A Constant Temperature Fluorescent RPA Assay for Detecting Novel Muscovy Duck Parvovirus
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摘要:目的
建立新型番鸭细小病毒（New-genotype muscovy duck parvovirus, N-MDPV）荧光RPA恒温检测方法，为基层提供可视化快速检测技术手段。
方法以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点，使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段，设计特异的RPA扩增引物并利用重组酶聚合酶扩增技术扩增目的基因，从而建立一种荧光RPA恒温检测N-MDPV的方法，确定反应体系的最佳反应时间和温度，分析该方法特异性和灵敏性；对收集的病料进行核酸检测，并与传统PCR和病毒分离鉴定方法检测结果进行比较。
结果建立的荧光RPA恒温检测方法最佳反应温度为39 ℃，最佳反应时间为30 min；灵敏性高，最低核酸检测限度可达10 fg·μL−1；对新型番鸭细小病毒核酸进行特异性扩增，结果显示对鸭腺病毒3型（Duck adenovirus type 3, DAdV-3）、禽腺病毒4型（Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4）、鸭圆环病毒（Duck circovirus, DuCV）、鸭瘟病毒（Duck plague virus, DPV）、鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）、鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus, DTMUV）和新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus, NDRV）的核酸均未有发生交叉反应，特异性良好。利用本研究建立的RPA快检方法、传统PCR方法以及病毒分离鉴定方法对收集的38份鸭组织病料核酸样品进行检测，结果显示阳性率分别为36.8%（14/38）、36.8%（14/38）和31.6%（12/38）；RPA检测后呈阳性的样品经PCR方法检测与病毒分离鉴定方法检测均呈现阳性，阳性符合率为100%。
结论该方法可以很好地应用于缺乏相应检测设备的基层进行新型番鸭细小病毒的大规模临床样本检测，为新型番鸭细小病毒的可视化快速检测提供技术手段。
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关键词:
- 新型番鸭细小病毒 /
- RPA恒温检测 /
- 重组酶聚合酶扩增技术
Abstract:ObjectiveA constant temperature fluorescent RPA assay for detecting novel Muscovy duck parvovirus (N-MDPV) was developed.
MethodEXO fluorescent probes were specifically bound to the targeted conserved VP3 fragment of N-MDPV. RPA amplification primers were designed to amplify the segment by using recombinant enzyme polymerase. An assay for detecting N-MDPV was established with reaction time and temperature optimized and specificity, sensitivity, and accuracy tested on the collected nucleic acid of disease material in comparison with traditional PCR and virus isolation identification methods.
ResultThe optimized assay reaction temperature and time were 39 ℃ for 30 min to achieve a lowest sensitivity for nucleic acid detection at 10 fg·μL−1. The nucleic acid of N-MDPV was specifically amplified without any cross reaction with those of duck adenovirus type 3, fowl adenovirus type 4, duck circovirus, duck plague virus, duck hepatitis virus, duck tembusu virus, and novel duck reovirus. Along with the conventional PCR and the virus isolation and identification methods, the newly developed assay detected the nucleic acid on 38 duck tissue specimens with a positive rate of 36.8% (14/38) in comparison to those at 36.8% (14/38) for the PCR and 31.6% (12/38) for the isolation and identification method. In addition, 100% coincidence rates of the assay and the two other methods on positive samples as well as of the assay and the PCR on the positive clinical samples were secured.
ConclusionThe new RPA method to rapidly and visually detect N-MDPV demonstrated to be highly specific, sensitive, and accurate. It was deemed appropriate for clinical applications.
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0. 引言
【研究意义】双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一种草腐型食用菌，目前在全球范围内广泛栽培，主产区包括美国、荷兰、波兰、爱尔兰、加拿大等欧美国家及中国。据中国食用菌协会统计，2017年我国双孢蘑菇总产量达到289.52万t，位列各食用菌品种第四位[1]。我国双孢蘑菇栽培从传统季节栽培开始，随着近些年欧美发达国家双孢蘑菇工厂化设备和技术的引进和吸收转化，国内部分食用菌厂商也开始进行双孢蘑菇工厂化栽培的尝试，且发展势头强劲。而工厂化栽培中培养料的性质是决定双孢蘑菇品质的关键。【前人研究进展】工厂化双孢蘑菇栽培过程中，培养料一般通过隧道发酵进行制备。隧道发酵技术最早由意大利人发明，并于20世纪70年代成功应用到荷兰及法国双孢蘑菇生产当中。隧道发酵早期只用于二次发酵，随着集中发酵原理研究的深入，一次发酵也开始采用开放式隧道进行发酵[2]。当前工厂化双孢蘑菇栽培主要以麦秆、鸡粪为主要原料，通过隧道发酵技术转化为适于蘑菇栽培的选择性培养料。当前蘑菇培养料发酵理化性质方面的研究较多，如张昊琳等[3]关于不同基质培养料理化性状与双孢蘑菇产量及农艺性状方面的研究结果表明，出菇期培养料含水量是提高蘑菇产量的关键。蒋毅敏等[4]通过配方碳氮比试验表明，培养基料中碳氮比为25.4∶1时，双孢蘑菇的产量最高。许修宏等[5]通过隧道二次发酵培养料含氮量从1.58%增加到1.85%，pH值从8.7下降到7.5，表明通过隧道二次发酵技术可以制备符合双孢蘑菇生长需要的培养料。朱燕华等[6]通过研究培养料发酵过程中的pH、电导率、含水量、灰分、碳氮比等理化性质的变化情况，对稻、麦秸秆配方工厂化栽培双孢蘑菇进行比较，获得了适于工厂化栽培的稻草秸秆配方。【本研究切入点】目前培养料隧道式发酵是双孢蘑菇工厂化栽培的关键环节，而不同含氮量培养料一次隧道发酵和二次隧道发酵过程中理化性质变化及其对出菇产量的影响的相关研究还较少。【拟解决的关键问题】本研究通过配制不同含氮量培养料配方，比较一次隧道发酵和二次隧道发酵过程中各处理理化性质的变化，以期为蘑菇培养料配方优化及与后续产量、质量相关性研究提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 供试双孢蘑菇菌株
试验采用双孢蘑菇菌株为W192，由福建省农业科学院食用菌研究所提供并保藏。
1.2 试验材料
试验采用传统麦草+鸡粪配方，主要原材料为麦草秸秆、鸡粪、豆粕以及石膏，原材料各理化参数见表1。麦草秸秆长度在30 cm左右，新鲜、足干，无霉变；鸡粪新鲜、颗粒状；豆粕呈颗粒状，无霉变异味；石膏纯净无杂质。
表 1 原材料部分理化性质Table 1. Physicohemical properties of raw materials原料
Raw material含氮量
Nitrogen content/%含碳量
Carbon content/%含水量
Moisture content/%灰分
Ash content/%麦秆 Wheat straw 0.48 46.50 15.32 8.11 鸡粪 Chicken manure 3.80 45.00 70.27 19.92 豆粕 Soybean meal 7.2 45.4 9.6 6.8 1.3 培养基质配方
目前隧道发酵配方碳氮配比多在1.20%~1.50%，本研究根据原料的含氮量进行配方设计，设置含氮量分别为1.15%（T1）、1.35%（T2）以及1.55%（T3）的3个处理配方。配方T1：麦秆20 t，鸡粪16.25 t；配方T2：麦秆20 t，鸡粪16.25 t，豆粕0.10 t；配方T3：麦秆20 t，鸡粪22 t，豆粕0.55 t，此外各处理石膏添加量为5.5%左右。
1.4 培养料制备及出菇方法
培养料采用隧道集中发酵工艺，并采用荷兰AEM公司隧道发酵控制系统进行温度控制，以保持各处理在隧道发酵过程具有相同的发酵条件。第1 d将麦草浸入含有鸡粪的泡料池进行预湿，然后进行建堆，建堆高度2.0～2.5 m，宽5 m，长度不限。添加辅料（石膏和豆粕），再通过抛料机进行填料，开始一次隧道发酵，抛料高度3 m左右，开启风机进行通风升温，根据升温情况，控制风机间隔运行时间，料温控制在75～85℃，每隔4 d翻堆1次，共翻堆3次。二次隧道发酵控制参考文献[7]，填料高度2.2～2.5 m，通过风机控制通气量大小以及调节新风供应进行堆料温度调整，整个二次发酵过程分为平衡、升温、巴氏消毒、降温、控温培养及降温出料几个阶段，出料前测定氨气浓度，低于0.005‰才能够进行上料。其中巴氏消毒料温要保持在58～62℃，保温8 h，控温发酵温度保持在48～52℃，控温发酵4～5 d。出菇菇房为标准化出菇房，菇房采用FANCOM公司的菇房系统进行控制，保证出菇环境相同，播种、发菌、覆土和出菇管理均按常规方法进行[8]。
1.5 培养料理化性质测定
分别对进一次发酵隧道（发酵0 d）、一次转隧道（发酵4 d）、二次转隧道（发酵8 d）、三次转隧道（发酵12 d）、进二次发酵隧道（发酵16 d）和二次发酵结束（发酵23 d）的培养料进行取样，其中一次料为进二次发酵隧道时期的培养料，二次料为二次发酵结束时的培养料。采用烘干法测定含水量：取不同发酵阶段培养料样品500 g于105℃热风烘干箱中烘干24 h，然后计算样品含水量，每个阶段样品重复3次。采用奥豪斯pH计进行pH值测定：取发酵各阶段样品10 g于50 mL蒸馏水中，充分搅拌混合浸泡0.5 h后进行测定。采用马弗炉灼烧重量法测定灰分：准确称重发酵各阶段样品1 g，550℃灼烧4 h。采用凯氏定氮法测定含氮量[9]。
1.6 产量统计及数据分析
用Excel 2013和DPS v7.05对各配方不同理化性质及产量数据进行统计分析，不同潮次出菇产量，以商品菇规格为标准进行切脚并称重。
2. 结果与分析
2.1 不同含氮配方培养料发酵过程含氮量变化
根据原料的含氮量进行配方设计，实际测得各配方初始含氮量分别为1.16%（T1）、1.38%（T2）以及1.57%（T3），接近设计指标。由表2可见，不同含氮配方随着发酵过程的深入，含氮量均呈上升趋势，其含氮量的上升主要是由于微生物代谢活动对有机物的分解，以及微生物定殖增长。一次发酵结束，3个处理含氮量差异逐渐缩小，随着二次发酵的进行，由于游离的氨气被微生物固定，初始含氮量较高的处理T3二次料含氮量为2.28%，显著高于含氮量较低的处理T1和处理T2（P＜0.05）。各处理发酵结束时的含氮量比较，初始含氮量越高，二次料含氮量也相对较高，但与初始含氮量存在较大的差异，随着发酵的进行，含氮量的差异逐渐缩小。
表 2 不同含氮配方培养料发酵过程含氮量变化Table 2. N content of composts with varied nitrogen contents at different stages of composting（单位：%） 处理 Treatments 不同发酵阶段 Different stages of composting 进一次 Start phaseⅠ 一转 First turning 二转 Second turning 三转 Third turning 进二次 Start phaseⅡ 出料 End phaseⅡ T1 1.16±0.01 k 1.37±0.02 j 1.59±0.02 hi 1.62±0.02 ghi 1.78±0.02 de 2.05±0.03 c T2 1.38±0.02 j 1.43±0.02 j 1.67±0.01 fg 1.67±0.02 fg 1.81±0.02 d 2.20±0.06 b T3 1.57±0.02 i 1.65±0.02 gh 1.72±0.03 ef 1.74±0.01 e 1.83±0.02 d 2.28±0.00 a 注：同列数据后不同字母表示不同处理之间差异显著（P＜0.05），表3～5同。
Note: Data with different letters on same column indicate significant differences between treatments（P＜0.05）. Same for Tables 3–5.2.2 不同含氮配方培养料发酵过程pH变化
pH是微生物代谢活动重要的影响因素，现代隧道发酵技术一般通过强制通气的方式促进有益微生物的生长代谢。随着微生物的代谢活动，培养料料温逐步升高，同时随着有机物质的分解产生大量的氨气，造成培养料pH呈弱碱性。由表3可见，不同含氮处理pH值变化趋势基本一致，呈现先升后降的趋势，最终使培养料pH呈弱碱性。其中含氮量较高的处理T3一次料以及二次料的pH最高，T3处理二次料的pH值显著高于T2处理（P＜0.05）。可见pH和原料的含氮量呈正相关性，因此在发酵过程中应特别注意氨气浓度的变化，若培养料含氮量过高，则需要注意二次发酵过程及出料前的氨气浓度的测定。
表 3 不同含氮配方培养料发酵过程pH变化Table 3. pH of composts with varied nitrogen contents at different stages of composting处理 Treatments 不同发酵阶段 Different stages of composting 进一次 Start phaseⅠ 一转 First turning 二转 Second turning 三转 Third turning 进二次 Start phaseⅡ 出料 End phaseⅡ T1 8.10±0.08 bc 8.13±0.07 abc 8.13±0.03 abc 8.04±0.04 cd 7.82±0.08 ef 7.59±0.04 gh T2 8.09±0.06 bc 8.12±0.03 abc 8.23±0.03 ab 8.16±0.02 abc 7.91±0.02 de 7.54±0.03 h T3 8.23±0.04 ab 8.27±0.03 a 8.25±0.11 ab 8.14±0.02 abc 8.02±0.08 cde 7.72±0.03 fg 2.3 不同含氮配方培养料发酵过程水分变化
双孢蘑菇生长的水分主要来源于培养料。因此，发酵好的培养料含水量在适宜范围内对双孢蘑菇产量和质量具有决定意义。含水量的指标通常与原材料的物理性状有关，发酵好的二次培养料含水量控制在65%～75%比较适宜[10]。由表4可以看出，在蘑菇培养料发酵过程，3个处理的含水量变化趋势相同。含水量随着发酵过程不断降低，这主要由于发酵过程培养料的水分随微生物代谢活动产生的高温以及强制通风被带走。二次料含水量最低的为处理T3，为65.78%，与T1、T2处理的二次料含水量差异不显著（ P > 0.05），但显著低于其他发酵阶段的含水量（P＜0.05），符合蘑菇生长需求。
表 4 不同含氮配方培养料发酵过程含水量变化Table 4. Moisture content of composts with varied nitrogen contents at different stages of composting（单位：%） 处理 Treatments 不同发酵阶段 Different stages of composting 进一次 Start phaseⅠ 一转 First turning 二转 Second turning 三转 Third turning 进二次 Start phaseⅡ 出料 End phaseⅡ T1 79.26±0.49 a 76.23±1.20 bcd 75.28±0.92 cdef 72.12±0.88 g 72.12±0.97 g 66.75±0.52 h T2 78.70±0.70 ab 75.69±0.91 cde 73.74±0.50 defg 72.90±1.46 fg 72.64±0.44 fg 67.62±0.95 h T3 77.48±0.64 abc 76.22±0.64 bcd 74.32±1.09 defg 72.9±1.12 efg 72.11±0.84 g 65.78±0.86 h 2.4 不同含氮配方培养料发酵过程灰分变化
灰分决定了培养料中可利用干物质含量，灰分越高则表明蘑菇菌丝可利用干物质越少，因此同等质量下灰分较低的培养料，可以提供更多的有机物供蘑菇菌丝利用。由表5可以看出，在蘑菇培养料发酵过程，3个处理的灰分变化趋势相同。由于发酵过程中微生物生长代谢使得有机物分解，灰分则随着发酵过程不断提高。同时灰分很大程度与原料中的灰分含量关系密切，由表5可以看出，处理T1初始灰分最低，发酵结束后，二次培养料灰分为30.92%，显著低于其他两个处理（P＜0.05）。在蘑菇培养料的原料中灰分主要来源于鸡粪、石膏、小麦秸秆等，由于含氮量提高对应的鸡粪含量相对增加，因此含氮量高的原料配方灰分含量也相对较高。
表 5 不同含氮配方培养料发酵过程灰分变化Table 5. Ash content of composts with varied nitrogen contents at different stages of composting（单位：%） 处理 Treatments 不同发酵阶段 Different stages of composting 进一次 Start PhaseⅠ 一转 First turning 二转 Second turning 三转 Third turning 进二次 Start phaseⅡ 出料 End phaseⅡ T1 18.44±0.92 h 22.08±0.85 g 25.11±0.90 ef 27.29±1.04 de 28.31±0.18 cd 30.92±0.83 b T2 21.95±0.92 g 22.51±0.72 g 25.32±0.99 ef 28.59±0.18 bcd 29.90±0.60 bc 33.81±0.77 a T3 22.62±1.20 g 23.18±0.79 fg 26.58±0.35 de 28.86±1.02 bcd 30.06±0.23 bc 34.04±0.72 a 2.5 不同含氮配方培养料对双孢蘑菇产量的影响
由图1可以看出不同处理各采收潮次蘑菇产量的变化。产量最高的为T3处理，为20.74 kg·m−2。3个处理的前二潮出菇产量较高，分别占总产量的81.90%、78.99%、79.73%。T1处理的第三潮产量低于其他两个处理，仅有3.16 kg·m−2，而另外两个处理均超过4 kg·m−2。T3处理的第三潮产量与T1处理的第三潮产量差异显著（P＜0.05）。相对而言，含氮量较高的培养料其三潮菇产量更高，同时菇质更加紧实。
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图 1 不同含氮配方培养料产量比较注：不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 1. Yields of A. bisporus cultivated on composts of varied N contentsNote: Data with different lowercase letters indicate significant difference（P＜0.05）.3. 讨论与结论
双孢蘑菇培养料堆制发酵过程是一个需要微生物参与转化的过程，原材料中各种有机组分会被微生物消耗利用，并被转化为适宜双孢蘑菇利用的选择性培养料。目前隧道发酵配方碳氮配比多为1.20%~1.50%，因此本研究根据原料的含氮量进行配方，分别设计含氮量为1.15%（T1）、1.35%（T2）以及1.55%（T3）3个配方处理，在保证一定的出菇产量前提下设置的3个配方处理涵盖了目前主流配方含氮量，且上下限都超出常规配方要求。本研究采用隧道发酵技术比较了不同含氮培养料堆制发酵过程中理化性质的变化，在培养料堆制发酵过程的不同阶段，3个配方处理的培养料含氮量及灰分比例呈上升趋势，含水量则呈下降趋势，pH则总体呈弱碱性。在所有处理二次培养料中，处理T1的二次发酵料灰分最低，为30.92%；处理T3二次发酵料含氮量最高，为2.28%；处理T3三潮产量最高，为20.74 kg·m−2。在发酵过程中，由于微生物的代谢作用，原材料中的有机物质被分解为水和二氧化碳，并产生热量，加快了原材料腐熟和水分蒸发，因此在发酵过程中含碳量及水分呈下降趋势。同时，不能被代谢分解的矿质元素含量相对提高，从而导致培养料灰分含量随着发酵过程逐渐升高。随着微生物的繁殖生长，特别是二次发酵控温培养阶段，嗜热放线菌的不断繁殖，使pH呈弱碱性，同时产生大量的菌体蛋白，提高了培养料含氮量。姚琴等[11]研究表明，随着培养料发酵过程的进行全氮的绝对量减少，但相对含量成上升趋势，与本研究的结果一致。KARIAGA等[12]通过对培养料堆制过程中生物及理化因素进行研究，表明蘑菇培养料的选择性与培养料的理化性质相关。
隧道发酵是一种强制通风的发酵方法，Wakchaure等研究表明通风是控制堆肥周期及质量的关键参数之一[13]。采用隧道式发酵技术可以缩短制料周期，同时提高培养料质量[14]。当前越来越多的工厂化企业采用隧道发酵制备蘑菇培养料，并形成了专门的堆肥公司[15]。随着双孢蘑菇工厂化栽培技术工艺的不断进步，双孢蘑菇单产水平逐步提升，为了保证产量、质量协调提升，必须有充足的营养源，这就导致培养料中含氮量比例在逐渐提升，但随着培养料含氮量越来越高，容易引起培养料绿霉病的发生。因此，必须加强培养料隧道发酵和双孢蘑菇栽培技术管理。
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图 1 N-MDPV VP3 基因 RPA荧光扩增结果
M：DL 2000 DNA 分子质量标准；1：阴性对照；2～5：引物RPA扩增产物。
Figure 1. RPA amplification on VP3 of N-MDPV
M: DL 2000 DNA marker; 1: negative control; 2–5: RPA products.
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图 2 N-MDPV荧光RPA检测不同引物扩增结果
1～4（探针浓度4 μmol·L−1）：N-MDPV-228F-228R、N-MDPV-193F-193R、N-MDPV-193F-230R、N-MDPV-193F-250R；5～8（探针浓度2 μmol·L−1）：N-MDPV-228F-228R、N-MDPV-193F-193R、N-MDPV-193F-230R、N-MDPV-193F-250R；9～12（阴性对照）：N-MDPV-228F-228R、N-MDPV-193F-193R、N-MDPV-193F-230R、N-MDPV-193F-250R。
Figure 2. Amplification of primers of RPA for N-MDPV
1–4 (with probe concentration at 4 μmol·L−1): N-MDPV-228F-228R, N-MDPV-193F-193R, N-MDPV-193F-230R, N-MDPV-193F-250R, respectively; 5–8 (with probe concentration at 2 μmol·L−1): N-MDPV-228F-228R, N-MDPV-193F-193R, N-MDPV-193F-230R, N-MDPV-193F-250R, respectively; 9–12 (negative control): N-MDPV-228F-228R, N-MDPV-193F-193R, N-MDPV-193F-230R, N-MDPV-193F-250R, respectively.
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图 3 N- MDPV荧光RPA检测方法不同反应温度的扩增结果
1～5分别为26、35、39、42、45 ℃。不同小写字母表示不同温度之间差异显著（P＜0.05）。
Figure 3. Amplifications at varied reaction temperature of RPA for N-MDPV
1–5: 26, 35, 39, 42, and 45 ℃, respectively. Different lowercase letters indicate significant differences between different temperatures at P＜0.05.
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图 4 N-MDPV荧光RPA检测方法不同反应时间的扩增结果
1～5分别为10、20、30、40、50 min。不同小写字母表示不同时间之间差异显著（P＜0.05）。
Figure 4. Amplifications under varied reaction time of RPA for N-MDPV
1–5: 10, 20, 30, 40, and 50 min, respectively; Different lowercase letters indicate significant differences between different times at P＜0.05.
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图 5 N-MDPV荧光RPA检测方法的敏感性
1：100 ng·μL−1；2：10 ng·μL−1；3：1 ng·μL−1；4：100 pg·μL−1；5：10 pg·μL−1；6：1 pg·μL−1；7：100 fg·μL−1；8：10 fg·μL−1；9：1 fg·μL−1；10：1 ag·μL−1；11：阴性对照。*、**：与阴性对照相比，差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）。
Figure 5. Sensitivity of constant temperature fluorescent RPA assay
1: 100 ng·μL−1; 2: 10 ng·μL−1; 3: 1 ng·μL−1; 4: 100 pg·μL−1; 5: 10 pg·μL−1; 6: 1 pg·μL−1; 7: 100 fg·μL−1; 8: 10 fg·μL−1; 9: 1 fg·μL−1; 10: 1 ag·μL−1; 11: negative control; * and **: significant difference from negative control at P＜0.05 and extremely significant difference from negative control at P＜0.01, respectively.
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图 6 N- MDPV荧光RPA检测方法的特异性
1：新型番鸭细小病毒；2：鸭腺病毒3型；3：禽腺病毒4型；4：鸭腺病毒3型+鸭坦布苏病毒；5：鸭瘟病毒；6：鸭病毒性肝炎病毒；7：鸭圆环病毒；8：鸭坦布苏病毒；9：新型鸭呼肠孤病毒；10：阴性对照。**：与阴性对照相比，差异极显著（P＜0.01）。
Figure 6. Specificity of constant temperature fluorescent RPA assay
1: new-genotype muscovy duck parvovirus ; 2: duck adenovirus type 3; 3: fowl adenovirus serotype 4; 4: duck adenovirus type 3 + duck tembusu virus; 5: duck plague virus; 6: duck hepatitis virus; 7: duck circovirus; 8: duck tembusu virus; 9: novel duck reovirus; 10: negative control. **: extremely significant difference from negative control at P＜0.01.
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图 7 N-MDPV PCR 检测方法的敏感性
M：DL 2000 DNA分子质量标准；1：100 ng·μL−1；2：10 ng·μL−1；3：1 ng·μL−1；4：100 pg·μL−1；5：10 pg·μL−1；6：1 pg·μL−1；7：100 fg·μL−1；8：10 fg·μL−1；9：1 fg·μL−1；10：1 ag·μL−1；11：阴性对照。
Figure 7. Sensitivity of constant temperature fluorescent RPA assay
M: DL 2000 DNA marker; 1: 100 ng·μL−1; 2: 10 ng·μL−1; 3: 1 ng·μL−1; 4: 100 pg·μL−1; 5: 10 pg·μL−1; 6: 1 pg·μL−1; 7: 100 fg·μL−1; 8: 10 fg·μL−1; 9: 1 fg·μL−1; 10: 1 ag·μL−1; 11: negative control.
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图 8 N-MDPV荧光RPA检测方法的敏感性
1：100 ng·μL−1；2：10 ng·μL−1；3：1 ng·μL−1；4：100 pg·μL−1；5：10 pg·μL−1；6：1 pg·μL−1；7：100 fg·μL−1；8：10 fg·μL−1；9：1 fg·μL−1；10：1 ag·μL−1；11：阴性对照。*、**：与阴性对照相比，差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）。
Figure 8. Sensitivity of constant temperature fluorescent RPA assay
1: 100 ng·μL−1; 2: 10 ng·μL−1; 3: 1 ng·μL−1; 4: 100 pg·μL−1; 5: 10 pg·μL−1; 6: 1 pg·μL−1; 7: 100 fg·μL−1; 8: 10 fg·μL−1; 9: 1 fg·μL−1; 10: 1 ag·μL−1; 11: negative control; * and **: significant difference from negative control at P＜0.05 and extremely significant difference from negative control at P＜0.01. respectively.
表 1 N-MDPV的RPA引物和探针
Table 1 RPA primers and probes of N-MDPV
引物和探针
Primers and probes序列（5′-3′）
Sequence（5′-3′）N-MDPV-228F AGGCGCTTATGGCACCATGGGCCGCAATTGG N-MDPV-228R CCTAAAATATTTTGGGCTGGGATGCTGGAAG N-MDPV-193F ACTCACACAGAAGCAGAGGCTTCCAGCATCC N-MDPV-193R TAGTGTTTTGTTCATTCGTTACAGTCTTGCC N-MDPV-230R CCAAGAACATCAAGATCTGAACTCGTAGGAG N-MDPV-250R AAACCATTCCTGGTAAAGCTCCAAGAACATC N-MDPV-probe 5′ACAGATCTGGCAGCACTGCAGCAGGAATAA
AFGHQATTATGGTAACGGACG -C3 Spacer
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表 2 N-MDPV RPA 与 PCR 方法、病毒分离法临床样本检测结果比较
Table 2 Comparison between detections by constant temperature fluorescent RPA assay and PCR on clinical samples
检测方法
Detecting
Method样品数
No. of
samples阳性样品数
No. of
positive阴性样品数
No. of
negative阳性率
Positive
rate%RPA恒温检测
RPA constant
temperature detection38 14 24 36.8 常规 PCR
Conventional PCR38 14 24 36.8 病毒分离鉴定法
Virus isolation and
identification method38 12 26 31.6
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