98.87 96.51 45.31 35374239 (88.20)CK2 40805448 6.10 98.72 96.33 45.11 35890315 (87.95)CK3 40738514 6.10 98.48 95.89 44.84 35837746 (87.97)TB1 41033002 6.14 98.77 96.24 45.42 36088623 (87.95)TB2 40766338 6.10 98.87 96.54 45.25 35886380 (88.03)TB3 41144588 6.16 98.71 96.28 45.21 36124713 (87.80)总计 Total 244595498 36.59
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表 3 类黄酮生物合成途径中的差异代谢物
Table 3 Differential metabolites of flavonoid biosynthesis
编号
Code代谢物名称
Compound差异倍数
Fold changeP值
P value变量重要性投影
VIP差异类型
TypeNEG_q122 二氢杨梅素 Dihydromyricetin 1.10 0.00 1.33 上调 Up NEG_q260 对香豆酰奎宁酸 p-Coumaroyl quinic Acid 1.22 0.00 1.38 NEG_q264 根皮素 Phloretin 1.56 0.02 1.27 NEG_q265 根皮苷 Phlorizin 1.29 0.04 1.28 POS_q141 表没食子儿茶素 Epigallocatechin 1.05 0.02 1.29 NEG_q79 芹菜素 Apigenin 0.65 0.01 1.37 下调 Down NEG_q94 儿茶素没食子酸酯 Catechin Gallate 0.95 0.03 1.30 NEG_q160 没食子儿茶素没食子酸酯 Gallocatechin Gallate 0.95 0.02 1.30 NEG_q145 表儿茶素没食子酸酯 Epicatechin Gallate 0.73 0.01 1.27 NEG_q92 儿茶素 Catechin 0.65 0.00 1.38 NEG_q98 绿原酸 Chlorogenic Acid 0.68 0.00 1.36 NEG_q120 二氢山柰酚 Dihydrokaempferol 0.57 0.00 1.35 NEG_q158 没食子儿茶素 Gallocatechin 0.91 0.01 1.32 NEG_q240 柚皮素查耳酮 Naringenin Chalcone 0.66 0.00 1.38 NEG_q241 柚皮苷 Naringin 0.76 0.00 1.32 NEG_q307 花旗松素 Taxifolin 0.80 0.00 1.35
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