Thermal Protection of Encapsulated Bacillus mucilaginosus
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摘要:目的 针对胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）直投式菌剂菌体存活率低及易失活等问题，对喷雾干燥复合抗热保护剂进行优化研究，以期为其菌剂生产提供理论与技术支持。方法 以直投式菌剂菌体存活率为指标，利用喷雾干燥生产工艺，考察海藻糖、脱脂奶粉、麦饭石改性材料（H-MS）对菌体的抗热保护效果；并利用响应面法对复合抗热保护剂配方进行优化。结果 不添加抗热保护剂的菌剂菌体存活率仅有（34.15±1.07）%；添加单一保护剂时，以海藻糖保护效果最佳，麦饭石改性材料（H-MS）及脱脂奶粉次之，菌体存活率分别可达（52.17±1.08）%，（51.64±0.77）%，（43.67±1.62）%，海藻糖和H-MS对菌体存活率具有极显著影响（P＜0.01），脱脂奶粉对菌体存活率具有显著影响（P＜0.05）。利用响应面优化得到最佳复合抗热保护剂配方为海藻糖4.33%、脱脂奶粉2.90%和麦饭石改性材料（H-MS）7.57%。在此最佳添加配比下，菌体存活率为（73.32±0.76）%，活菌数最高可达1.12×109 CFU·g−1。结论 添加3种抗热保护剂均能提高直投式菌剂菌体存活率，且三者之间存在交互作用，复合使用的抗热效果优于单独使用。扫描电镜观察显示海藻糖和脱脂奶粉将菌体包埋成微胶囊固定在麦饭石改性材料（H-MS）的孔道中，能有效保护菌体细胞，提高菌剂菌体存活率。Abstract:Objective Effect of encapsulation to protect Bacillus mucilaginosus from thermal shock was evaluated for formulation optimization.Method Rates of survival and activation of B. mucilaginosus encapsulated with trehalose, skimmed milk powder, and/or modified H-MS medical stone after spray-drying were determined. Optimal formulation for the encapsulation was obtained using the response surface method.Result The survival rate of the naked B. mucilaginosus was (34.15±1.07)%. In contrast, the encapsulation with trehalose significantly improved the rate to (52.17±1.08)% (P＜0.01), while with H-MS, (51.64±0.77)% (P＜0.01) and with skimmed milk powder, (43.67±1.62)% (P＜0.05). Furthermore, a combined use of trehalose at 4.33%, skimmed milk powder at 2.90%, and H-MS at 7.57% for the encapsulation, the survival reached (73.32±0.76)% with a microbial count of 1.12×109 CFU·g−1.Conclusion The three encapsulation materials, especially, when they were applied in combination, significantly raised the B. mucilaginosus survival rate under a heat treatment. The scanning electron microscopic image revealed that trehalose and skimmed milk powder immobilized the bacteria cells in H-MS pores producing an effective thermal insulation that sheltered the encapsulated microbes.
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0. 引言
【研究意义】中国作为茶树Camellia sinensis (L.) O. Kuntze的原产中心和分布中心，拥有丰富的茶树种质资源[1]。茶树属山茶科山茶属[2]，为多年生常绿木本植物，一般为灌木，在热带地区也有乔木型。寿宁地理坐标为北纬27°11′~27°41′，东经119°14′~119°44′，位于福建东北部，属于闽东地区。闽东是福建省茶叶的主产地之一，产茶历史悠久，野生茶、苦茶等茶树种质资源丰富[3-6]。这些野生茶树资源的发掘，为进一步研究茶树起源、进化和选育新品种提供了宝贵的材料。【前人研究进展】近年来，植物叶片和花粉的超微结构在系统分类、演化等研究中已成为植物学领域的重要途径[7-10]。茶树叶片是人们采摘的主要部位，叶片与茶树品种的产量、品质、抗逆性等有密切关系。植物叶片的结构不仅反映了植物与环境的相互作用，其微形态特征也与植物的遗传、分类有着密切的联系[11-14]。植物花粉的形态特征由基因控制，具有很强的遗传保守性和稳定性，环境因素对其形态影响的较少，从而形成种的特异性与科属间的共同特征。花粉的形态特征可用于分类和推论演化趋势方面的研究[15]。【本研究切入点】尽管中国的茶树种质资源比较丰富，但对野生茶树种质资源的叶片及花粉微形态观察少有研究报道，同时，许多野生茶树种质资源的分类鉴别也还未确定。【拟解决的关键问题】本研究以福鼎大白茶为对照，采用扫描电镜对4份寿宁野生茶种质资源的叶片、花粉微形态进行观察，探明寿宁野生茶叶片、花粉微形态特征，以期为福建茶树种质资源的分类鉴定提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及仪器试剂
4份野生茶树种质资源均来自福建省寿宁县，以福鼎大白茶为对照，其基本信息见表 1。于2018年11月采摘其叶片及花。主要仪器与试剂：SU-8010型冷场发射扫描电镜(日立公司，日本)；E-1010型离子溅射仪(日立公司，日本)；FD-1-50型真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；DHG-9240A型可编程电热烘箱(上海一恒科学仪器有限公司)；2.5%的戊二醛；pH=6.8的磷酸缓冲液；50%、70%、80%、90%和100%的乙醇；100%的叔丁醇。
表 1 供试茶树种质资源主要特征Table 1. Main characteristics of tea germplasms1.2 样品处理方法
用真空冷冻干燥[16-17]的方法处理茶树叶片，具体方法如下：在茶树叶片中部取3 mm×3 mm大小的叶片，将其置于2.5%的戊二醛溶液中并在4℃冰箱中固定5 h；再分别用50%、70%、80%、90%乙醇进行脱水，每次时间为15 min；之后用100%乙醇脱水4~5次，每次时间为15 min；最后将叶片材料置于100%叔丁醇中浸泡15 min后，放入真空冷冻干燥机进行干燥。花粉具体处理方法如下：直接将试验用花置于可编程烘箱干燥处理。之后将处理过的茶树叶片及花粉粘在双面导电胶上，在其表面喷金镀膜80 s，电镜观察。
1.3 测量指标及方法
对茶树叶片的12个性状(内外气孔长宽、气孔数量、气孔开度、气孔器大小、茸毛长、茸毛直径、茸毛密度、叶腹纹饰和茸毛纹饰)进行观察和统计。对茶树花粉的10个性状(赤道轴长E、极轴长P、萌发沟长L、赤道面观、极面观、外壁纹饰、P×E、P/E和L/P)进行观察和统计。每个性状测量重复15次[18]。
1.4 统计与分析
采用软件Image-Pro、SPSS22.0[19]对数据进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 寿宁野生茶树叶片微形态特征
5份茶树叶片背面均具表皮毛，4份野生茶树茸毛纹饰都为平滑型，福鼎大白茶为长条纹形；气孔都为长卵形，具有异性气孔(腺鳞)，叶表蜡质纹饰有波浪状、平展状和皱脊状3种类型(图 1)。
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图 1 寿宁野生茶树叶片微形态电子显微观察结果注：Ⅰ为地洋001，Ⅱ为地洋002，Ⅲ为芎坑001，Ⅳ为芎坑002，Ⅴ为福鼎大白茶。图 3同。A为气孔整体观，B为气孔，C茸毛整体观，D为茸毛，E为蜡质纹饰。Figure 1. SEM of tea leafNote:Ⅰ.Diyang 001, Ⅱ.Diyang 002, Ⅲ.Xiongkeng 001, Ⅳ.Xiongkeng 002, Ⅴ.Fudingdabaicha.The same as Fig. 3. A.Stomatal wholeness, B.Stomatal wholeness, C.Villi wholeness, D.Villi wholeness, E.Waxy texture.由表 2可知，5份茶树叶片内气孔长在(10.42±2.00)~(17.42±1.31)μm，其中芎坑002和地洋002的内气孔相对较长，且显著长于其他3份茶树，芎坑001的内气孔长度相对最短。内气孔宽在(3.17±0.80)~(7.20±2.09)μm，地洋002与芎坑002的内气孔相对较宽，且显著宽于其他3份茶树，芎坑001的内气孔相对最窄。外气孔长在(22.20±1.65)~(27.86±2.20)μm，地洋002的外气孔相对最长，与福鼎大白茶、芎坑002差异不显著，与其他2份茶树差异显著，芎坑001的外气孔相对最短。外气孔宽在(16.42±1.22)~(20.94±2.31)μm，福鼎大白茶的外气孔相对最宽，显著宽于其他4份茶树，地洋001的外气孔相对最窄。气孔开度在(0.32±0.14)~(0.47±0.41)，福鼎大白茶的气孔开度相对最大，与地洋002差异不显著，与其他3份野生茶树差异显著。气孔器大小在(394.07±57.96)~(577.79±105.90)μm2，福鼎大白茶与地洋002的气孔器相对较大，且显著大于其他3份野生茶树，芎坑001的气孔器相对最小。气孔密度在(127.41±13.60)~(239.57±28.31)个·mm-2，福鼎大白茶和地洋001的气孔密度相对较大，且显著大于其他3份野生茶树，地洋002的气孔密度相对最小。4份野生茶树的气孔器大小均小于福鼎大白茶(福鼎大白与地洋002没有显著差异)。
表 2 寿宁野生茶树叶片气孔微形态特征Table 2. Stomatal micromorphology of tea leaf种质资源
Germplasm内气孔长
Inner stomatal
length/μm内气孔宽
Inner stomatal
width/μm外气孔长
Outer stomatal
length/μm外气孔宽
Outer stomatal
width/μm气孔开度
Stomatal
aperture气孔器大小
Stomach
size/μm2气孔密度
Stomatal
density(个·mm-2)产地
OriginⅠ 13.88±1.77b 4.77±1.44b 24.46±1.21b 16.42±1.22c 0.34±0.10b 402.03±41.27c 229.09±18.19a 福建寿宁 Ⅱ 17.21±2.17a 7.2±2.09a 27.86±2.20a 18.92±2.31b 0.42±0.13a 530.41±94.96ab 127.41±13.60b 福建寿宁 Ⅲ 10.42±2.00c 3.17±0.80c 22.2±1.65c 17.69±1.63bc 0.32±0.14b 394.07±57.96c 132.14±20.93b 福建寿宁 Ⅳ 17.42±1.31a 6.11±1.27ab 26.26±1.85ab 18.34±1.73b 0.35±0.06b 481.87±58.64b 141.88±14.55b 福建寿宁 Ⅴ 13.38±4.51b 5.31±3.06b 27.56±3.67a 20.94±2.31a 0.47±0.41a 577.79±105.90a 239.57±28.31a 福建福鼎 注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。表 3、4同。
Note：Different lowercase letters in a same column represent significant difference at 5% level. The same as table 3，4.由表 3可知，茸毛长度在(280.75±107.65)~(616.95±132.52)μm，福鼎大白茶的茸毛相对最长，显著长于其他4份野生茶树，地洋001的茸毛长度相对最短。茸毛粗度在(8.06±2.14)~(12.04±3.38)μm，芎坑001的茸毛相对最粗，芎坑002的茸毛相对最细。茸毛密度在(2.17±1.13)~(9.41±2.87)根·mm-2，地洋001的茸毛密度相对最大，且显著大于其他4份茶树，芎坑001的茸毛密度相对最小。与福鼎大白茶相比，4份野生茶树的叶片茸毛显著较短，茸毛粗度差异不大。地洋001的茸毛密度相对最大，且显著大于福鼎大白茶和其他3份野生茶树。
表 3 寿宁野生茶树叶片茸毛微形态特征Table 3. Trichome micromorphology of tea leaf种质资源
Germplasm茸毛长度
Trichome length/μm茸毛粗度
Trichome diameter/μm茸毛密度
Trichome density/(根·mm-2)产地
OriginⅠ 280.75±107.65c 8.22±2.22ab 9.41±2.87a 福建寿宁 Ⅱ 327.47±139.86c 9.18±1.96ab 6.11±1.58b 福建寿宁 Ⅲ 519.30±203.63b 12.04±3.38a 2.17±1.13c 福建寿宁 Ⅳ 307.54±107.81c 8.06±2.14b 2.18±0.72c 福建寿宁 Ⅴ 616.95±132.52a 9.36±0.89ab 6.67±1.27b 福建福鼎 从叶片纹饰方面来看，地洋001的叶腹面纹饰是平展状为一类，地洋002和芎坑001的纹饰为皱脊状属于一类，芎坑002和福鼎大白茶为波浪状属于一类。在电镜观察中发现，4份野生茶树种质资源的叶背和叶腹面均有很多丝状体(图 1)。
在对叶表皮的电镜观察中发现，4份野生茶树种质资源的大多数茸毛表层均有脱落的现象，且脱落的位置大多集中在茸毛的中下部长度(图 2)。茸毛的形态特征变化与品种、抗性等有密切关系[20]，同时根据实际情况推测可能与茶树的生长环境有关。
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图 2 寿宁野生茶树叶片茸毛表层微形态注：A为脱落前的茸毛表层，B为茸毛表层脱落的分界处，C为脱落后的茸毛。Figure 2. Surface micromorphology of trichome on tea leafNote:A.The surface oftrichome before shedding, B.The boundary of the trichome, C.The trichome after shedding.2.2 寿宁野生茶树花粉微形态特征
参考王开发等[21]和王伏雄[22]的方法，5份茶树的花粉均为单粒花粉，花粉均具三孔沟，孔沟均沿赤道方向120°均匀分布，为N3P4C5型(N为萌发孔的数目、P为萌发孔的位置、C为萌发孔的特征)花粉(图 3)。按照王开发等[21]提出的花粉最长轴分类标准，5份茶树花粉极轴长均值为25~50 μm，属于中等长度花粉。5份茶树花粉的极面观除地洋001为近圆形外，其他4份茶树均为三裂近三角形，赤道面观有超长球形、近扁球形外、近长球形、长椭圆形4种。三孔沟花粉的形状包括近球形(P/E值在0.75~1.33)、长球形(P/E值在1.33~2.00)及超长球形(P/E值>2)。地洋001的P/E值(2.04±0.49)最大，其花粉形状为超长球形，其他4份茶树花粉的P/E值均在0.75~1.33，花粉形状为近球形。
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图 3 寿宁野生茶树花粉形态扫描电镜观察结果注：A为花粉极面观，B为赤道面观，C为外壁纹饰，D为萌发沟。Figure 3. SEM observation on tea pollen morphologyNote: A.Pollen polar view, B.Equatorial view, C.Outer wall decoration, .D.Germination colpus.地洋001花粉外壁纹饰为微小疣状无穿孔，地洋002为光滑疣状并有较多穿孔，芎坑001和芎坑002都为粗糙疣状并有少量穿孔，福鼎大白茶为光滑疣状无穿孔。5份茶树花粉萌发沟内均具有块状或颗粒状纹饰。
由表 4可知，5份野生茶树种质资源的花粉极轴长(P)在(27.60±4.39)~(35.68±7.29)μm，其中福鼎大白茶极轴相对最长，与地洋002差异不显著，但显著长于其他3份野生茶树。赤道轴长(E)在(14.74±4.10)~(33.81±2.01)μm，地洋002的赤道轴相对最长，与地洋002差异不显著，但显著长于其他3份野生茶树。萌发沟长(L)在(19.81±3.35)~(25.94±2.22)μm，其中地洋002的萌发沟最长，与芎坑001差异不显著，显著长于其他3份茶树。花粉大小(P×E)在(427.69±153.94)~(1205.07±237.80)μm2，福鼎大白茶的花粉最大，与地洋002差异不显著，但显著大于其他3份野生茶树。花粉形状(P/E)的比值在(0.94±0.15)~(2.04±0.49)，地洋001的极轴长/赤道轴长(P/E)值较大，其他几种花粉极轴长/赤道轴长(P/E)值较小且无显著差异。沟极比(L/P)在(0.54±0.16)~(0.93±0.19)，其中芎坑001的沟极比(L/P)相对最大，福鼎大白茶沟极比(L/P)相对最小。
表 4 寿宁野生茶树花粉形态性状指标Table 4. Pollen morphology of tea cultivars种质资源
Germplasm极轴长(P)
Length of
polaraxis/μm赤道轴长(E)
Length of
equator axis/μm萌发沟长(L)
Length of germi-
nation colpus/μm花粉大小
P×E
/μm2花粉形状
P/E萌发沟长/
极轴长
L/P极面观
Polar view赤道面观
Equatorial
view外壁纹饰
Outer wall
decorationⅠ 28.55±3.32b 14.74±4.10c 23.23±3.34b 427.69±153.94c 2.04±0.49a 0.83±0.15ab 近圆形 超长球形 疣状无穿孔 Ⅱ 31.68±2.08ab 33.06±2.80ab 25.94±2.22a 1064.73±143.03ab 0.95±0.10b 0.82±0.06ab 三裂近三角形 近扁球形 疣状多穿孔 Ⅲ 27.60±4.39b 28.92±3.12b 24.77±3.14ab 814.70±168.30b 0.94±0.15b 0.93±0.19a 三裂近三角形 近长球形 疣状少量穿孔 Ⅳ 30.93±4.20b 31.06±3.22b 21.97±4.72bc 931.12±145.89b 0.98±0.18b 0.74±0.18b 三裂近三角形 近长球形 疣状少量穿孔 Ⅴ 35.68±7.29a 33.81±2.01a 19.81±3.35c 1205.07±237.80a 1.06±0.24b 0.54±0.16c 三裂近三角形 长椭圆形 疣状无穿孔 花粉观察结果表明，5份花粉都为中等大小花粉。地洋001、芎坑001和芎坑002的花粉均小于福鼎大白茶，地洋002与其无显著差别。其中地洋001的花粉最小，福鼎大白茶花粉大小约为地洋001的花粉大小的3~4倍。据束际林[23]用扫描电镜对34个野生茶树花粉的研究结果显示，野生茶树花粉的平均直径显著小于栽培种的平均直径，因此推测地洋001可能相对较为原始。其中地洋001的极轴长显著大于赤道轴长，且极轴长大约为赤道轴长的2倍，其余4份茶树则是赤道轴长大于极轴长，且两者相差不多。地洋001花粉形状与其他3份野生花粉差异较大，地洋001的花粉为超长球形，其他3份均为近球形。
地洋002、芎坑001、芎坑002与福鼎大白茶的极面观相似，都为三裂近三角形。地洋001极面观为近圆形，与其余4份茶树极面观差异较大，外壁纹饰都为疣状，其中地洋001与福鼎大白茶外壁纹饰均无穿孔，地洋002、芎坑001、和芎坑002都有穿孔(图 3)。
3. 讨论与结论
叶片微形态的差异一方面是植物物种本身特有的特征的体现，另一方面也是环境对其作用的体现。肖寒等[24]对云锦杜鹃亚组叶表皮微形态观察研究结果表明其毛被、气孔器及其周围纹饰的多样性和相似性可为分类学提供一定证据。这与本研究结果具有一致性。本研究结果表明，5份茶树的叶表蜡质纹饰有波浪状、平展状和皱脊状3种类型，表明了茶树叶片蜡质纹饰的多样性。4份野生茶树叶片背面均有圆形细长或短粗状的表皮毛，呈不规则分布，气孔器都为长卵形；茸毛长度、茸毛密度、气孔器大小、气孔密度等特征性状指标在不同品种间有一定差异性。这表明茶树茸毛、气孔、蜡质纹饰等可作为茶树分类及鉴别的重要形态性状[25-26]。本研究发现所供野生茶树的茸毛长度均显著小于栽培种，且4份野生茶树的大多数茸毛表层均有脱落的现象。福鼎大白茶是国家级优质茶树品种，茸毛特多、耐寒性强等是其较突出的优良性状，而地洋001茸毛密度显著大于福鼎大白茶。这表明茶树种质资源叶片形态结构关乎茶树抗性和品质[27-28]。
不同植物种类的花粉在长期的进化过程中往往形成独特的形态特征，这些形态特征具有很强的遗传保守性和稳定性，可以为植物的起源、分类、亲缘关系及杂交育种亲本的选配等方面提供重要依据[29]。Al-Hakimi等[30]对柳杉属9种植物的花粉和种子微形态的研究结果表明花粉纹饰、外壁厚度等特征有助于区分属内物种。本研究中4份野生茶树的花粉外壁纹饰都为疣状有穿孔或无穿孔，具有共性和差异性。束际林[23]对云南花粉形态的研究发现野生型茶树花粉大小小于一般栽培型茶树花粉。在本研究中野生茶树花粉大小都为中等花粉，但显著小于福鼎大白茶栽培种，表明野生茶树花粉大小显著小于栽培种，与前人结论相符。
本研究涉及的4份野生茶树种质资源与1份茶树栽培品种的叶片茸毛密度、长度、气孔密度和与花粉大小、外壁纹饰等微形态特征在不同品种间既有统一性，又有多样性差异，可为茶树种间分类、鉴别、系统关系探讨、良种选育提供参考依据，后续研究可通过分子生物学等手段对其分类鉴定和亲缘关系做进一步探讨。
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图 2 不同抗热保护剂处理下菌剂含水率
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；CK：空白；A：海藻糖；B：脱脂奶粉；C：H-MS；D：复合保护剂。
Figure 2. Moisture content of B. mucilaginosus encapsulated with various protectants
Data with different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); CK: blank control; A: trehalose; B: skimmed milk powder; C: H-MS; D: combination protectant.
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图 3 3种抗热保护剂的交互作用对菌剂菌体存活率影响的响应面
Figure 3. Response surface of effect by interactions of 3 protectants on B. mucilaginosus survival rate
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图 4 菌剂的扫描电镜图
Figure 4. SEM images of spray-dried encapsulated B. mucilaginosus on unmodified medical stone and H-MS
表 1 Box-Behnken试验设计因素水平
Table 1 Factor levels in Box-Behnken experiment design
水平
Level因素 Factor A 海藻糖
Trehalose/%B 脱脂奶粉 Skimmed
milk powder/%C H-MS/% −1 2 2 6 0 4 3 8 1 6 4 10 
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表 2 单因素试验结果
Table 2 Results of single factor experiment
抗热保护剂
Anti-thermal
protectant添加质量分数
Appending
proportion/%菌体存活率
Bacterial survival
rate/%空白
Blank0 34.15±1.07 海藻糖
Trehalose2 41.65±2.66 c 4 52.17±1.08 a 6 50.84±1.22 ab 8 48.17±1.95 b 脱脂奶粉
Skimmed milk powder1 36.25±2.27 b 2 39.78±1.73 ab 3 43.67±1.62 a 4 41.39±2.25 a H-MS 6 47.18±1.72 c 8 51.64±0.77 a 10 50.68±0.86 ab 12 48.96±1.30 bc 同一处理组内不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Different lowercase letters within the same numbered group indicate significant differences (P<0.05).
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表 3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Box-Behnken experimental design and results
试验号
Test numberA因素
A-factor levelB因素水平
B-factor levelC因素
C-factor level菌体存活率
Bacterial survival rate/%1 −1 −1 0 54.86 2 −1 1 0 60.14 3 1 −1 0 64.43 4 1 1 0 55.38 5 −1 0 −1 56.23 6 1 0 −1 67.53 7 −1 0 1 59.16 8 1 0 1 56.24 9 0 −1 −1 62.47 10 0 1 −1 64.61 11 0 −1 1 64.47 12 0 1 1 58.12 13 0 0 0 73.54 14 0 0 0 72.84 15 0 0 0 71.84
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表 4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of regression model
方差来源
Variance source自由度
Freedom离差平方和
Sum of squares均方
Mean squareF值
F valueP值
P value修正模型 Model 9 570.65 63.41 64.05 0.0001 A 1 21.75 21.75 21.97 0.0054 B 1 7.96 7.96 8.04 0.0364 C 1 20.64 20.64 20.85 0.0060 AB 1 51.34 51.34 51.86 0.0008 AC 1 50.55 50.55 51.07 0.0008 BC 1 18.02 18.02 18.20 0.0080 A2 1 256.36 256.36 258.98 ＜ 0.0001 B2 1 120.17 120.17 121.40 0.0001 C2 1 78.72 78.72 79.53 0.0003 残差 Residual 5 4.95 0.99 失拟项 Lack of fit 3 3.49 1.16 1.59 0.4080 纯误差 Pure error 2 1.46 0.73 总计 Total 14 575.60
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