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新型番鸭细小病毒荧光RPA恒温检测方法的建立

陈炜 梁齐章 张佳雪 焦文龙 林永强 刘荣昌 傅秋玲 傅光华 朱婷 黄瑜

陈炜,梁齐章,张佳雪,等. 新型番鸭细小病毒荧光RPA恒温检测方法的建立 [J]. 福建农业学报,2024,39(9):1−8
引用本文: 陈炜,梁齐章,张佳雪,等. 新型番鸭细小病毒荧光RPA恒温检测方法的建立 [J]. 福建农业学报,2024,39(9):1−8
CHEN W, LIANG Q Z, ZHANG J X, et al. Establishment of the Fluorescent RPA Constant Temperature detection method for Novel Muscovy Duck Parvovirus and its primary application [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2024,39(9):1−8
Citation: CHEN W, LIANG Q Z, ZHANG J X, et al. Establishment of the Fluorescent RPA Constant Temperature detection method for Novel Muscovy Duck Parvovirus and its primary application [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2024,39(9):1−8

新型番鸭细小病毒荧光RPA恒温检测方法的建立

基金项目: 国家现代农业产业(水禽)技术体系建设专项(CARS-42);福建省百千万工程领军人才项目(FJTMTP-2014);福建省农业科学院自由探索科技创新项目(ZYTS202423);福建省种业创新与产业化工程项目(Zycxny2021014)
详细信息
    作者简介:

    陈炜(2000 —),男,硕士研究生,主要从事预防兽医学相关研究,E-mail:18094121108@163.com

    梁齐章(1994 —),男,博士,助理研究员,主要从事兽医病毒学相关研究,E-mail:718928400@qq.com

    通讯作者:

    朱婷(1987 —),女,博士,副教授,主要从事兽医病理学相关研究,E-mail:shenlansezhuzi@126.com

    黄瑜(1965 —),男,博士,研究员,主要从事动物传染病学相关研究,E-mail:huangyu_815@163.com

  • 中图分类号: S852.65

Establishment of the Fluorescent RPA Constant Temperature detection method for Novel Muscovy Duck Parvovirus and its primary application

  • 摘要:   目的  建立新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck parvovirus, N-MDPV)荧光RPA恒温检测方法,为基层提供可视化快速检测技术手段。  方法  以N-MDPV的VP3基因保守片段为靶点,使用EXO荧光探针特定结合VP3基因保守片段,设计特异的RPA扩增引物并利用重组酶聚合酶扩增技术扩增目的基因,从而建立一种荧光RPA恒温检测N-MDPV的方法,确定反应体系的最佳反应时间和温度,分析该方法特异性和灵敏性;对收集的病料进行核酸检测,并与传统PCR和病毒分离鉴定方法检测结果进行比较。  结果  建立的荧光RPA恒温检测方法最佳反应温度为39 ℃,最佳反应时间为30 min;灵敏性高,最低核酸检测限度可达10 fg·μL−1;对新型番鸭细小病毒核酸进行特异性扩增,结果显示对鸭腺病毒3型(Duck adenovirus 3, DAdV-3)、禽腺病毒4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)、鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)、鸭瘟病毒(Duck plaguevirus, DPV)、鸭病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis Virus, DHV)、鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus, DTMUV)和新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)的核酸均未有发生交叉反应,特异性良好。利用本研究建立的RPA快检方法、传统PCR方法以及病毒分离鉴定方法对收集的38份鸭组织病料核酸样品进行检测,结果显示阳性率分别为36.8%(14/38)、36.8%(14/38)和31.6%(12/38);RPA检测后呈阳性的样品经PCR方法检测与病毒分离鉴定方法检测均呈现阳性,阳性符合率为100%。临床样品检测RPA检测方法与传统PCR方法阳性符合率为100%。  结论  该方法可以很好地应用于缺乏相应检测设备的基层进行新型番鸭细小病毒的大规模临床样本检测,为新型番鸭细小病毒的可视化快速检测提供技术手段。
  • 图  1  N- MDPV VP3 基因 RPA荧光扩增结果

    M:DL 2000 DNA 分子质量标准;1:阴性对照;2~5:引物RPA扩增产物。

    Figure  1.  RPA amplification results of N- MDPV VP3 gene

    M: DL 2000 DNA Marker; 1: negative control; 2–5: RPA products.

    图  2  N- MDPV荧光RPA检测不同引物扩增结果

    1~4(探针浓度4 μmol·L−1):N-MDPV-228F-228R、N-MDPV-193F-193R、N-MDPV-193F-230R、N-MDPV-193F-250R;5~8(探针浓度2 μmol·L−1):N-MDPV-228F-228R、N-MDPV-193F-193R、N-MDPV-193F-230R、N-MDPV-193F-250R;9~12(阴性对照):N-MDPV-228F-228R、N-MDPV-193F-193R、N-MDPV-193F-230R、N-MDPV-193F-250R。

    Figure  2.  Amplification results of different primers of RPA for N-MDPV

    1–4(probe concentration at 4 μmol·L−1): N - MDPV - 228F-228R、N - MDPV - 193F-193R、N - MDPV - 193F-230R、N - MDPV - 193F-250R;5–8(probe concentration at 2 μmol·L−1): N - MDPV - 228F-228R、N - MDPV-193F-193R、N - MDPV - 193F-230R、N - MDPV - 193F-250R;9–12(negative control): N - MDPV - 228F-228R、N - MDPV - 193F-193R、N - MDPV - 193F-230R、N - MDPV - 193F-250R.

    图  3  N- MDPV荧光RPA检测方法不同反应温度的扩增结果

    1~5分别为26、35、39、42、45 ℃。**:与26 ℃相比,差异极显著(P<0.01)。

    Figure  3.  Amplification results at different reaction temperature of RPA for N-MDPV

    1–5 were 26, 35,39,42,45 ℃, respectively. **:extremely significant difference from 26 ℃(P<0.01).

    图  4  N- MDPV荧光RPA检测方法不同反应时间的扩增结果

    1~5分别为10、20、30、40、50 min。*、**:与10 min相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。

    Figure  4.  Amplification results with different reaction times of RPA for N-MDPV

    1–5 were 10, 20, 30, 40, 50 min, respectively. * and **:significant difference(P<0.05) or extremely significant difference with 10 min(P<0.01).

    图  5  N-MDPV荧光RPA检测方法的敏感性

    1:100 ng·μL−1;2:10 ng·μL−1;3:1 ng·μL−1;4:100 pg·μL−1;5:10 pg·μL−1;6:1 pg·μL−1;7:100 fg·μL−1;8:10 fg·μL−1;9:1 fg·μL−1;10:1 ag·μL−1;11:阴性对照。*、**:与阴性对照相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。

    Figure  5.  Sensitivity experimental results of N-MDPV fluorescence RPA detection method

    1: 100 ng·μL−1; 2: 10 ng·μL−1; 3: 1 ng·μL−1; 4: 100 pg·μL−1; 5: 10 pg·μL−1; 6: 1 pg·μL−1; 7: 100 fg·μL−1; 8: 10 fg·μL−1; 9: 1 fg·μL−1; 10: 1 ag·μL−1; 11: negative control. *、**:significant difference(P<0.05) or extremely significant difference with negative control(P<0.01).

    图  6  N- MDPV荧光RPA检测方法的特异性

    1:新型番鸭细小病毒;2:鸭腺病毒3型;3:禽腺病毒4型;4:鸭腺病毒3型+鸭坦布苏病毒;5:鸭瘟病毒;6:鸭病毒性肝炎病毒;7:鸭圆环病毒;8:鸭坦布苏病毒;9:新型鸭呼肠孤病毒;10:阴性对照。**:与阴性对照相比,差异极显著(P<0.01)。

    Figure  6.  Specific experimental results of N- MDPV fluorescence RPA detection method

    1: Novel Muscovy duck parvovirus plasmid; 2: duck adenovirus type 3; 3: duck adenovirus type 4; 4: Duck adenovirus type 3+duck Tembusu virus; 5: duck plague virus; 6: duck viral hepatitis virus; 7: circovirus; 8: duck Tambousu virus; 9: novel duck reovirus; 10: negative control. **:extremely significant difference from negative control(P<0.01).

    图  7  N- MDPV PCR 检测方法的敏感性

    M:DL 2000 DNA分子质量标准;1:100 ng·μL−1;2:10 ng·μL−1;3:1 ng·μL−1;4:100 pg·μL−1;5:10 pg·μL−1;6:1 pg·μL−1;7:100 fg·μL−1;8:10 fg·μL−1;9:1 fg·μL−1;10:1 ag·μL−1;11:阴性对照。

    Figure  7.  Sensitivity results of N- MDPV PCR detection method

    M: DL 2000 DNA Marker; 1: 100 ng·μL−1; 2: 10 ng·μL−1; 3: 1 ng·μL−1; 4: 100 pg·μL−1; 5: 10 pg·μL−1; 6: 1 pg·μL−1; 7: 100 fg·μL−1; 8: 10 fg·μL−1; 9: 1 fg·μL−1; 10: 1 ag·μL−1; 11: negative control.

    图  8  N-MDPV荧光RPA检测方法的敏感性

    1:100 ng·μL−1;2:10 ng·μL−1;3:1 ng·μL−1;4:100 pg·μL−1;5:10 pg·μL−1;6:1 pg·μL−1;7:100 fg·μL−1;8:10 fg·μL−1;9:1 fg·μL−1;10:1 ag·μL−1;11:阴性对照。*、**:与阴性对照相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。

    Figure  8.  Sensitivity experimental results of N-MDPV fluorescence RPA detection method

    1: 100 ng·μL−1; 2: 10 ng·μL−1; 3: 1 ng·μL−1; 4: 100 pg·μL−1; 5: 10 pg·μL−1; 6: 1pg·μL−1; 7: 100 fg·μL−1; 8: 10 fg·μL−1; 9: 1 fg·μL−1; 10: 1 ag·μL−1; 11: negative control. *、**:significant difference(P<0.05) or extremely significant difference with negative control(P<0.01).

    表  1  N-MDPV的RPA引物和探针

    Table  1.   RPA primers and probes of N-MDPV

    引物和探针
    Primers and probes
    序列(5′-3′)
    Sequence(5′-3′)
    N-MDPV-228F AGGCGCTTATGGCACCATGGGCCGCAATTGG
    N-MDPV-228R CCTAAAATATTTTGGGCTGGGATGCTGGAAG
    N-MDPV-193F ACTCACACAGAAGCAGAGGCTTCCAGCATCC
    N-MDPV-193R TAGTGTTTTGTTCATTCGTTACAGTCTTGCC
    N-MDPV-230R CCAAGAACATCAAGATCTGAACTCGTAGGAG
    N-MDPV-250R AAACCATTCCTGGTAAAGCTCCAAGAACATC
    N-MDPV-probe 5′ACAGATCTGGCAGCACTGCAGCAGGAATAA
    AFGHQATTATGGTAACGGACG -C3 Spacer
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    表  2  N-MDPV RPA 与 PCR 方法临床样本检测符合性

    Table  2.   Compliance test of clinical sample detection using N-MDPV RPA and PCR methods

    检测方法
    Detecting
    Method
    样品数
    No. of
    samples
    阳性样品数
    No. of
    positive
    阴性样品数
    No. of
    negative
    阳性率
    Positive
    rate%
    RPA恒温检测
    RPA constant
    Rtemperature detection
    38 14 24 36.8
    常规 PCR
    Conventional PCR
    38 14 24 36.8
    病毒分离鉴定法
    Virus isolation and
    identification method
    38 12 26 31.6
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-05-09
  • 修回日期:  2024-08-01
  • 网络出版日期:  2024-10-22

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