小丑鱼隶属于雀鲷科Pomacentridae，双锯鱼亚科Amphiprioninae。双锯鱼亚科包括棘颊雀鲷属Premnas和双锯鱼属Amphiprion。目前已发现的小丑鱼约28种，棘颊雀鲷属仅有1种。基于形态学特征，双锯鱼属又进一步分为4个亚属(Actinicola、Paramphiprion、Phalerebus、Amphiprion)。目前，国内对于小丑鱼的研究主要集中在生活习性^[1-2]、人工繁殖及幼体培育^[3-6]、胚胎发育^[7-9]、光照与体色^[10]等方面，而分子遗传方面的研究较少。国外学者Timm等^[11]用线粒体控制区分析印度马来群岛公子小丑鱼的种群遗传结构和基因流，得出该群岛的不同区域之间存在高度的多样性和差异化；Jang-Liaw等^[12]等用12S rRNA序列对雀鲷科的48种鱼构建系统发生树，得出公子小丑鱼A. ocellaris、黑边公子小丑鱼A. percula和透红小丑鱼P. biaculeatus聚为一支，并具有原始亲缘关系基础；Tang^[13]利用12S rRNA和16S rRNA对23种雀鲷科鱼类进行MP法构建分子系统进化树也得出透红小丑鱼和公子小丑鱼、黑边公子小丑鱼聚为一支，双锯鱼亚科属于单一群系演化的结果。

双锯鱼亚科种类的鉴定主要依赖形态学方法，以体色和条带数目为主要特征。然而不同种类的小丑鱼形态差别不大，同一种类常因外在因素的变化或成长阶段的不同，体表颜色和花纹也会随之改变，例如分类学上透红小丑鱼是棘颊雀鲷属中单独的一类，现在市场上出现一种金透红小丑鱼，这两类幼鱼期都是白色条纹，但金透红小丑鱼白色条纹成年后变成金黄色，市场价格比透红小丑鱼略贵，他们是否为同一物种说法不一，这都给传统分类学鉴定增加难度。因此，有必要用分子遗传学手段对小丑鱼的遗传结构进行进一步阐述。

鱼类线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有母系单倍体遗传特性，具有分子小、结构简单、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，是研究属、种间系统发育较好的分子标记^[14-16]。16S rRNA、COX1和Cytb是鱼类体内线粒体基因，具有较好的系统发育信息，通过对这些基因进行PCR扩增和序列测定，可以对双锯鱼亚科鱼类种间变异程度和亲缘关系进行分析比较。本研究以菲律宾海域和印尼巴东海域的11种小丑鱼为研究对象，对其16S rRNA、COX1和Cytb基因序列的变异情况进行分析，建立分子系统树，进一步探讨小丑鱼分类学中存在的争议，为小丑鱼的分类体系完善提供参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

小丑鱼采集于西太平洋南海菲律宾海域、印尼巴东海域(表 1)，每种2条。根据Allen^[17]分类方法对样本外部形态进行初步鉴别，测序后与NCBI数据库进行对比确定物种。为探索双锯鱼亚科的系统发育关系，以雀鲷亚科条纹豆娘鱼Abudefduf vaigiensis和鲅科的蓝点马鲛Scomberomorus niphonius作为外群构建分子系统发生树，其Genbank登录号分别为AP006016、KY228987。

表  1  小丑鱼种类及采集信息

Table  1.  Sampling and species of anemonefish under study

种类	拉丁名	亚属	采集位置
鞍背小丑鱼	Amphiprion polymnus	Paramphiprion	菲律宾海域
公子小丑鱼	Amphiprion ocellaris	Actinicola	菲律宾海域
黑边公子小丑鱼	Amphiprion percula	Actinicola	印尼巴东海域
黑红小丑鱼	Amphiprion melanopus	Amphiprion	菲律宾海域
印度红番茄小丑鱼	Amphiprion ephippium	Amphiprion	菲律宾海域
红小丑鱼	Amphiprion frenatus	Amphiprion	菲律宾海域
双带小丑鱼	Amphiprion clarkii	Amphiprion	菲律宾海域
宽带小丑鱼	Amphiprion latezonatus	Paramphiprion	菲律宾海域
银线小丑鱼	Amphiprion akallopisos	Phalerebus	菲律宾海域
金透红小丑鱼	Premnas epigrammata*	premnas	印尼巴东海域
透红小丑鱼	Premnas Biaculeatus	premnas	菲律宾海域
注：*表示对学名说法不一，有人称之为The Gold Stripe Maroon Clownfish。

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1.2   DNA提取、扩增和测序

采用基因组抽提试剂盒(TaKaRa公司)提取11种小丑鱼鳍条组织的总DNA。根据NCBI下载有关小丑鱼基因序列设计引物。扩增16S rRNA引物序列为16S rRNA F：5′-AAG GGG AGG CAA GTC GTA AC-3′和R：5′-TGT TTA AAG GGC TTA GGT CT-3′。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min 40 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增COX1引物序列为COX1 F：5′-ACT CAG CCA TCC TAC CTG TGG CAA T-3′和R：5′-GGT TCG AYT CCT CCC TTT CTC GTA G-3′，反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min；循环35次；72℃终延伸10 min。扩增Cytb引物序列为Cytb F：5′-CCA GGA CCA GTG ACT TGA AAA CC-3′和R：5′-GCA GTA GGA AGG AYT TTA ACC TTC G-3′, 反应条件为：95℃预变性5 min，然后95℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。反应体系25 μL, 包括: 2 μL DNA模板, 正向和反向引物各1 μL，2 μL dNTPs，2.5 μL 10×buffer (Mg²⁺)及0.2 μL Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司TaKaRa)，灭菌超纯水补足剩余体系。1%的琼脂糖电泳对PCR扩增产物进行检测。PCR产物经鉴定后送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定。

1.3   数据分析

测序所得线粒体16S rRNA、COX1 和Cytb序列片段利用DNAStar进行拼接并辅以人工校对，通过BLAST (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)检索来确定目的片段。运用MEGA5.02^[18]软件对基因序列进行比对分析。运用PAUP4.0b10^[19]软件对16S rRNA、COX1和Cytb基因进行同质性检验(Parition homogeneity test)。通过DnaSP v5^[20]软件确定多态位点数、转换与颠换的比值(transition /transversion，Ts /Tv)和碱基组成。根据Kimura 2-parameter模型，用MEGA5.02邻接法(NJ法)分析系统树状图和用遗传距离分析样本间的关系，所用方法均运用Bootstrap检验重复，抽样1 000次，其余参数为默认；以PAUP软件构建ML树, 以1 000次的Bootstrap重复抽样来检验系统树各分支的置信度；用MrBayes^[21]软件构建贝叶斯树，基于马可夫蒙特卡罗(MCMC)进行100万代运算，每1 000代对系统树进行一次抽样，在舍弃老化样本后根据剩余样本构建一致树，并计算相关参数，系统树各分支的置信度通过后验概率来检验。

2.   结果与分析

2.1   序列特征

对16S rRNA、COX1 和Cytb基因进行同质性检验，结果为P=0.82，说明三者可以用于联合分析。对11种小丑鱼的16S rRNA、COX1和Cytb基因供分析的序列多重比对后，共得到序列长度为4 388 bp，其中出现17个碱基的插入或缺失，多态位点1 028个，简约信息位点616个，转换位点289个，颠换位点136个，转换与颠换比为2.12。A、T、C和G碱基的平均含量分别为28.8%、26%、27.3%和17.9%，其中A+T平均含量为54.7%，C+G平均含量为45.3%，A+T平均含量大于C+G平均含量，这与鱼类mtDNA富含A、T的结论一致。

2.2   遗传距离

基于Kimura双参数模型来计算遗传距离，以确定类群间的遗传分化程度，检测结果见表 2。由检测结果可知：在所研究的11种小丑鱼中，种间距离从0.002(黑边公子小丑鱼A. percula与公子小丑鱼A. ocellaris)到0.101(透红小丑鱼P. biaculeatus和宽带小丑鱼A. latezonatus)，平均种间遗传距离为0.068。

表  2  11种小丑鱼间的遗传距离

Table  2.  Genetic distances among 11 species of anemonefish according to kimura-2-parameters model

项目	银线小丑	双带小丑	印度红番茄小丑	红小丑	宽带小丑	黑红小丑	公子小丑	黑边公子小丑	鞍背小丑	透红小丑	金透红小丑
银线小丑
双带小丑	0.046
印度红番茄小丑	0.029	0.048
红小丑	0.029	0.048	0.009
宽带小丑	0.039	0.052	0.032	0.031
黑红小丑	0.030	0.047	0.010	0.002	0.030
公子小丑	0.098	0.100	0.094	0.094	0.098	0.094
黑边公子小丑	0.098	0.099	0.093	0.093	0.098	0.093	0.002
鞍背小丑	0.038	0.052	0.030	0.028	0.020	0.028	0.094	0.093
透红小丑	0.096	0.098	0.096	0.095	0.101	0.094	0.093	0.093	0.098
金透红小丑	0.093	0.097	0.093	0.091	0.098	0.091	0.091	0.091	0.095	0.010

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2.3   系统发育分析

3个线粒体基因序列拼接构成长度总共4 388 bp用于重建系统发育。以条纹豆娘鱼A. vaigiensis和蓝点马鲛S. niphonius为外群，采用邻接法、最大似然法和贝叶斯法分别构建了NJ树、ML树和贝叶斯树。

3棵分子树的拓扑结构均支持：双锯鱼亚科为单系发生，透红小丑鱼是伴随双锯鱼属一起发生，但双锯鱼属不为单系发生，Actinicola亚属归为一支并位于该支的底端，而Paramphiprion, Phalerebus 和Amphiprion 3等个亚属归为一支。

贝叶斯法和邻接法、最大似然法的分析结果显示了不同之处。NJ树和ML树(图 1~2)的拓扑结构显示黑边公子小丑鱼和公子小丑鱼聚为一支，其他的小丑鱼聚为第二支系。第二支系被分为2个小支系，其中透红小丑鱼和金透红小丑鱼聚为一支，第二小支(置信度100%)是由Paramphiprion亚属、Phalerebus亚属和Amphiprion亚属聚为一支。贝叶斯树显示，所有内群也形成2个支系，各枝的支持率较高(图 3)。其中，Paramphiprion亚属、Phalerebus亚属和Amphiprion亚属聚为第一支系，透红小丑鱼和金透红小丑鱼以及Actinicola亚属聚为第二支系。

图  1  基于16S rRNA、COX1 和Cytb基因序列构建的NJ树

Figure  1.  NJ phylogenetic tree of anemonefish based on mitochondrial 16S rRNA, COX1 and Cytb genes

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图  2  基于16S rRNA、COX1和Cytb基因序列构建的ML树

Figure  2.  ML phylogenetic tree of anemonefish based on mitochondrial 16S rRNA, COX1 and Cytb genes

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图  3  基于16S rRNA、COX1 和Cytb基因序列构建的贝叶斯树

Figure  3.  Bayesian phylogenetic tree of anemonefish based on mitochondrial 16S rRNA, COX1 and Cytb genes

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3.   讨论

3.1   序列分析

Folmer等^[22]认为碱基A+T含量高的线粒体基因在进化中更具优势，11种小丑鱼在16S rRNA+COX1+Cytb的联合基因序列中发现，碱基A+T的平均含量高于G+C的平均含量，G含量最低，存在偏向性，组成特征与其他鱼类线粒体DNA碱基组成的特点相似^[23-24]。另外，DNA进化过程中，碱基转换发生的频率要比颠换发生的频率高。利用转换和颠换的比值可以估计碱基序列的饱和度。一般情况下，分歧时间越短、亲缘关系越近的分类单元之间，其转换与颠换的比值越大。若转换与颠换的比值小于2.0，认为该基因序列发生的突变已经达到饱和。本研究中所分析的联合基因片段碱基转换/颠换比值为2.12，表明基因序列的位点未达到饱和，序列中的碱基替代均具有系统发育意义^[25]，可以用来作为小丑鱼的遗传分析。

3.2   11种小丑鱼的系统发育关系

本研究所构建的系统树的拓扑结构表明双锯鱼属不为单系发生。在双锯鱼属中，公子小丑鱼和黑边公子小丑鱼聚成一支，除此之外的Paramphiprion、Phalerebus 和Amphiprion等3个亚属聚为一支。公子小丑鱼和黑边公子小丑鱼与同属的其他小丑鱼分开并位于该支的底端，所得的结果与Glenn等^[28]、Jang-Liaw等^[12]和Tang^[13]一致。Glenn等^[28]认为这主要与分布域形成史有关，这一支系种类的端始种在珊瑚三角区发生基因流中断，没有辐射到其他区域，分子钟可追溯到1900万年，形成双锯鱼亚科分子亲缘关系基础。在Paramphiprion、Phalerebus 和Amphiprion等3个亚属这一小支中，黑红小丑鱼、红小丑鱼和印度红番茄小丑鱼亲缘关系最近，3种同属于双锯鱼亚属Amphiprion里的大眼类种系，鞍背小丑鱼和宽带小丑鱼亲缘关系最近，此两种同属于Paramphiprion亚属的鞍背类种系，用分子的方法与形态学分类得到的结果相符。Amphiprion亚属中的双带小丑鱼与此亚属中的其他小丑鱼不汇成一支，可能是双带小丑鱼分布广泛，游泳能力强，对海葵的依赖性较弱，能与较多海葵共生，较强的生活能力，在长期环境中产生一定的进化的结果。

Allen^[29]认为透红小丑鱼外形特殊，把透红小丑鱼从双锯鱼属中独立出来作为双锯鱼亚科中棘颊雀鲷属的单一种，此形态学分类与Quenouille等^[30]用分子方法得到结果不一致。Quenouille等^[30]利用ATP8、ATP6和Cytb基因对雀鲷科的103种鱼运用Bayesian法建树，得出双锯鱼亚科是单一系统发生的群体，建议将棘颊雀鲷属重新归类。本研究所建系统树再次证明了从分子数据的角度来看双锯鱼亚科为单系发生，透红小丑鱼是伴随双锯鱼属一起发生，建议对棘颊雀鲷属进行重新分类定位。

关于透红小丑鱼在双锯鱼属的具体定位，本研究所建的系统树没能取得一致的结果。NJ树和ML树显示透红小丑鱼和除Actinicola亚属之外的其他小丑鱼汇聚成一支，却没能和公子小丑鱼和黑边公子小丑鱼聚为一支，而贝叶斯树却显示透红小丑鱼和公子小丑鱼、黑边公子小丑鱼聚为一支，并且此结果与Jang-Liaw等^[12]、Tang^[13]和Quenouille等^[30]结果一致。3棵树得到的结果有部分差别，推测可能是物种自身的特点对系统发育树构建产生的影响。Jeffroy等^[31]认为基因组数据中核苷酸组成偏好会影响系统发育树的准确构建，所以采用不同的系统发育分析方法所得到的结果并不一致。小丑鱼历史进化不明了缺少相关的化石信息，同一种存在多个近缘种或亚种且常因外界环境的变化而发生变化，从而推测物种自身进化可能对系统发育树构建产生影响。究竟应该是按照Jang-Liaw等^[12]、Tang^[13]和Quenouille等^[30]的观点将透红小丑鱼和公子小丑鱼、黑边公子小丑鱼一起归入Actinicola亚属中，还是按本文NJ树和ML树得到的结果将透红小丑鱼和除Actinicola亚属外的小丑鱼归为一支，仍然是一个值得探索的问题。

关于金透红小丑鱼和透红小丑鱼是否为同一种，不同的研究得出的结论不一致。金透红小丑鱼与透红小丑鱼形态上的区别是金透红小丑鱼身体上的白色条带呈金黄色。Allen^[32]认为颜色差异不能作为物种鉴定的诊断特征，Michael^[33]认为这两种小丑鱼颜色上的变化是由于营养等一系列因素引起的，白色条带和黄色条带只是两种不同的颜色模式；也有人认为金透红小丑鱼与透红小丑鱼是不同的种，Fowler^[34]在1904年把来自于苏门答腊岛的金透红小丑鱼作为一个独特的种，并把此学名命名为 Premnas epigrammata。本研究基于Kimura双参数模型计算遗传距离的研究显示，金透红小丑鱼与透红小丑鱼之间的遗传距离数值为0.01，且小于种间的平均遗传距离0.068。Shaklee等^[35]提出鱼类在属、种和种群三级水平上的遗传距离分类判别标准分别为0.9、0.3、0.05。Avise^[36]认为同一种的个体间一般有0.1%~5%的差异水平，杜启艳等^[37]提出DNA序列间的遗传距离的差异如果小于0.02，则小于种内的遗传差异。因此，笔者认为金透红小丑鱼与透红小丑鱼尚未达到种的分化标准，属于同一种。当然这结果可作为现代分类学研究的一个补充，需要更多的分类方法来确定其分类地位。