Construction and Biofilm Formation of yibT-and-csgD-deleted Salmonella typhimurium
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摘要:目的 通过构建鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）yibT、csgD双基因缺失株及缺失株的回补株，探究其对鼠伤寒沙门菌生物膜形成的影响，以期为沙门菌的有效防控提供新策略。方法 以鼠伤寒沙门菌野生株CVCC541（wild-type, WT）为研究对象，利用λ-red同源重组技术构建yibT和csgD基因缺失株；利用重组载体技术构建其基因回补株；利用结晶紫染色法比较鼠伤寒沙门菌突变株生物膜形成能力的差异；通过苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量、半固体平板测定运动能力的变化；比较不同突变菌株自聚集能力的变化；通过扫描电镜观察生物膜结构；最后利用荧光定量PCR技术鉴定生物膜形成过程中关键基因的mRNA表达水平。结果 成功构建了鼠伤寒沙门菌yibT和csgD的双基因缺失株WTΔyibTΔcsgD和csgD基因单缺失株WTΔcsgD及基因缺失株的回补株WTΔcsgDΔyibT/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD。 yibT和csgD基因的缺失降低了生物膜的形成能力、胞外多糖含量和自聚集能力，增强了运动能力；invF和sdiA基因的mRNA表达水平下降。结论 yibT和csgD基因缺失会降低鼠伤寒沙门菌的生物膜形成能力。Abstract:Objective Strains of Salmonella typhimurium with yibT and/or csgD deleted were created to observe the effect on its biofilm formation for effective prevention and control of the foodborne pathogen.Method The λ-red homologous recombination technique was applied to create the gene-deleted mutants, WTΔyibTΔcsgD and WTΔcsgD, of WT S. typhimurium (CVCC541). Subsequently, the gene-complemented strains were also obtained using recombinant vector technology. Differences of the mutants in biofilm formation were determined by crystal violet staining, content of exopolysaccharide measured by phenol-sulfuric acid, mobility tested on semi-solid agar plates, and self-aggregation monitored. Under a scanning electron microscope, biofilm structure was observed. Finally, mRNA expressions of the target genes in the biofilm were identified by fluorescence quantitative PCR.Result A double-gene deleted WTΔyibTΔcsgD, a WTΔcsgD without csgD, and their respective complemented strains, WTΔcsgDΔyibT/pcsgD and WTΔcsgD/pcsgD, were successfully obtained. The double-gene deletion significantly reduced the ability in forming biofilm, the content of exopolysaccharide, and the aggregation of the genes to targets, and the mRNA expressions of invF and sdiA in WT S. typhimurium.Conclusion Deletion of yibT and csgD significantly impacted some critical biofunctions of S. typhimurium that could become a new approach for control of the foodborne disease.
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Keywords:
- Salmonella typhimurium /
- yibT /
- csgD /
- biofilm
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0. 引言
【研究意义】沙门菌（Typhimurium）是引起食源性疾病的重要病原菌之一，目前在世界范围内已经鉴定出超过
2600 多种沙门菌的血清分型[1]。最常见的血清型通常分为两类，一种是伤寒沙门氏菌，包括甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和丙型副伤寒沙门菌等；另一种是非伤寒沙门氏菌，如肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌[2]。目前，鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium, ST）作为引起胃肠炎的重要病原菌之一，分布在各种动物及动物制品中，包括家禽（Gallus）[3]、牛肉（Bos Taurus）[4]等。一旦感染鼠伤寒沙门菌，机体大多会出现畏寒、发热，伴恶心、呕吐、乏力及全身酸痛等症状，且起病急骤，体弱者还会出现高热症状，严重者还可能引起其他并发症，如急性肾功能衰竭等[5]。此外，有的机体在感染鼠伤寒沙门菌后无症状，成为细菌携带者，传染给其他机体，给人类生命安全带来极大的威胁。生物膜是细菌生长的一种自然形式，在生态位中无处不在，被认为是病原微生物和非病原微生物所采用的一种通用的生存机制[6]。生物膜为鼠伤寒沙门菌提供了一种保护机制，使其更难以被常规的清洁和消毒方法杀灭。生物膜中的沙门菌可以持续释放到环境中，导致持续的感染风险。膜内菌具有更高的耐药性，使得治疗更加困难[7]。生物膜也可以成为沙门菌的传播途径，增加了感染的风险。csgD基因是生物膜形成的主要中枢，属于LuxR家族[8]。csgD基因的表达会促进细菌合成胞外聚合物，如卷曲菌毛和纤维素，这些聚合物是构成生物膜的重要组成部分，影响生物膜的形成和结构稳定性。而未表征蛋白yibT基因可能与csgD基因共同作用参与生物膜形成的调控，以此展开研究，有助于开发新的抗菌策略，为防控和治疗相关疾病提供理论依据。【前人研究进展】近年来，细菌生物膜造成的相关危害对人类公共健康和安全构成了巨大挑战，生物膜相关感染很难根除。James等[9]发现，在50例慢性感染病例中，60%的慢性感染是由生物膜引起的；Haesler等 [10]的报告中提出，临床约80%由微生物引起的慢性感染与生物膜有关。生物膜的形成也对城市化发展进程造成不可避免的损失[11]；下水道内壁存在的生物膜给基础设施建设带来了潜在风险，可能导致管道腐蚀、下水道爆炸、垃圾泄漏等不利影响[12]。未表征蛋白YibT现在仍鲜有报道，有报道将其作为构成肠炎沙门菌亚种的大规模数据库的12种生物标记蛋白之一[13]，是血清型生物标志物[14]。Si等[15]发现YibT为膜相关蛋白，下调表达yibT基因可以通过调节膜脂肪酸组成来影响大肠杆菌丁醇耐受性；Wang等[16]的研究也表明，缺失glgS和yibT基因能够增加大肠杆菌丁醇耐受性。本课题组前期发现yibT基因缺失时，鼠伤寒沙门菌的外界应激能力和生长速度均发生明显改变，与菌体生物膜形成有关的重要调控因子csgD表达水平显著下调[17, 18]。由此推测，yibT可能参与鼠伤寒沙门菌生物膜的形成。参与鼠伤寒沙门菌生物膜形成的因子众多且复杂，它们共同协作以确保生物膜的稳定形成和细菌在其中的生存，其中包括csgD、群体感应系统（Quorum sensing system, QS）、环二鸟苷酸（cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP）、非编码RNA等，其中QS是鼠伤寒沙门菌细胞间的通讯过程，在生物膜形成过程中，其利用 QS 系统来监测其种群密度，当细菌密度达到一定阈值时，QS 系统被激活，触发一系列基因表达的变化，进而促进生物膜的形成。这些基因的表达调控涉及多个层面，包括生物膜结构成分的合成、黏附蛋白的表达以及细胞间信号传递等[19]。【本研究切入点】目前，yibT与csgD参与生物膜形成的分子机制尚不清楚，而本研究在前期构建的鼠伤寒沙门菌yibT基因缺失株的基础上进一步敲除csgD基因，通过测定不同基因缺失状态下细菌生物活性、生物膜形成相关因子表达变化来探究其与生物膜形成的关系。【拟解决的关键问题】拟构建鼠伤寒沙门菌yibT与csgD的双基因缺失株，探究其在生物膜形成中的作用，以期丰富沙门菌致病的分子机制，为沙门菌病的有效防控和新型兽药的研发提供新的作用靶标和理论依据。1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株
鼠伤寒沙门菌CVCC541（WT）、yibT基因缺失株（WTΔyibT）及缺失株的回补株（WTΔyibT/pyibT），均由实验室保存。
1.1.2 质粒
供试质粒pKD46、pKD4、pCP20和pET28a均由实验室保存。
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计
查询NCBI上鼠伤寒沙门菌的csgD、luxS、sdiA、invF和16S基因序列以及所用质粒的序列，使用Primer premier 6.0软件设计相关基因扩增引物，详见表1和表2。
表 1 PCR扩增引物Table 1. Primers applied for PCR引物名称
Primer names引物序列5′-3′
Primer sequences引物长度
Primer length/bp反应长度
Reaction length/bpP1 TTTCATCATGTTTAATGAAGTCCATAGTAGTCATGGTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 59 1600 P2 ATCTTTTTGAAAAGATTATAAAGATGTGTCTTAACCGTACATATGAATATCCTCCTTAG 59 P3 GCTGTCAGATGTGCGATT 18 723 P4 TGCTACAATCCAGGTCAGA 19 P5 CCGCTCGAGCCGCCTGAGATTATCGTTTG 29 649 P6 CGCGGATCCATGTTTAATGAAGTCCATAG 29 P7 CAGCCAGGCGTTCCGTGAAT 20 469 P8 AGCCGCCGGTAATATTCCAGAC 22 表 2 荧光定量PCR引物序列Table 2. Primers applied for qRT-PCR引物名称
Primer names引物序列5′-3′
Primer sequences引物长度
Primer length/bpluxS-F ACTGATGGGCTGCCTGTATC 20 luxS-R
sdiA-F
sdiA-R
invF-F
invF-R
16S-F
16S-RGCCTCTTCGCTATTACGCCA
ATGAAGCGAAGGCGATGT
CGAGGAGCAGCGTAAACT
ACGATGAGAATGCTGGGAGA
TATGTGAAGGCGATGAGTAAC
TTACCCGCAGAAGAAGCACC
CTCAAGGGCACAACCTCCAA20
18
18
20
20
20
201.2.2 鼠伤寒沙门菌yibT和csgD基因缺失株的构建
利用λ-Red同源重组技术，首先以pKD4质粒为模板，P1、P2（表1）为引物，PCR扩增含csgD两端同源臂和卡那霉素抗性基因的打靶片段。将打靶片段转入含pKD46质粒的WTΔyibT中，在卡那霉素（50 μg·mL−1）抗性平板筛选，于37 ℃振荡培养，利用P3、P4（表1）引物进行扩增鉴定并测序分析，序列正确的即WTΔcsgD:Kan菌株，划线保菌，4 ℃保存备用。
将温敏质粒pCP20转入WTΔcsgD:Kan菌株中，在氨苄青霉素（50 μg·mL−1）抗性平板上筛选，挑取单菌落在30 ℃振荡培养。以P3、P4（表1）为引物进行鉴定。鉴定成功的菌株在42 ℃条件下振荡培养24 h，以消除pCP20质粒，然后送往生工生物工程（上海）有限公司测序验证，序列正确的即WTΔyibTΔcsgD菌株。按照上述的方法，以WT为目的菌株构建csgD基因单缺失株WTΔcsgD。
1.2.3 鼠伤寒沙门菌yibT和csgD基因缺失株的回补株构建
以WT为模板，P5、P6（表1）引物扩增两端含酶切位点的csgD目的片段；提取pET28a质粒，分别将目的片段和pET28a质粒与限制性核酸内切酶XhoⅠ和BamHⅠ混合，于PCR仪进行双酶切反应，反应程序为30 ℃，30 min，37 ℃，30 min；酶切后的目的基因和pET28a质粒通过琼脂糖凝胶电泳鉴定回收，在T4 DNA连接酶的作用下，于16 ℃低温恒温槽过夜连接。次日将连接产物分别电转入WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD中，在卡那霉素抗性（50 μg·mL−1）平板上筛选，利用P7、P8（表1）引物进行鉴定，对条带正确的菌株测序验证，序列正确的即为WTΔyibTΔcsgD/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD。
1.2.4 鼠伤寒沙门菌突变株的生物膜形成能力测定
参照前人的试管法[20]和96孔板法[21]稍作修改，对上述鼠伤寒沙门菌突变株的生物膜形成能力进行测定。首先，将培养至OD600 nm为0.6的菌1∶100（V/V）分别接种于试管和24孔板中，37 ℃静态培养48 h后，利用1%（V/V）结晶紫溶液对生物膜进行染色[22]，用PBS洗涤试管和孔，晾干，将每个试管拍照记录；用95%乙醇将24孔板的生物膜溶解，通过590 nm处的光密度（OD590 nm）量化每个孔中的生物膜。
1.2.5 鼠伤寒沙门菌突变株生物膜状态观察
参照Gomes等[23]的方法，利用Quanta 200环境扫描电镜（荷兰飞利浦电子光学仪器公司）观察各突变株的生物膜状态。将无菌爬片（直径为9 mm）放入24孔反应板中，每孔加入2 mL LB培养基，将鼠伤寒沙门菌突变株按1∶100（V/V）接种于孔板中，在37 ℃培养箱静置培养20 h，用PBS洗去表面浮游菌，在4 ℃条件下用2.5%戊二醛固定样品2 h，然后分别在30%、50%、70%、80%、90%、100%（重复两次）的无水乙醇梯度脱水，每次脱水15 min，使用临界点干燥机干燥爬片，然后在离子溅射仪（上海禾早仪器有限公司）涂覆钯金薄膜，高真空模式下，用SEM观察裸露表面的菌体生物膜形成情况。
1.2.6 鼠伤寒沙门菌突变株胞外多糖含量的检测
以标准葡萄糖溶液为基准，按照苯酚-硫酸法绘制标准曲线。根据Akiyama等[24]的方法，利用碱提法提取各突变株的胞外多糖，即将过夜培养的鼠伤寒沙门菌突变株复接培养8 h，用无菌生理盐水清洗并重悬，加入200 μL 37%甲醛溶液以破坏细菌的细胞膜和细胞内结构，加入与培养基等量的1 mol·L−1 NaOH与细菌充分混合确保细菌细胞壁充分吸水膨胀并破裂，以便多糖能够游离出来，在4 ℃提取3 h，
12000 r·min−1离心20 min，弃上清，留沉淀，测定其胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS）的含量。1.2.7 鼠伤寒沙门菌突变株运动能力的分析
根据Kalai Chelvam等[25]的方法，在0.5% LB 琼脂平板上检测各突变株的运动能力，将过夜培养的鼠伤寒沙门菌突变株传代培养至OD600 nm为0.6，然后吸取2 μL滴于半固体平板的正中央，置于37 ℃培养18 h，观察各菌株的扩散情况，拍照并记录运动直径的大小。
1.2.8 鼠伤寒沙门菌突变株自聚集能力的测定
利用He等[22]的方法加以修改，将鼠伤寒沙门菌突变株的过夜培养物按1∶100（V/V）复接于5 mL LB培养基中，于37 ℃静置孵育24 h，检测上层600 nm光密度（OD600 nm-1），然后仔细涡旋混匀并在600 nm（OD600 nm-2）下进行评估。细菌细胞自聚集计算公式如下：
自聚集/%=(1−OD600 nm-1/OD600 nm-2)× 100
1.2.9 鼠伤寒沙门菌突变株生物膜形成的关键mRNA表达水平的测定
选择QS系统中的几个关键因子luxS、sdiA和invF基因测定mRNA表达水平。将过夜培养的菌株1∶100（V/V）接种于5 mL培养基中培养至OD600 nm为0.7，利用Trizol法提取各鼠伤寒沙门菌突变株的总RNA，利用反转录试剂盒反转录为cDNA，引物见表2。PCR程序为95 ℃，30 s；95 ℃和60 ℃各10 s循环40次；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。以16S作为参考基因。
1.3 数据处理
数据均采用平均值±标准差表示，应用GraphPad Prism软件对数据进行分析，采用单因子方差（One-way ANOVA）进行统计学分析，P＜0.05差异显著，P＜0.01差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD菌株的鉴定
将csgD打靶片段转化之后，用P5、P6（表1）引物进行PCR鉴定，以野生株WT为阴性对照，以WT为模板扩增出大小为723 bp的csgD基因条带，以WTΔyibTΔcsgD:Kan和WTΔcsgD:Kan菌株为模板扩增出csgD基因打靶片段
1600 bp，与测序结果一致，表明同源重组发生，csgD基因已被敲除，菌株WTΔyibTΔcsgD:Kan和WTΔcsgD:Kan成功构建（图1）。![]()
图 1 菌株WTΔyibTΔcsgD:Kan和WTΔcsgD:Kan的PCR鉴定M：D2000 Marker；1：WTΔyibTΔcsgD:Kan PCR产物；2： WTΔcsgD:Kan PCR产物；3：WT PCR产物。Figure 1. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD:Kan and WTΔcsgD:KanM: D2000 marker; 1: PCR product of WTΔyibTΔcsgD:Kan; 2: PCR product of WTΔcsgD:Kan; 3: PCR product of WT.由图2可知，与WT相比，以缺失株WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD为模板均扩增出287 bp的条带，而野生株扩增出723 bp大小的条带，测序结果与之一致，表明WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD菌株构建成功。
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图 2 菌株WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD的PCR鉴定M：D2000 Marker；1：WT 的 PCR 产物；2：WTΔyibTΔcsgD 的 PCR 产物；3：WTΔcsgD 的 PCR 产物。Figure 2. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD and WTΔcsgDM: D2000 marker; 1: PCR product of WT; 2: PCR product of WTΔyibTΔcsgD; 3: PCR product of WTΔcsgD.2.2 WTΔyibTΔcsgD/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD菌株的鉴定
转入pET28a-csgD重组质粒的WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD菌株均扩增出
1118 bp的条带，而以含有pET28a质粒的菌株为模板，则扩增出469 bp的条带，测序结果与之一致，表明回补株及过表达株WTΔcsgD/pcsgD和WTΔyibTΔcsgD/pcsgD均成功构建（图3）。![]()
图 3 WTΔyibTΔcsgD/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD的PCR鉴定M：D2000 Marker；1：WTΔyibTΔcsgD/pcsgD的PCR产物；2：WTΔcsgD/pcsgD的PCR产物；3：转入空质粒pET28a的菌 PCR产物。Figure 3. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD/pcsgD and WTΔcsgD/pcsgDM: D2000 marker; 1: PCR product of WTΔyibTΔcsgD/pcsgD; 2: PCR product of WTΔcsgD/pcsgD; 3: PCR product of bacteria transferred to empty plasmid pET28a.2.3 yibT与csgD缺失株对鼠伤寒沙门菌生物膜形成能力的影响
各突变株在气液界面形成的生物膜见图4A。与WT相比，yibT基因缺失后仅能形成稀薄、破碎的生物膜，csgD基因缺失后几乎不能形成生物膜；24孔板测定生物膜的形成结果见图4B、C，yibT和csgD基因缺失后的结晶紫的颜色较野生株变浅，生物膜的含量极显著减少（P＜0.01），表明yibT与csgD的缺失减弱了鼠伤寒沙门菌的生物膜形成能力。
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图 4 鼠伤寒沙门菌突变株的生物膜形成A：试管法测定生物膜能力；B：二十四孔板测定生物膜能力；C：生物膜的结晶紫量化。*表示与WT差异显著（P＜0.05），**表示与WT差异极显著（P＜0.01）。下同。Figure 4. Biofilm formation of S. typhimurium mutantsA: test tube method for determining biofilm formation; B: 24-well plates for determining biofilm formation; C: crystal violet quantization of biofilm. Results are comparisons with WT; *: significant difference at P＜0.05; **: extremely significant difference at P＜0.01. Same for below.2.4 yibT与csgD缺失株生物膜的电镜状态观察
在扫描电镜下可以观察到呈杆状的鼠伤寒沙门菌，野生株和回补株均显示出成熟生物膜的3D结构，能清晰看到它们像网一样聚集成团（图5红色箭头显示部分），被EPS和纤维包裹形成的多层粗糙菌落结构，细菌相互连接形成生物膜；而yibT和csgD基因缺失株多见单个散在的细菌，细菌密度减小，未见生物膜形成（图5蓝色箭头显示部分）。
2.5 yibT与csgD缺失株对鼠伤寒沙门菌胞外多糖的影响
以苯酚-硫酸法测定的葡萄糖标准曲线拟合度为
0.9950 （图6A）；与WT相比，yibT和csgD基因缺失后胞外多糖的含量显著降低（P＜0.05），表明yibT和csgD基因影响鼠伤寒沙门菌胞外多糖的产生（图6B）。![]()
图 6 鼠伤寒沙门菌突变株胞外多糖含量A：葡萄糖标准曲线；B：胞外多糖含量。Figure 6. Exopolysaccharide contents in S. typhimurium mutantsA: glucose standard curve; B: exopolysaccharide content.2.6 yibT与csgD缺失株对鼠伤寒沙门菌运动能力的影响
鼠伤寒沙门菌各突变株都具有运动能力，细菌从半固体平板中央向外扩散生长，形成云雾状的生长环（图7A）。由于运动能力的强弱不同，其扩散的直径不同，与WT相比，yibT基因缺失株的运动直径相对于野生株略有增大，再缺失csgD基因后扩散进一步增大（图7B）。表明yibT和csgD基因均抑制鼠伤寒沙门菌的运动能力。
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图 7 鼠伤寒沙门菌突变株的运动能力A：鼠伤寒沙门菌突变株在半固体平板的运动性；B：鼠伤寒沙门菌突变株的运动直径。Figure 7. Motility of S. typhimurium mutantsA: motility of S. typhimurium mutants on semi-solid plates; B: diameters of moving area of S. typhimurium mutants.2.7 yibT与csgD缺失株对鼠伤寒沙门菌自聚集能力的影响
与WT相比，yibT和csgD基因缺失株显示出较低的自聚集率，且具有极显著差异（P＜0.01），其自发聚集形成群体的能力下降，表明yibT和csgD基因影响了鼠伤寒沙门菌的自聚集能力（图8）。
2.8 yibT与csgD缺失株对鼠伤寒沙门菌生物膜形成相关基因表达的影响
当yibT基因缺失后，鼠伤寒沙门菌的luxS基因保持不变，表明yibT可能不参与群体感应QS系统中AI-2系统的调控，而csgD基因参与此调控（图9A）。invF基因编码的InvF蛋白参与了QS系统的调控。InvF蛋白可以影响与QS相关的信号分子的合成和感知，从而调节细菌群体的行为。yibT的缺失导致invF的表达量显著下降，表明yibT虽然不参与QS系统中AI-2系统的调控，但是可能通过影响invF表达量的下调参与QS系统的调节（图9B）。SdiA是一种与外源信号分子相互作用的蛋白，它可以感知周围环境中AI-2的浓度变化。一旦AI-2浓度达到一定水平，sdiA会结合到特定的DNA区域上，从而调节下游基因的表达，影响细菌的生理过程和行为。yibT和csgD基因敲除株的sdiA表达水平下降，在双基因敲除株中也保持下降的水平，表明yibT和csgD共同调控鼠伤寒沙门菌sdiA系统，而两基因之间的作用关系尚不清楚（图9C）。
3. 讨论与结论
本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌CVCC541的yibT与csgD基因缺失株及回补株，并测定其在生物膜形成中的作用。结晶紫染色法通常用于生物膜的检测和定量，分别通过试管和24孔板来进行生物膜形成能力测定，WTΔyibTΔcsgD菌株不能在试管壁上形成完整的环形生物膜，而是断续、破碎的生物膜，说明其在气液界面形成生物膜的能力减弱，且通过结晶紫定量发现其生物膜形成量显著减少，说明yibT基因和csgD基因参与了生物膜的形成过程。聚集成团的微菌落是附着细胞活跃增殖的结果，而生物膜表面的粗糙纹理可归因于被包裹的沙门氏菌细胞自我分泌的胞外多糖基质。有研究报道，细菌数量的增加和ESP的分泌导致多层结构，并有助于生物膜厚度的提高[26]。鼠伤寒沙门菌突变株扫描电镜与上述描述相符，yibT基因缺失后多见散在的单个菌落，很少微菌落存在，csgD基因缺失后单菌落增加，推测基因的缺失导致鼠伤寒沙门菌胞外基质的分泌量减少，而野生株和回补株及过表达株形成成熟的生物膜，显示出致密、多层网状结构，可以明显看到细菌周围分泌的胞外基质。由此说明其在生物膜的形成中起着关键作用，是维持生物膜结构和功能的重要组成部分。该结果与Karygianni等[27]的研究结论基本一致。利用碱提法进行EPS含量的提取和检测，发现yibT和csgD基因缺失后，鼠伤寒沙门菌的胞外多糖含量减少，与扫描电镜的结果相一致。EPS的存在可以增强生物膜的结构稳定性和机械强度，同时提供微生物在生物膜内部的营养和保护，还可以促进微生物之间的相互作用、信号传导和营养物质的交换，yibT及csgD基因的缺失破坏了EPS的完整性。yibT和csgD基因缺失株的自聚集能力减弱，致使鼠伤寒沙门菌的附着能力减弱，细菌分散，在半固体平板上呈现较大的晕圈，与HE等[22]对肠炎沙门菌运动性和自聚集能力的描述是一致的。当yibT基因缺失后，鼠伤寒沙门菌的luxS基因保持不变，csgD基因缺失后，该基因的表达水平下降，luxS基因在QS系统中起着维持信号分子平衡的作用，帮助细菌感知并响应周围群体的密度变化，从而调节群体行为，通过luxS基因编码的酶降解AI-2信号分子，细菌能够调节信号分子的浓度，从而影响细菌群体的行为[28]。当AI-2信号分子的浓度达到一定水平时，细菌可以通过QS系统协调行为，如生物膜形成、毒力因子的表达等。本研究表明yibT可能不参与AI-2系统的调控，csgD基因参与此调控。yibT的缺失导致invF的表达量显著下降，invF基因本身不直接参与QS系统，但它可以与QS系统中的其他基因和信号分子相互作用，共同调节沙门氏菌的生理过程。沙门氏菌通过QS系统感知细菌群体的密度和环境信号，调控侵袭性和毒力因子的表达，从而适应不同的生存环境。invF基因可能通过交互作用影响QS系统的调节作用，进而影响沙门氏菌的侵袭性和毒力[29]。细菌的基因网络是复杂相互联系的，invF基因在这个网络中可能与QS系统有一定的功能交叉和调节关系。从侧面表明yibT可能参与QS系统的调节。yibT和csgD基因敲除株的sdiA表达水平下降，在双基因敲除株中也保持下降的水平。sdiA基因编码的蛋白通常被称为SdiA（stress-responsive division inhibitor a），它是一种转录因子，可以调控多种基因的表达，包括与QS系统相关的基因。SdiA蛋白可以感知外部信号，如AI-1和AI-2等信号分子，从而调节细菌的群体行为。通过与其他QS系统中的信号分子和调控蛋白相互作用，SdiA蛋白可以影响细菌的生物膜形成、毒力因子的表达、生长速率等重要生理过程[30]。表明yibT和csgD基因可能共同作用参与QS的调控来影响生物膜的生成，且csgD处于主调控地位。
本研究测定了鼠伤寒沙门菌yibT和csgD基因缺失对生物膜形成过程的影响，结果显示，突变株减弱了的细菌生物膜形成能力，影响了胞外基质的合成并且细菌的自聚集能力减弱，菌体趋于扩散状态，相关基因的mRNA表达水平也下降。本研究结果将为开发针对细菌生物膜的新型抗菌药物和治疗方法提供一定的理论依据。
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图 1 菌株WTΔyibTΔcsgD:Kan和WTΔcsgD:Kan的PCR鉴定
M：D2000 Marker；1：WTΔyibTΔcsgD:Kan PCR产物；2： WTΔcsgD:Kan PCR产物；3：WT PCR产物。
Figure 1. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD:Kan and WTΔcsgD:Kan
M: D2000 marker; 1: PCR product of WTΔyibTΔcsgD:Kan; 2: PCR product of WTΔcsgD:Kan; 3: PCR product of WT.
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图 2 菌株WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD的PCR鉴定
M：D2000 Marker；1：WT 的 PCR 产物；2：WTΔyibTΔcsgD 的 PCR 产物；3：WTΔcsgD 的 PCR 产物。
Figure 2. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD and WTΔcsgD
M: D2000 marker; 1: PCR product of WT; 2: PCR product of WTΔyibTΔcsgD; 3: PCR product of WTΔcsgD.
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图 3 WTΔyibTΔcsgD/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD的PCR鉴定
M：D2000 Marker；1：WTΔyibTΔcsgD/pcsgD的PCR产物；2：WTΔcsgD/pcsgD的PCR产物；3：转入空质粒pET28a的菌 PCR产物。
Figure 3. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD/pcsgD and WTΔcsgD/pcsgD
M: D2000 marker; 1: PCR product of WTΔyibTΔcsgD/pcsgD; 2: PCR product of WTΔcsgD/pcsgD; 3: PCR product of bacteria transferred to empty plasmid pET28a.
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图 4 鼠伤寒沙门菌突变株的生物膜形成
A：试管法测定生物膜能力；B：二十四孔板测定生物膜能力；C：生物膜的结晶紫量化。*表示与WT差异显著（P＜0.05），**表示与WT差异极显著（P＜0.01）。下同。
Figure 4. Biofilm formation of S. typhimurium mutants
A: test tube method for determining biofilm formation; B: 24-well plates for determining biofilm formation; C: crystal violet quantization of biofilm. Results are comparisons with WT; *: significant difference at P＜0.05; **: extremely significant difference at P＜0.01. Same for below.
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图 6 鼠伤寒沙门菌突变株胞外多糖含量
A：葡萄糖标准曲线；B：胞外多糖含量。
Figure 6. Exopolysaccharide contents in S. typhimurium mutants
A: glucose standard curve; B: exopolysaccharide content.
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图 7 鼠伤寒沙门菌突变株的运动能力
A：鼠伤寒沙门菌突变株在半固体平板的运动性；B：鼠伤寒沙门菌突变株的运动直径。
Figure 7. Motility of S. typhimurium mutants
A: motility of S. typhimurium mutants on semi-solid plates; B: diameters of moving area of S. typhimurium mutants.
表 1 PCR扩增引物
Table 1 Primers applied for PCR
引物名称
Primer names引物序列5′-3′
Primer sequences引物长度
Primer length/bp反应长度
Reaction length/bpP1 TTTCATCATGTTTAATGAAGTCCATAGTAGTCATGGTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 59 1600 P2 ATCTTTTTGAAAAGATTATAAAGATGTGTCTTAACCGTACATATGAATATCCTCCTTAG 59 P3 GCTGTCAGATGTGCGATT 18 723 P4 TGCTACAATCCAGGTCAGA 19 P5 CCGCTCGAGCCGCCTGAGATTATCGTTTG 29 649 P6 CGCGGATCCATGTTTAATGAAGTCCATAG 29 P7 CAGCCAGGCGTTCCGTGAAT 20 469 P8 AGCCGCCGGTAATATTCCAGAC 22 
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表 2 荧光定量PCR引物序列
Table 2 Primers applied for qRT-PCR
引物名称
Primer names引物序列5′-3′
Primer sequences引物长度
Primer length/bpluxS-F ACTGATGGGCTGCCTGTATC 20 luxS-R
sdiA-F
sdiA-R
invF-F
invF-R
16S-F
16S-RGCCTCTTCGCTATTACGCCA
ATGAAGCGAAGGCGATGT
CGAGGAGCAGCGTAAACT
ACGATGAGAATGCTGGGAGA
TATGTGAAGGCGATGAGTAAC
TTACCCGCAGAAGAAGCACC
CTCAAGGGCACAACCTCCAA20
18
18
20
20
20
20
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