Responses of Tea Plants to Blister Blight Analyzed Using Transcriptome and Metabolome
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摘要:目的
探明茶树对茶饼病菌的抗性分子机制，挖掘抗病相关基因，为茶树抗性育种提供依据。
方法通过转录组测序和代谢组分析，比较茶树健康叶片（CK）和感染茶饼病的叶片（TB）中的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）和差异代谢物（differentially accumulated metabolites, DAMs）。
结果转录组数据显示，样品CK和TB之间共有
1009 个 DEGs；GO 富集分析表明，差异基因参与了细胞壁代谢及调控几丁质酶活性、氧化还原酶活性和木葡聚糖：木葡基转移酶活性；KEGG 代谢途经分析表明，DEGs显著富集在“类黄酮生物合成”“苯丙素生物合成”“氨基糖和核苷糖代谢”“甘油酯代谢”和“二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成”途径；DEGs 中包含47个转录因子，分属21个转录因子家族，主要包括bHLH、SBP、AP2/ERF-AP2和MYB等，这些转录因子可能是茶树抵御茶饼病侵染过程中重要的调控基因。利用广泛靶向代谢组学技术分析，共发现353个DAMs，DAMs主要富集于“类黄酮生物合成”“赖氨酸生物合成”和“丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢”途径。利用转录组联合代谢组分析发现，显著共同富集的途径是“类黄酮生物合成”“苯丙素生物合成”和“二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚生物合成”；筛选了与苯丙素类及类黄酮生物合成途径相关的20个DEGs和15个DAMs，其中，CSS0011741（4CL）、CSS0002940（DFR）、CSS0015968（DFR）和CSS0010687（ANS）等DEGs在感病叶中上调表达，根皮素、根皮苷、4-羟基苯乙烯、对香豆酰奎宁酸、二氢杨梅素、表没食子儿茶素和芍药素-3-O-葡萄糖苷等DAMs在感病叶中积累。结论“苯丙素类生物合成”和“类黄酮生物合成”等代谢途径中的 DEGs在茶树响应茶饼病侵染中发挥重要作用，根皮素、根皮苷以及表没食子儿茶素等DAMs可能是茶树抵御茶饼病侵染的重要次生代谢产物。
Abstract:ObjectiveResistance mechanism and associated genes of tea plants in response to blister blight infection were studied based on transcriptome as well as metabolome.
MethodsDifferentially expressed genes (DEGs) and differentially accumulated metabolites (DAMs) in leaves of healthy (CK) and blister blight-infected (TB) tea plants were compared by using both transcriptome and metabolome.
ResultsBetween CK and TB, 1 009 DEGs associated with the cell wall metabolism and the regulations of chitinase, oxidoreductase, and xyloglucan:xyloglucanosyltransferase activities were identified by a GO enrichment analysis. The KEGG analysis showed the DEGs significantly enriched in the pathways of flavonoid biosynthesis, phenylpropanoid biosynthesis, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, glycerolipid metabolism, and stilbenoid, diarylheptanoid, and gingerol biosynthesis. Forty-seven transcription factors in the DEGs, which belonged to 21 transcription factor families including bHLH, SBP, AP2/ERF-AP2, and MYB, might be the genes significantly involved in the resistance of a tea plant to blister blight. The 353 DAMs identified by using the widely targeted metabolomics were enriched mainly in the flavonoid biosynthesis and lysine biosynthesis as well as the alanine, aspartate, and glutamate metabolism pathways. The transcriptome and metabolome revealed significant co-enrichments in the flavonoid biosynthesis, phenylpropanoid biosynthesis, and stilbenoid, diarylheptanoid, and gingerol biosynthesis pathways. Among the selected 20 DEGs and 15 DAMs associated with the phenylpropanoids and flavonoids biosynthesis pathways, DEGs such as CSS0011741（4CL）, CSS0002940（DFR）, CSS0015968（DFR）, and CSS0010687（ANS） were upregulated, while DAMs such as phloretin, phlorizin, 4-Hydroxystyrene, p-Coumaroyl quinic acid, dihydromyricetin, epigallocatechin, and peonidin 3-O-glucoside were accumulated in the infected leaves.
ConclusionThe DEGs in the phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis pathways might play a crucial role in the response of tea plants to blister blight. And the DAMs, such as phloretin, phlorizin, and epigallocatechin, might be the secondary metabolites in tea plants that participated closely in the resistance mechanism.
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0. 引言
【研究意义】双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一种草腐生食用菌，在分类上属于担子菌门（basidiomycete），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），因其味道鲜美，营养丰富，深受人们的喜爱，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌[1]。双孢蘑菇的产量和品质依赖于优质的培养料，而优质的培养料离不开高质量的堆制发酵原料和正确的堆制发酵方法。培养料通过二次发酵，质量比常规发酵明显提高[2]，播种后菌丝吃料快、结菇早、转潮快、菇质好、病虫害发生轻，特别适用于老菇房或大面积的基地栽培[3]。二次发酵技术的应用，使培养料充分腐熟，改善了培养料的理化性状，为双孢蘑菇的优质、高效生产提供了有利条件[4]。其中培养料的发酵是在微生物的作用下将培养原料中各种化学物质分解转化的过程，为双孢蘑菇菌丝的生长制造出一个高度适合的选择性基质， 因此培养料中微生物类群与丰度直接决定了培养料的质量[5-6]。【前人研究进展】近年来，高通量16s rDNA测序被广泛应用于分析和鉴定微生物的种类和多样性[7]。李云福等[8]利用16S rDNA测序，对双孢蘑菇不同发酵阶段的细菌群落特征进行了分析，发现微生物种类和数量在二次发酵中最高，而且生物群落结构呈现连续变化的规律。隽加香等[9]的研究发现二次料和三次料的细菌群落的丰富度和多样性均高于一次料，其中二次料中假黄单胞菌属Pseudomonas和高温多孢菌属Thermopolyspora丰度较高。然而由于目前常用的Illumina HiSeq/MiSeqd 16S rDNA 测序读长的限制，只能对其中某几个高变区进行测序分析，在物种分类鉴定准确度上难以达到一代测序的水平[10]。三代测序技术的高通量、长读长（＞10 kb）和无GC碱基偏好性等优势弥补了二代测序的不足，可以不需要分离培养，即可获得群落中所有微生物的全长16S rDNA信息，实现更精准的物种分类和鉴定，更可靠的实验重复性和更稳定的结果 [11]。【本研究切入点】目前双孢蘑菇培养料一般都是以稻草为原料，采用发酵培养料栽培技术，制作培养料时主要还是经验性管理为主，因此培养料发酵质量稳定性不足，影响栽培成功率，对生产稳定性不利。利用优化的复合菌渣作为培养料培养双孢蘑菇具有省工、省时、操作简单、降低成本、效益等优势，但其再发酵过程中微生物群落组成及变化情况有待深入探讨。【拟解决的关键问题】利用三代测序技术 PacBio 全长测序平台，并使用优化的复合菌渣（金针菇和杏鲍菇菌渣）作为培养料的主要成分，探究双孢蘑菇培养料不同发酵过程中细菌的群落组成和动态变化，明确其对培养料的发酵产生的作用，为改善培养料的发酵质量提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
栽培双孢蘑菇的培养料配方：24%牛粪，49%金针菇废料，24%杏鲍菇废料，1%轻质碳酸钙，1%豆粕，1%石灰（干物质占比）。建堆发酵前，提前将牛粪、金针菇废料、杏鲍菇废料建堆预湿；将牛粪、金针菇废料、杏鲍菇废料，根据生产计划，用铲车按比例采用三明治堆叠方式投料，并根据情况判断是否需要再补水，堆积发酵5 d。用抛料机进行抛料建堆，堆高约1.5～1.8 m，堆宽约5～6 m，长约25 m，调节料堆含水量至65%～68%，让料堆室外露天自然升温发酵；根据间隔7、6、5、4 d翻堆一次，翻堆时尽量让料内外翻动均匀。在这期间，第3次翻堆时添加石灰，第4次翻堆时添加豆粕、碳酸钙，翻堆时若料堆含水量偏低，应补水至65%～68%。
1.2 样品收集
物料混匀建堆，一直到进菇床前，期间依据生产工艺添加辅料，并根据料堆情况补水，一次发酵采用自然升温发酵，二次发酵为蒸汽巴氏消毒。
取样时期：Ⅰ：培养料预发酵后；Ⅱ：培养料堆积发酵第1次翻堆后；Ⅲ：培养料堆积发酵第2次翻堆后；Ⅳ：培养料堆积发酵第3次翻堆后；Ⅴ：培养料堆积发酵第4次翻堆后；Ⅵ：培养料二次发酵蒸汽巴氏消毒后；Ⅶ：培养料二次发酵全过程结束后。
取样方法为在料堆上、中、下 3层取样，每层平均取 3 个点，每个点取样200 g，将所有样品混匀后采用四分法，分装后立即干冰存放。取样物品用前要灭菌消毒，全程带无菌手套。每个时期的样品取6次重复。用于理化指标分析的样品，需鲜样测定的如pH、水分等参数在实验室当天测定，其余参数待取样后进行样品风干处理保存（风干样1 kg）后测定（表1）。
表 1 培养料理化指标Table 1. Physiochemical indicators of substrate编号
Sample ID取样时期
Sampling period干重
Dry weight/g水分
MoisturepH Ag1 建堆 47.07 73.92% 5.16 Ag2 一次翻堆 50.00 71.85% 5.35 Ag3 二次翻堆 50.48 72.26% 5.66 Ag4 三次翻堆 34.8 71.58% 5.55 Ag5 四次翻堆 52.24 71.56% 6.71 Ag6 二次发酵巴氏消毒结束 28.42 66.50% 8.36 Ag7 二次发酵全过程结束 43.95 62.08% 7.64 1.3 DNA提取及建库测序
采用PowerSoil® DNA Isolation Kit对不同阶段的发酵料堆培养基进行总DNA提取。使用NanoDrop 微量分光光度计对DNA浓度进行检测。提取样品总 DNA 后，根据全长引物序列合成带有 Barcode 的特异引物，进行 PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRT Bell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用PacBio Sequel 进行测序。通过PacBio Sequel 的CCS自我矫正模式获得高质量的测序数据。
1.4 生物信息学分析
从原始数据中导出 CCS 序列，对 CCS 序列进行 Barcode 识别，长度过滤，去除嵌合体，得到高质量的扩增子序列。使用Usearch软件[12]对序列在97.0%的相似度水平下进行聚类、获得操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU），并统计每个 OTU的丰度。以SILVA[13]为参考数据库使用朴素贝叶斯分类方法对特征序列进行分类学注释，得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平（门phylum、属genus、种species）统计各样品群落组成，利用QIIME（v1.8.0）软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图。对单个样品中物种进行 Alpha 多样性分析，包括ACE、Chao1、PD_whole_tree、Shannon及Simpson指数。ACE、Chao1指数越大，表明群落的丰富度越高；PD_whole_tree、Shannon和Simpson指数越高，表明群落多样性越高。使用QIIME软件进行 Beta 多样性（Beta diversity）分析，比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。
2. 结果与分析
2.1 测序数据评估及OUT分析
通过对不同样品的全长转录组测序，共获得314167条高质量的序列，每个样品至少产生 6 643 条序列，平均每个样品为 7 480 条序列，其中测序长度约为1.4 kb。每个时期的样本通过聚类得到OUT的平均数目分别为328、340、294、377、364、166、174个，共计715个，其中有161个 OTUs 存在于发酵的整个过程中。根据稀释曲线（Rarefaction）来评价样品的取样深度（图1），随着样品数量的增加，能检测到的物种数量逐渐增加，最后曲线末端上升趋势趋于平缓，说明样本量足够，本次测序结果可以代表不同发酵过程中细菌群落真实情况。
2.2 Alpha多样性分析
Alpha多样性指数（ACE、Chao1、PD_whole_tree、Shannon、Simpson）的统计和组间差异性统计检验表明（图2），ACE、Chao1、PD_whole_tree、Shannon指数在不同阶段的样品中存在显著性差异，其中在Ag4、Ag5阶段培养料中细菌物种的丰度和多样性显著高于其他阶段，Ag6、Ag7阶段物种的丰度和多样性较低。这些结果表明，由建堆到第一次发酵过程中细菌物种的数量和多样性在逐渐增加，而在经历了高温巴氏消毒后会明显杀死或抑制部分细菌的增殖，进而显著降低细菌物种的数量和多样性。
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图 2 Alpha多样性指数组间差异柱状图A−B：不同样品的ACE和Chao1指数，纵坐标表示样品中的OUT数目；C−E: 不同样品的PD_whole_tree，Shannon和Simpson指数，纵坐标表示样品中物种多样性。*. 差异显著 (P＜0.05)； **. 差异极显著 (P＜0.01)。Figure 2. Histogram of alpha diversity indexA-B: ACE and Chao1 indices of sample, Y-axis for number of OUT; C-E: PD_whole_tree and Shannon and Simpson indices of sample, respectively, Y-axis for species diversity; *: Significant difference at P＜0.05; **: Extremely significant difference at P＜0.01.2.3 Beta多样性分析
Beta多样性是比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。通过PCA分析图可以看出（图3），根据 Beta 多样性的主坐标分析显示， 主成分因子 1（ PC1）和主成分因子 2（PC2）的贡献率分别为37.16%和 15.20%，其中明显可以看出Ag7阶段样本间的差异较小，其次是Ag6，而在Ag1、Ag2、Ag3、Ag4、Ag5阶段的样本差异较大。这些结果表明在建堆到完成一次发酵的过程中，细菌的种类和数据会迅速增加，导致不同样品间物种多样性逐渐产生差异。随着高温巴氏消毒后，杂菌大量死亡，嗜热微生物大量繁殖消耗了易于降解的碳源，也会抑制其他细菌的增殖，进而导致Ag6和Ag7阶段细菌种类的减少以及样本间差异的缩小。
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图 3 Beta 多样性的主坐标分析(PCoA)Figure 3. Principal coordinate analysis plot of beta diversity scores2.4 微生物门、属、种分类水平上的组成与丰度
在门水平分析双孢蘑菇培养料发酵不同阶段样品菌群的组成和结构（图4），共注释到21个细菌门类。其中，Fimicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门），Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）是最主要的4个门，并在不同的发酵阶段有明显的变化。厚壁菌门在各阶段都占有绝对优势，在不同发酵阶段其相对丰度分别为 72.63% 、47.21%、78.77% 、59.63%、70.16%、81.11%、49.30%。其次是变形菌门，在各阶段的平均相对丰度为17.41%、39.96%、12.68%、11.66%、10.36%、5.97%、15.03%。拟杆菌门的相对丰度为4.72%、10.83%、4.49%、24.82%、15.80%、0.41%、4.81%。芽单胞菌门的相对丰度为2.55%、0.42%、0.48%、0.90%、1.10%、9.47%、19.09%，而其他细菌种类比例相对较低。这些结果显示，培养料在不同发酵过程的菌落结构中，厚壁菌门、变形菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门为主要优势菌群，而其他细菌类群为非优势菌群。发酵过程中的优势细菌种群存在显著演替，在第二次发酵后Ag7阶段芽单胞菌门和放线菌门相对丰度明显增加（19.09%和6.33%），同时酸杆菌门的相对丰度在二次发酵后也有较高的提升，因此这3个菌可以作为二次发酵阶段的标记菌群。
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图 4 在门水平细菌群落的相对丰度Figure 4. Relative abundance of microbial communities at phylum level分析各样品在属分类水平上菌群的组成和结构（图5） ，共注释到299个属。Ureibacillus（解脲芽孢杆菌属) 是属水平优势菌群，在第一次发酵各阶段占比较高，相对丰度依次为18.80%，13.64%，36.40%，17.23%、17.13%，在之后的Ag6和Ag7阶段其丰度逐渐降低为5.01%、0.44%，该菌种可作为第一次发酵中后期，即Ag3和Ag4阶段的标记物种。其次是两类不能培养菌属uncultured_bacterium_f_Limnochordaceae和uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group，相对丰度为12.90%/2.54%，0.53%/0.40%、0.29%/0.43%、0.86%/0.88%、0.72%/1.07%、17.11%/9.43%、23.99%/18.96%，特别在二次发酵中其相对丰度显著升高，转变为优势类群。研究还发现Thermobacillus（嗜热杆菌属） 在二次发酵Ag6和Ag7阶段中相对丰度也会显著升高，达到了6.29%和17.08%，这可能是巴氏消毒后为嗜热微生物提供适宜的生长环境。同时在样品中还检测到其他菌属Ruminiclostridium（瘤胃梭菌属），Bacillus（芽孢杆菌属），Thermobacillus（嗜热杆菌属），Caproiciproducens，Rikenellaceae_RC9_gut_group等，均属于厚壁菌门。
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图 5 在属水平细菌群落的相对丰度Figure 5. Relative abundance of microbial communities at genus level分析各样品在种分类水平上菌群的组成和结构（图6) ，共注释到399个种。
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图 6 在种水平细菌群落的相对丰度Figure 6. Relative abundance of microbial communities at species levelUreibacillus thermophilus和Ureibacillus terrenus是种水平优势菌种，属于解脲芽孢杆菌属，相对丰度依次为18.80%/3.78%、13.64%/2.98%、36.40%/10.76%、17.23%/2.59%、17.13%/3.97%、5.01%/4.88%和0.44%/0.22%，在第一次发酵各阶段占比较高，而在第二次发酵过程中其丰度逐渐降低，这和属水平的结果相一致。而且uncultured_bacterium_of_Limnochordaceae、uncultured_bacterium_c_S0134_terrestrial_group和uncultured_bacteriumg_Thermbacillus在第二次发酵中相对丰度有明显升高（Ag7阶段），分别达到了23.99%，18.96%和16.34%，可以作为二次发酵阶段的标记菌种。同时还检测到了uncultured_bacterium_g_Rikenellaceae_RC9_gut_group、Clostridium_sp，uncultured_bacterium_g_Caproiciproducens、uncultured_bacterium_g_Bacillus、uncultured_bacterium_g_Ruminiclostridium等菌种。
3. 讨论与结论
本研究使用16S rDNA 全长测序技术，以复合菌渣作为培养料主要成分，检测双孢蘑菇培养料不同发酵阶段细菌群落结构的特征，共获得314 167条高质量的序列，鉴定了715个有效OTUs， 涵盖21 门299 属399种的细菌。微生物群落的动态变化与培养料中的碳水化合物降解有紧密关系，直接影响培养料的质量和产量[14]。有研究表明，随着培养料发酵的进行，微生物的数量均表现为先下降后上升的规律，其中细菌占比最高[15]。Alpha多样性指数分析结果表明在建堆后细菌物种的数量和多样性在逐渐增加，这可能是在开始阶段培养料中的营养含量丰富，导致杂菌快速增殖，细菌数量升高[16]。随着温度升高，在第二次发酵阶段嗜热微生物会大量繁殖，所以这种高温菌容易成为主导菌群进而抑制其他菌的增殖，导致细菌多样性指数下降[15]。
细菌群落结构分析结果显示，在建堆阶段厚壁菌门和变形菌门丰度最高，与之前报道的结果相一致[8]。在第一次发酵过程中，厚壁菌门丰度变化不大，变形菌门丰度降低而拟杆菌门升高，这说明发酵时间变长可以提高拟杆菌门的丰度。有研究表明，厚壁菌门和拟杆菌门可以通过分解水解酶如β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶来降解碳源[17]。这些结果表明以复合菌渣和稻草作为培养料在发酵过程中的优势菌群组成是一致的。在属水平解脲芽孢杆菌属丰度最高，有研究报道解脲芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阴性嗜热菌，具有非常广的用途，可以产生氨基酸脱氢酶、过氧化氢酶和酯酶等重要酶类，还被用做降解木质纤维素生物质的生物催化剂[18-20]，该属内的Ureibacillus thermophilus和Ureibacillus terrenus菌种在建堆和第一次发酵阶段丰度都相对较高，可能在物质降解过程中发挥重要作用。经过高温巴氏消毒后的第二次发酵阶段，芽单胞菌门的丰度变高，仅次于厚壁菌门，同时发现酸杆菌门的丰度在Ag7阶段显著提高。有研究发现，酸杆菌门的菌种会编码许多纤维素酶和半纤维素酶的基因，会对植物残体降解起到重要作用[21]。本研究发现尿素芽孢杆菌属的丰度在Ag6和Ag7阶段则降低至5.01%、0.44%。同时发现Limnochordaceae、嗜热杆菌属、Ruminiclostridium高温严格厌氧菌属的丰度均变高。高温严格厌氧菌属的菌株多发现于嗜热环境中，是发酵过程中的重要优势菌株[22-23]。有研究报道70 ℃ 以上的高温堆肥中嗜热杆菌属的菌种是主要的降解微生物[24]，该结果也与之前的报道相一致[17]。相比以麦草和稻草为主进行双孢蘑菇堆肥而言，用菇渣堆肥其微生物的优势菌群组成是相似的，但在个别菌群的丰度变化却存在较大的差异[8]。
双孢蘑菇是当前发展前景最好的食用菌类之一，而培养料发酵质量的好坏对后期生产管理、产量与品质影响很大。近年来，利用菌渣替代麦草或稻草秸秆进行双孢蘑菇栽培，不仅原料来源较稻草、麦草易得，且在堆料时省工省时、易于操作。并通过条件和成分组成的优化，证明利用复合菌渣堆制发酵用于栽培双孢蘑菇，也取得了良好的效果[25-26]。而且随着测序技术的发展，通过高通量16S rDNA 全长测序技术可以更全面更准确地对样品中的微生物进行鉴定，在种水平对复合菌渣培养料中微生物的变化规律进行深入研究，推动复合菌渣培养料中有机物降解转化的理论研究，为提高双孢蘑菇培养基质发酵质量，实现双孢蘑菇的优质高产奠定基础。
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图 1 样本相关性热图及各样本间的主成分分析
A：转录组样本相关性热图；B：转录组各样本间的主成分分析；C：代谢组样本相关性热图；D：代谢组各样本间的主成分分析。
Figure 1. Heatmap of Pearson correlation between samples and principal component analysis on samples
A: heatmap of Pearson correlation between transcriptome samples; B: principal component analysis on transcriptome samples; C: heatmap of Pearson correlation between metabolome samples; D: principal component analysis on metabolome samples.
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图 3 差异表达基因的GO富集分析
A：生物学过程；B：细胞组分；C：分子功能。
Figure 3. GO enriched analysis on DEGs
A: biological process; B: cellular components; C: molecular functions.
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图 4 差异表达基因的KEGG富集分析
A：KEGG代谢通路分类统计；B：KEGG前20条显著性富集代谢通路。
Figure 4. KEGG enrichment analysis on DEGs
A: classification of statistical KEGG metabolic pathways; B: top 20 significantly enriched metabolic pathways of KEGG.
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图 5 茶树感染茶饼病菌后转录因子变化情况
A：转录因子类别及数量统计；B：转录因子表达热图。
Figure 5. Changes on transcription factors in tea plants infected by E. vexans
A: classification and quantity statistics of transcription factors; B: expression heatmap of transcription factors.
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图 6 CK vs. TB的差异代谢物火山图
Figure 6. Volcano maps of differential metabolites in CK and TB
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图 8 前20个差异代谢物差异倍数柱状图
Figure 8. Histogram of changes on top 20 differential metabolites
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图 9 转录-代谢KEGG共有富集通路气泡图
A：Venn 图；B：代谢通路分析。圆点代表DEGs，三角形代表DAMs。-lg (P value) 越大，富集可信度越高。
Figure 9. Bubble diagram of enriched pathways shared by transcriptome and metabolome through KEGG analysis
A: Venn diagram; B: metabolic pathway analysis. Triangles are DEGs; dots are DAMs. Bigger -lg (P value) indicates greater reliable enrichment.
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图 10 苯丙素类和类黄酮生物合成途径的关键DEGs和DAMs
流程图中红色方框表示TB中的上调代谢物，绿色方框表示TB中的下调代谢物。
Figure 10. Key DEGs and DAMs in phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis pathways
Red boxes represent upregulated, and green boxes, downregulated metabolites in TB.
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图 11 部分差异表达基因的qRT-PCR验证分析
“*” 和“**”分别代表CK与TB相比差异显著（P＜0.05）和差异极显著（P＜0.01）。
Figure 11. qRT-PCR verification on partial DEGs
* and ** represent significant differences at P＜0.05 and extremely significant differences at P＜0.01, respectively.
表 1 qRT-PCR基因及引物
Table 1 Genes and primers for qRT-PCR
基因
Gene正向引物
Forward primer (5'-3')反向引物
Reverse primer (5'-3')CSS0007745 CCAAGAGTGTGGAAGGGTATG CAGAGGGAGGCCAAATCTTATG CSS0013831 CATTGCTTCTTGGCCCTACTA TGACAGTGCCATCACCATAAA CSS0038049 GATGCCATGGCTTATGGATTTG GACCTATGCGGTAGACAGTTTC CSS0008562 AGTGCCTCATCAACCATCAC AGGAAGAAGAAGAGGAGGTAGAG CSS0042430 GAGACTCAGAGGACTCGAAAGA CAGACTCGGACGCCTTTATG CSS0005594 AATATGGGTGCCGGGTATTG TCTTCTCCTCCGATGGTACTT CsEF1（KA280301.1） TTGGACAAGCTCAAGGCTGAACG ATGGCCAGGAGCATCAATGACAGT 
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表 2 样本测序数据的质量控制分析
Table 2 Quality control for transcriptome sequencing
样本
Sample过滤序列
Clean reads过滤碱基
Clean bases/GQ20/% Q30/% GC含量
GC Content /%匹配序列（比对效率/%）
Mapped reads (Efficiency/%)CK1 40107608 6.00 98.87 96.51 45.31 35374239 (88.20)CK2 40805448 6.10 98.72 96.33 45.11 35890315 (87.95)CK3 40738514 6.10 98.48 95.89 44.84 35837746 (87.97)TB1 41033002 6.14 98.77 96.24 45.42 36088623 (87.95)TB2 40766338 6.10 98.87 96.54 45.25 35886380 (88.03)TB3 41144588 6.16 98.71 96.28 45.21 36124713 (87.80)总计 Total 244595498 36.59
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表 3 类黄酮生物合成途径中的差异代谢物
Table 3 Differential metabolites of flavonoid biosynthesis
编号
Code代谢物名称
Compound差异倍数
Fold changeP值
P value变量重要性投影
VIP差异类型
TypeNEG_q122 二氢杨梅素 Dihydromyricetin 1.10 0.00 1.33 上调 Up NEG_q260 对香豆酰奎宁酸 p-Coumaroyl quinic Acid 1.22 0.00 1.38 NEG_q264 根皮素 Phloretin 1.56 0.02 1.27 NEG_q265 根皮苷 Phlorizin 1.29 0.04 1.28 POS_q141 表没食子儿茶素 Epigallocatechin 1.05 0.02 1.29 NEG_q79 芹菜素 Apigenin 0.65 0.01 1.37 下调 Down NEG_q94 儿茶素没食子酸酯 Catechin Gallate 0.95 0.03 1.30 NEG_q160 没食子儿茶素没食子酸酯 Gallocatechin Gallate 0.95 0.02 1.30 NEG_q145 表儿茶素没食子酸酯 Epicatechin Gallate 0.73 0.01 1.27 NEG_q92 儿茶素 Catechin 0.65 0.00 1.38 NEG_q98 绿原酸 Chlorogenic Acid 0.68 0.00 1.36 NEG_q120 二氢山柰酚 Dihydrokaempferol 0.57 0.00 1.35 NEG_q158 没食子儿茶素 Gallocatechin 0.91 0.01 1.32 NEG_q240 柚皮素查耳酮 Naringenin Chalcone 0.66 0.00 1.38 NEG_q241 柚皮苷 Naringin 0.76 0.00 1.32 NEG_q307 花旗松素 Taxifolin 0.80 0.00 1.35
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