0.   引言

【研究意义】圆环病毒（Circovirus，CV）是近年来新发现的倍受关注的畜禽病毒之一，该病毒感染宿主谱广，包括家畜、家禽及其他动物^[1,2]。水禽圆环病毒感染较为普遍，不同品种、不同日龄的水禽均有报道，流行十分广泛^[3-6]，临床上多表现为生长迟缓、羽毛紊乱、体况消瘦等^[7-10]；主要侵害水禽的淋巴网状内皮组织，引起淋巴器官特别是法氏囊淋巴细胞减少^[7,8,10]，免疫力下降，导致宿主对其他病原，如大肠杆菌（E. coli）、禽多杀性巴氏杆菌（Avian pasteurella multicida）或禽流感（Avian influenza virus）、鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus）及水禽细小病毒（Parvovirus）等二次感染的易感性增加^[6,9,11]，影响其他疫病病原疫苗的免疫效果^[9,10]。明确水禽圆环病毒病的感染情况对保障水禽健康养殖、制定科学的免疫计划及疫病防控策略具有重要意义。【前人研究进展】水禽圆环病毒为圆环病毒科（Circoviridae）、圆环病毒属（Circovirus）成员，基因组为单链环状DNA^[8,12,13]，主要包括鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）和鹅圆环病毒（Goose circovirus，GoCV），二者基因组成十分相似，包含6个主要的开放阅读框架（ORF），即ORF-V1～V3和ORF-C1～C3，在基因间区有1个典型的茎环结构和4拷贝重复区域^[4,7,8]。2种病毒基因组大小不一致，DuCV基因组全长约2 kb^[8,13]，而GoCV约1.8 kb^[4,7]，彼此间基因组核苷酸同源性为76.9%～79.6%^[4,14,15]。GoCV最早于1999年在发病鹅中被发现^[7]，DuCV于2003年首次在患病鸭中被发现^[8]。各地报道的鸭DuCV阳性率为21.9%～84.2% ^[8,16,17]。匈牙利报道的不同日龄鹅血清GoCV阳性率为40.9% ^[3]。我国自2005年和2006年分别首次报道了鹅圆环病毒和鸭圆环病毒在水禽中出现以后，各地饲养水禽均陆续出现感染报道。GoCV核酸阳性率达35.4%^[4,18]，种鹅群GoCV血清阳性率在60.0%～90.9%^[19]，鸭群DuCV阳性率则在10%～81.6%^[5,6,11,20]。值得关注的是，赵光伟等^[21]在重庆地区患病鹅中检测到DuCV，说明2种水禽圆环病毒还存在交叉感染。病毒核酸检测是实验室进行临床病例病原快速检测的方法，也是开展疫病流行监测的重要手段，目前针对DuCV或GoCV核酸已建立了经典PCR、套式PCR、环介导等温扩增技术、SYBR Green染料和探针实时荧光定量PCR等多种单一病原核酸的快速检测方法^{[16,20,22-25]}，也建立了可鉴别检测2种圆环病毒核酸的双重PCR方法（4条引物）^[18,26]。【本研究切入点】但关于2种圆环病毒交叉感染检测便捷度、准确性还有待进一步提升。【拟解决的关键问题】本研究基于DuCV和GoCV的基因组分子特征建立了一种可同时检测DuCV和GoCV的三引物PCR扩增方法，其特点在于除了在一个反应管中可同时检测2种病毒外，相较于双重PCR方法少了一条引物，较大降低了引物间的相互干扰，提高了检测操作的简便性和时效性，该方法可用于水禽临床样品中水禽圆环病毒的检测。该方法的应用将进一步丰富水禽圆环病毒检测技术，为提升该病的检测能力、减少水禽养殖产业经济损失提供技术支持。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   试验毒株

鹅圆环病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒（Duck plague virus）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus）、鸭3型腺病毒（Duck adenovirus 3）和小鹅瘟病毒（Gosling Plaguevirus）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定并保存。

1.1.2   主要试剂与仪器

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自全式金生物工程有限公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和dNTP购自诺唯赞公司，DNA相对分子质量标准物购自Takara生物科技有限公司。其他常规化学试剂和耗材均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2   试验方法

1.2.1   引物筛选

根据GenBank数据库中发布的DuCV和GoCV基因组4拷贝重复区域所在的基因间隔序列差异设计3条特异性引物，利用引物设计软件Oligo（v7.37）设计了3条引物，其中2种圆环病毒通用上游引物，CVF：5′- AAY CWC GCG GGA AGT GGT GGG A -3′；DuCV特异性下游引物DuCVR：5′-TTC TAR GCA TAA ACG AGA TC-3′；GoCV特异性下游引物GoCVR：5′- ATA MGA TTC GGA CAA TGG ACT G -3′。DuCV和GoCV的扩增条带分别为554 、407 bp的基因片段，引物由铂尚生物技术（福州）有限公司合成，工作浓度均为10 mmol·L⁻¹。

1.2.2   PCR体系及反应条件优化

参照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书提取2种病毒的核酸作为PCR体系的模板。PCR反应体系20 μL，3条引物组成的2对组合分别对DuCV和GoCV进行扩增。反应体系为Phanta Max Buffer（2×）10 μL，dNTP（10 μmol·L⁻¹）1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（5 U·μL⁻¹）1 μL，引物CVF-GoCVR或CVF-DuCVR（均为10 μmol·L⁻¹）各1.0 μL，DNA模板2 μL（约含20 ng），ddH₂O补充至20 μL。

基于上述PCR体系，对PCR反应的退火温度、dNTP浓度和引物浓度等多个重要参数进行优化。首先利用梯度PCR仪多温度设置功能对PCR反应的退火温度在48.0～68.0 ℃进行优化。PCR反应程序为：95 ℃变性5 min；随后进入循环95 ℃变性30 s，48.0～68.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计36个循环；然后72 ℃延伸10 min后保存于10 ℃。不同温度下的PCR产物经电泳检测后选取扩增特异性强、扩增量最高的温度作为反应的退火温度，然后在该温度下依次进行dNTP浓度和引物浓度以及DNA聚合酶量的优化。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶在120 V恒压电泳20 min后在凝胶系统观察结果。

1.2.3   三引物比例优化

本试验反应体系中有3条引物组成两套PCR扩增系统，在扩增2种水禽圆环病毒DNA样品时要对上下游引物比例进行优化，以达到最佳的扩增效果。在基础反应体系基础上，设计了4个引物终浓度比例组合，CVF∶DuCVR∶GoCVR体积比分别为2∶1∶1、2∶1.5∶1、2∶2.5∶0.5、2∶3∶1，PCR产物电泳检测，凝胶成像系统拍照观察。

1.2.4   引物特异性和灵敏度检测

为评估该引物组合的特异性，应用该引物组对鹅和鸭常感染的多种DNA病毒基因组DNA进行扩增，根据对DNA有无扩增判断其特异性，同时设置阴性对照。为评估该引物组合检测的敏感性，用超纯水将DuCV和GoCV基因组DNA（质量浓度分别为110 、80 ng·μL⁻¹）进行10倍梯度稀释，在最优条件下对2种病毒不同稀释度的DNA进行PCR扩增，观察PCR产物电泳结果，判定其最低检测模板量，作为方法的检测灵敏度。

1.2.5   PCR方法对临床样品的检测

利用所建的三引物PCR方法和DuCV和GoCV双引物PCR方法对临床采集的56份DuCV和37份GoCV感染疑似病例样品分别进行检测，比较分析2种方法的检测结果。

2.   结果与分析

2.1   PCR检测方法的建立

以20 μL基础PCR体系在不同温度下进行PCR扩增，确定最终反应体系最佳的退火温度为54.6 ℃。不同引物浓度的PCR产物电泳条带的亮度有一定的差异，对比PCR产物电泳检测结果，最终选取CVF∶DuCVR∶GoCVR引物比例为2∶1.5∶1作为反应的最适组合。其他如dNTP和Taq聚合酶的微量变化不会对PCR结果产生明显影响。因此，确立检测DuCV和GoCV的三引物PCR检测体系（20 μL）为：Buffer缓冲液（10×）2.0 μL，CVF（10 μmol·L⁻¹）0.6 μL，DuCVR（10 μmol·L⁻¹）0.45 μL和GoCVR（10 μmol·L⁻¹）0.3 μL，dNTP（10 μmol·L⁻¹）1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（5 U·μL⁻¹）1 μL，DNA模板2.0 μL（约含20 ng DNA），ddH₂O补充至20.0 μL。在此体系并按照上述PCR程序，可成功检测到样品中DuCV和GoCV的基因组DNA（图1）。

图  1  三引物PCR方法扩增及特异性电泳结果

M：分子量标准DL2 000；1：阴性对照；2：DuCV；3～4：GoCV; 5：鸭瘟病毒；6：番鸭细小病毒；7：鸭3型腺病毒；8：小鹅瘟病毒。

Figure  1.  Amplification and specificity of tpm-PCR assay

M: Molecular marker DL2 000; 1: Negative control; 2: DuCV; 3–4: GoCV; 5: Duck plaque virus; 6: Muscovy parvovirus; 7: Duck adenovirus type 3; 8: Goose parvovirus.

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2.2   PCR检测方法特异性及灵敏性

引物特异性效果验证表明，引物组CVF、DuCVR和GoCVR仅对DuCV基因组和GoCV基因组产生特异性扩增，而对鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鸭3型腺病毒和小鹅瘟病毒等鸭、鹅等常见DNA病毒基因均无扩增产物，说明引物的特异性很高（图1）。引物敏感性测定结果表明，该引物组的DuCV最低检测量为110 pg·μL⁻¹，GoCV最低检测量为80 pg·μL⁻¹（图2）。

图  2  PCR检测敏感性

M：分子量标准DL2 000；1～5分别为稀释1×10⁻¹～1×10⁻⁵稀释。

Figure  2.  Detection sensitivity of PCR method

M: Molecular marker DL2 000; 1–5: Dilutions of 1×10⁻¹ to 1×10⁻⁵.

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2.3   临床样品的检测

利用所建立的三引物PCR方法和2种圆环病毒对应的常规PCR方法对临床疑似病例检测，结果如表1所示。三引物PCR方法从37份疑似GoCV感染病例样品中检测到18份样品GoCV核酸阳性，阳性率为48.6%（18/37），从56份疑似DuCV感染病例样品中检测到22份样品DuCV核酸阳性，检出率为38.6%（22/56）；这与2种圆环病毒的各自的PCR方法检测结果一致（表1），表明本研究建立的三引物PCR方法与2种病毒PCR方法检测符合率100%。

表  1  三引物PCR方法与其他方法检测比较

Table  1.  Test results of different detection methods

样品 Samples	样品数 Sample amount	阳性数 Positive samples
		三引物PCR方法 Triple primers method	GoCV PCR方法 PCR assay for GoCV	DuCV PCR方法 PCR assay for DuCV
鹅 Goose	37	18（48.6%）	18（48.6%）	-
鸭 Duck	56	22（38.6%）	-	22（38.6%）

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3.   讨论

中国是水禽养殖生产大国。2019年，我国商品肉鸭出栏量占全球出栏量的68%，商品鹅出栏量占全球出栏量的84.3%^[27]。随着水禽产业的不断升级，养殖规模、饲养模式及贸易方式的改变，出现了“老病未除、新病不断、病死率居高不下”的不良局面，如近年来出现的鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu virus disease）、新型番鸭细小病毒病（Novel Muscovy duck parvovirus）、鸭胰腺型肝炎（Pancreatitis-type duck hepatitis A virus 1）及鸭3型腺病毒病（Duck adenovirus 3）等，每年因这些疫病造成巨大的经济损失，严重阻碍了我国水禽养殖业的持续健康高质量发展。圆环病毒是目前发现的最小的致病性动物病毒，在猪、鸡、鸭、鹅、鸽及多种经济观赏鸟类中均有检测到^[1]。尽管不同动物源的圆环病毒基因组差异较大，且感染具有明显的宿主特异性，但圆环病毒感染均侵害宿主的免疫系统并造成损伤，导致机体免疫应答能力和抗病力下降^[2]。流行病学调查表明，水禽中鸭圆环病毒和鹅圆环病毒感染较为普遍^{[3,5-8,11-13]}，且还存在交叉感染的现象^[21]。水禽圆环病毒感染不仅引起水禽生长迟缓、体况消瘦，还导致水禽对疫苗的应答能力及抗病能力降低。临床上表现为圆环病毒与其他病原微生物，如条件性致病及水禽重要传染病病原（如大肠杆菌、巴氏杆菌或禽流感、鸭甲肝病毒及水禽细小病毒等）共感染的病例较多，形成多重混合感染，加重病情和经济损失^[9,11]。因此，要充分重视水禽养殖过程中的水禽圆环病毒感染检疫，建立针对水禽圆环病毒核酸、抗原和抗体的检测方法，根据研究院所、海关检验检疫、基层兽医站和企业等不同的应用环境选择合适的检测技术进行推广应用，为国内水禽健康养殖保驾护航。

病毒核酸检测是开展病原快速检测的重要实验室诊断手段之一，目前针对DuCV和GoCV已建立了不同的核酸快速检测方法，如单一病原检测方法^{[16,20,22-25]}，以及CHEN等^[18]和曹慧慧等^[26]针对DuCV和GoCV建立了由4条引物构建的双重PCR方法。本研究通过比对分析DuCV和GoCV基因组异同，建立了一种可同时检测2种水禽圆环病毒的三引物PCR方法，本方法可在单个反应管中同时检测DuCV和GoCV2种病原，并可根据扩增片段的数量和大小明确是何种病毒的单一感染还是2种病原共感染，与单重PCR检测方法相比更省时、便捷、经济；本方法通过共用上游引物的策略，实现了以3条引物检测2种圆环病毒的目的，尽管增加了筛选适配引物的难度，但PCR扩增体系中引物数量的减少，有效降低了PCR扩增过程中不同引物间的相互干扰，提高了PCR检测效力，节约了检测成本。本方法的建立丰富了水禽圆环病毒的检测技术手段。

4.   结论

本研究基于DuCV和GoCV基因组分子特征，建立了一种可同时检测DuCV和GoCV的三引物PCR检测方法，该方法特异性强、敏感性高，DuCV和GoCV最低检测量分别为110 、80 pg·μL⁻¹。对临床疑似感染病例样品检测表明，建立的三引物方法与2种水禽圆环病毒单病毒检测方法的检测效果一致，因此完全适用于水禽圆环病毒的临床病例的诊断及流行病学监测。