Whole Genome Sequence of Paenibacillus polymyxa NPDY05-8
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摘要:目的
多粘类芽孢杆菌NPDY05-8是一株对小麦赤霉病、玉米茎基腐病有防治效果的有益菌。为了解其抗病机制，利用基因组测序技术解析该菌株的基因结构特征，明确其基因功能，分析其次级代谢产物，为该菌株的开发利用提供依据。
方法采用平板对峙法分析菌株的抑菌率，并基于三代Nonopore和二代Illumina测序技术平台进行测序及组装，进行基因功能预测与注释。
结果多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对19种病原真菌均有不同程度的拮抗作用，抑菌率在62.00%～92.00%。基因组测序结果显示基因组总长度为5 132 538 bp，G+C含量为45.63%，预测到5 151个基因，4 949个蛋白质编码序列，含有1个质粒，大小为226 178bp。分别有3 902、3 489和1 391个基因在COG、GO和KEGG数据库中提取到注释信息。同时，还预测得到209个碳水化合物相关酶和11个次级代谢产物合成基因簇。
结论NPDY05-8拥有丰富的碳水化合物相关酶，含纤维素酶基因4个，合成的次级代谢产物的基因簇包含fusaricidi B、surfactin、paenicidin B、bacitracin、aurantininB、C、D等多种抗菌物质，拥有极大的开发潜力。
Abstract:ObjectiveGenome sequence and functions of Paenibacillus polymyxa NPDY05-8 were studied to explore the application potential of the bacterium as a biocontrol agent for wheat fusarium head blight and corn stem rot.
MethodsAntimicrobial spectrum of P. polymyxa NPDY05-8 was analyzed by the plate confrontation method, sequence and assembly obtained based on the Nonopore third-generation and Illumina second-generation sequencing technology platforms, and gene functions predicted and annotated.
ResultsP. polymyxa NPDY05-8 showed antagonistic activities against 19 pathogenic fungi with antimicrobial spectra between 62.00% and 92.00%. The whole genome was 5,132,538bp with a G+C content of 45.63%. There were 5,151 genes and 4,949 protein coding sequences predicted that included a plasmid of 226,178bp. The COG, GO, and KEGG databases annotated 3,902, 3,489, and 1,391 genes, respectively. A total of 209 carbohydrate-related enzymes and 11 secondary metabolite gene clusters were predicted.
ConclusionP. polymyxa NPDY05-8 was rich in carbohydrate-related enzymes and contained 4 cellulase genes and synthetic secondary metabolites including several antimicrobial compounds, such as fusaricidi b, surfacetin, paenicidin b, bacitracin, aurantinb, C and D. It appeared to have significant potential for developing as a biocontrol agent.
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0. 引言
【研究意义】在植物的生长和发育过程中，常常会受到各种程度的生物和非生物胁迫的影响。近年来，极端高温天气的频繁发生使得非生物胁迫成为限制植物生长的一个重要因素。严酷的高温条件不仅会导致植物的生长和发育受到抑制，甚至可能导致植株的死亡，从而对作物的产量和品质产生显著的负面影响。热激转录因子（Heat shock transcription factors, HSF）是植物在应对高温胁迫中发挥关键调控作用的重要因子，通过参与调控编码热激蛋白（Heat shock protein, HSP）的相关基因的表达，从而参与植物抵抗高温的生理生化反应。火龙果属于仙人掌科（Cactaceae）蛇鞭柱属（Selenicereus）植物，起源于南美洲热带地区，天然对高温具有耐受性，但高温环境仍会影响其座果率[1,2]，为此对火龙果 HSF 基因家族展开研究具有重大的经济效益与现实意义。【前人研究进展】当植物受到高温胁迫时，体内会启动一系列生化反应以应对高温伤害。其中一项重要手段是产生热HSP，而HSP的基因直接受HSF调控[3]。在高温环境下，HSF 会特异性地与 HSP 基因启动子区域的热激元件（Heat shock element, HSE）结合，从而激活 HSP 基因进行转录和翻译，进一步影响整个热激反应[4,5]。植物体内有多种转录因子，广泛参与植物的生理生化反应调节机制，通过与基因特定位点结合，从而影响基因表达[6,7]。HSF 是植物应对高温胁迫的重要转录因子，根据其蛋白质结构可大致被分为 A、B、C 三种类型。其中A 类 HSF 是参与热胁迫响应的重要调控因子，因为只有 A 类 HSF 具有转录激活功能的 AHA 基序[8−10]。HSF 在真核生物中具有结构和功能上的保守性，包含N端的 DNA 结合域（DNA binding domain, DBD ）、寡聚化结构域（oligomerization domain, OD）、核定位信号（nuclear localization signal, NLS ）以及C端核输出信号（ nuclear export signal, NES ）和 C端转录激活结构域（ C-terminal transcriptional activation domain, CTAD ）共5个结构域。其中，DBD 是HSF 中结构和功能最保守的结构域[5,11−13]。【本研究切入点】目前， HSF 基因家族已在多个物种中被鉴定，但有关火龙果 HSF 基因家族的研究报道却很少。【拟解决的关键问题】本研究利用生物信息学方法对火龙果 HSF 进行基因家族鉴定，分析其基因结构以及组织特异性表达，同时通过高温胁迫分析验证 HSF 基因家族在应对高温胁迫中的重要作用。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
本研究使用的试验材料为‘大红’火龙果。选取 27 根长势良好且生长状态相似的火龙果枝条，以每 9 根枝条一组随机分为 3 组。每组中将 3 根枝条视为一个重复，共设 3 个重复。所有枝条先在室温下（25 ℃）适应 72 h，随后空白对照组继续在 25 ℃ 恒温条件下培养 48 h，试验组则分别置于 40 ℃ 恒温条件下培养 24 h和 48 h，其他培养条件保持一致，即光照 12 h/黑暗 12 h，光照强度为
5000 lx，相对湿度为 70% 。将处理的完成的样本迅速用液氮冷冻，然后储存于−80 ℃的超低温冰箱中备用。1.2 基因准备与鉴定
从 pitayagenomic （http://www.pitayagenomic.com/）获取火龙果全基因组文件、CDS 文件以及 GFF3 文件，并从 tair (https://www.arabidopsis.or)网站获取拟南芥 HSF基因家族序列。以拟南芥 HSF 基因家族 21 条序列（AT4G17750、AT5G16820、AT1G32330、AT3G02990、AT2G26150、AT5G03720、AT4G18880、AT5G45710、AT4G13980、AT5G43840、AT3G22830、AT3G51910、AT3G63350、AT1G67970、AT5G54070、AT4G36990、AT5G62020、AT4G11660、AT2G41690、AT1G46264、AT3G24520）为参考，利用 Blast 比对（blastn, e-value ＞ 1e-5）获得火龙果 HSF 基因家族序列，并使用NCBI数据库对结果进一步确认。通过 ExPASy 网站（https://web.expasy.org/compute_pi/）对火龙果 HSF 基因家族所编码的蛋白质进行理化性质分析。
1.3 Motif分析、基因结构分析和基因位置分析
运用 TBtools 软件中的 Simple MEME Wrapper 功能、BioSequence Structure Illstrator 功能和 Show Genes on Chromosome 功能分别进行 Motif 分析、基因结构分析和基因位置分析，并借助软件自带的数据可视化功能绘制相应的 Motif 图、基因结构图和基因位置图[14]。
1.4 启动子顺式作用元件分析
利用 TBtools 对火龙果基因组文件进行处理，获取 HSF 家族基因上游 2000bp 提交到 PlantCARE 数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）以预测顺式作用元件[15]。将检测结果与序列长度文件添加到 TBtools 中，对数据进行可视化处理，即可得到启动子序列分析图谱。
1.5 基因结构域的预测
通过 NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）的 CD Search 功能对火龙果 HSF 蛋白文件进行基因结构域的预测，预测结果使用TBtools进行可视化。
1.6 基因进化树的构建
将火龙果、拟南芥、甜菜、小麦、番茄和玉米的 HSF 基因家族序列进行多序列比对，利用 MEGA 软件构建进化树，并利用 iTOL 网站(https://itol.embl.de)进化树进行美化。
1.7 基因表达分析
借助 pitayagenomic （http://www.pitayagenomic.com/）官网中获取火龙果不同组织（果肉、刺座、花和果皮）和部分组织不同发育阶段的转录组数据，提取其中 HSF 基因表达数据（以TPM计），使用热图展示HSF 基因在火龙果不同组织中的表达量。
1.8 qPCR分析
利用 Omega 植物RNA 提取试剂盒（R6827-01）提取 RNA，并使用NanoDrop™One（Thermo Fisher）检测纯度和浓度，最后使用 Takara 反转录试剂盒（PrimeScriptTRT reagent Kit）逆转录获得 cDNA 。
使用 Primer Premier 5.0 软件设计相应引物，使用诺唯赞 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Q712-02）按照说明书对相应基因表达进行相对定量分析，每个样品重复 3 次，根据 2−∆∆CT 法计算相对表达量。
2. 结果与分析
2.1 火龙果HSF基因家族鉴定
通过Blast 比对从结果中筛选出 13 个火龙果 HSF 基因家族序列，分别命名为 SpHSF1~SpHSF13（表1）。这13 个基因家族成员的编码区序列（CDS）长度为 798~
1518 bp，HSF 基因家族编码的氨基酸数目为 265~505 aa，蛋白质相对分子量为 30.59~55.32 kDa ，等电点（PI）为 4.66～9.18 ，不稳定系数为42.91～72.24 。根据不稳定系数分析，由于其数值均大于40，说明 13 个 HSF 基因编码的蛋白均为不稳定蛋白。表 1 火龙果 HSF 基因家族信息Table 1. Information on HSFs in pitaya基因ID
Gene ID编码区长度
CDS length/bp编码蛋白质特性
Characteristic of the coding protein氨基酸数目
Amino acid number/aa分子量
Molecular weight/kDa等电点
isoelectric point不稳定系数
Instability coefficientHU02G02398.1 1368 455 50.22 5.28 65.89 HU04G00163.1 969 322 34.39 4.89 61.69 HU04G01591.1 1479 492 54.93 5.57 59.68 HU04G01952.1 1146 381 43.68 5.37 52.94 HU05G00210.1 1518 505 55.32 4.82 55.18 HU05G01887.1 846 281 31.31 5.53 42.91 HU08G01904.1 1230 409 46.78 5.18 52.64 HU10G00758.1 1131 376 42.85 4.66 51.09 HU10G01009.1 798 265 30.59 7.73 60.05 HU10G01257.1 1005 334 37.31 5.45 48.87 HU10G01285.1 1461 486 53.76 5.27 72.24 HU10G01592.1 882 293 33.26 9.18 48.85 HU11G00478.1 1017 338 38.32 6.09 57.00 2.2 Motif分析
通过Motif 分析，鉴定出 8 个保守基序 Motif（图1-A）。13 个 HSF 基因家族成员都含有 Motif 1、Motif 2、Motif 3 和 Motif 4 等4个保守基序。其中，HU04G01591.1、HU04G01952.1、HU05G00210.1、HU08G01904.1 和 HU10G01285.1 等5个基因拥有 8 个 Motif 基序，具有最多的保守区域。
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图 1 HSF 基因家族蛋白基序预测分析（A）及 HSF 结构基因（B）Figure 1. Protein motif prediction on HSF family (A) and HSF structure gene (B)2.3 HSF基因家族成员基因结构分析
在基因结构分析中（图1-B），发现火龙果 13 个 HSF 基因家族成员中， 10个基因仅含有一个内含子， HU04G01591.1 和 HU10G01257.1 有两个内含子，HU08G01904.1 具有三个内含子。
2.4 HSF基因家族成员染色体定位
HSF 的 13 个基因家族成员分布在火龙果 11 条染色体中的 6 条上（图2）。其中 chr10 染色体含有 5 个 HSF 基因家族成员，chr04 含有 3 个，chr05 含有 2 个，chr02、chr08 和 chr11 分别含有 1 个基因家族成员。从分布位置特征来看， HU05G00210.1、HU05G01887.1、HU04G00163.1、HU04G01952.1 和 HU08G01904.1 这几个基因分布在基因密度较大的染色体区域。
2.5 启动子顺式作用元件分析
火龙果 HSF 基因家族共检测到 16 种启动子顺式作用元件（图3），可分为四类：（1）激素响应元件，如生长素响应元件，赤霉素响应顺式作用元件，脱落酸响应顺式作用元件，水杨酸响应顺式作用元件等；（2）逆境胁迫相关元件，如防御和应激响应顺式作用元件，低温响应顺式元件，厌氧诱导基础顺式调节元件，茉莉酸甲酯响应调节元件，玉米醇溶蛋白代谢顺式调控元件，缺氧特异性诱导类增强子元件，干旱诱导的 MYB 结合位点，类黄酮生物合成基因调控 MYB 结合位点等；（3）植物生长发育调控相关元件，如昼夜节律控制顺式调控元件，与分生组织表达相关的顺式调控元件，栅栏组织细胞分化作用元件等；（4）光响应相关元件，如参与光响应的顺式调节元件和参与光响应性 MYB 结合位点。
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图 3 HSF 基因启动子区域顺式作用元件的预测Figure 3. Predicted cis-acting elements in promoter region of HSF2.6 基因结构域的预测
对火龙果 HSF 基因家族成员所编码的 HSF 进行蛋白质结构预测，结果显示（图4），13 个 HSF 基因家族成员中的 10 个含有 HSF domains 结构域，另外三个成员中HU08G01904.1 和 HU10G00758.1含有 HSF 1 superfamily 结构域，HU10G01257.1含有 HSF_DNA-bind 结构域。此外，HU05G00210.1、HU04G01591.1、HU04G01952.1 和 HU11G00478.1 四个基因除了含有 HSF domains 结构域外，还分别含有 SMC_prok_B_superfamily、bZIP superfamily、GumC superfamily 和 PRK03918 superfamily 结构域。
2.7 基因进化树的构建
使用火龙果、拟南芥、甜菜、番茄和小麦等5个物种的 HSF 基因序列共同构建的系统进化树显示（图5），五个物种的 HSF 基因家族被分为 4 个类群，其中火龙果HU10G01592.1 和 HU10G00758.1 这两个基因分别与小麦的 TraesCS2A02G146600.1 和番茄的 Solyc09g059520.3.1 基因的亲缘关系较近，其余的基因都与甜菜的基因亲缘关系相近。
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图 5 5个物种 HSF 基因家族序列系统进化树AT 为拟南芥基因序列、HU 为火龙果基因序列、XP 为甜菜基因序列、TraesCS 为小麦基因序列、Solyc 为番茄基因序列Figure 5. Phylogenetic tree of HSF sequences in 5 speciesAT: Arabidopsis gene sequence; HU: pitaya gene sequence; XP: beet gene sequence;TraesCS: wheat gene sequence; Solyc: tomato gene sequence.将火龙果的 13 个 HSF 基因构建系统进化树（图6），结果表明，13 个 HSF 基因可以被分为四类。HU08G01904.1 和 HU10G01285.1 亲缘关系较近，HU11G00478.1 和 HU04G01952.1 亲缘关系较近，HU04G01591.1 和 HU05G00210.1 亲缘关系较近，HU10G01257.1 和 HU04G00163.1 亲缘关系较近。
2.8 基因表达分析
结果（图7）显示，在火龙果果肉中 HU02G02398.1的表达量最高，其他基因的表达量相对较低；在刺座中 HU04G00163.1 表达量最高，其次是 HU05G01887.1；在花、花粉和子房等生殖器官中 HU05G01887.1 都有很高的表达量，而且 HU05G01887.1 在果皮、根系和鳞片中表达量也是最高的；HU04G01591.1 和 HU08G01904.1 两个基因在花丝中的表达量较高，而且两个基因的表达量十分相近；而 HU10G01592.1 和 HU04G01952.1 两个基因在上述组织中几乎不表达。
2.9 qPCR分析
根据火龙果 HSF 基因的组织表达特性及在枝条的表达情况（qPCR显示，大部分HSF基因在枝条几乎不表达），选择表达量相对较高的5个基因 HU05G00210.1、HU04G00163.1、HU05G01887.1、HU02G02398.1 和 HU10G01257.1进行 qPCR 分析，使用 Actin 作为本次实验的内参基因，相关引物见表2 所示。
表 2 引物序列Table 2. Primer sequences基因
GeneF端引物
F primerR端引物
R primerActin AAAGGCTAACAGG
GAGAAAAGACCACTGGCGTAA
AGAGAAHU05G00210.1 TCGCCAGCTCAAC
ACCTATCTTCCTCCAGCC
CAAATHU04G00163.1 TGTTTGGCGACC
TGCTGGCGTCGTTGGTG
TATTCGHU05G01887.1 CCGAGCACTGATG
ATGTGATTTGTCCGGCACT
GTTTTHU02G02398.1 TCTCCAGTTTCG
TCCGTCCTTCTCCCTCCTCA
ACTTCTHU10G01257.1 TTTGCTCCCGCG
TTATTTTGTCTTCCGTCGC
TGTATTT结果（图8）表明，其中有3个基因的表达量显示上升趋势，一个基因的表达量则呈下降趋势，而另外一个基因的表达量表现为先下降后升高的变化趋势。HU05G00210.1 在经过 24 h 热处理后表达量对比空白对照组上升 4 倍，热处理 48 h 基因的表达量几乎不变；HU05G01887.1 经过 24 h 热处理和 48 h 热处理后表达量对比空白组上升 3 倍多；HU10G01257.1 在经过 24 h 热处理后表达量几乎与空白组相当，但经过 48 h 热处理后，其表达量相较于空白组提高了接近 4 倍；HU02G02398.1 的表达量在 24 h 热处理后先轻微降低，在 48 h 热处理后表达量又出现上升趋势；而 HU04G00163.1 在 24 h 热处理和 48 h 热处理实验中都呈现下降趋势。
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图 8 部分 HSF 基因家族在高温胁迫下的表达情况Figure 8. Expressions of some HSFs under high temperature stress3. 讨论
本研究基于火龙果基因组数据共鉴定出 13 个 HSF 基因家族成员。对这 13 个基因编码的蛋白质进行理化性质分析，发现这些 HSF 蛋白均为不稳定蛋白。火龙果 HSF 基因家族编码的大部分蛋白质等电点（PI）小于7，为酸性蛋白，仅 有HU10G01009.1 和 HU10G01592.1 编码的蛋白质PI大于7，为碱性蛋白。由此可见，火龙果 HSF 基因家族编码的蛋白质性质不完全相同，氨基酸数量也存在明显差异，每个基因家族成员可能具有不同的功能并参与不同的调控机制，但这 13 种蛋白也有共同点，即都是不稳定蛋白。在 郭存等[16]的研究中，发现烟草的 HSF 在理化性质上同样存在着较大的差异，烟草 HSF 的氨基酸数量、相对分子量和等电点都在一个范围较大的区间内，与火龙果 HSF 的理化性质相似。通过基因结构域分析和 Motif 基序分析，发现13 个 HSF 基因都含有 HSF 相关结构域且具有较高的保守性。在胡亚威等[17]的研究中，鉴定出柑橘的HSF 含有 20 个 Motif 保守基序，在 刘丹等[18]的研究中，同样也鉴定出桑树的 HSF 含有 20 个 Motif 保守基序，保守的 Motif 在不同物种中可能具有相似功能。通过对比不同物种间的 Motif，研究人员可以了解基因家族的进化关系和功能演变，这对于理解生物多样性和进化历程具有重要意义。火龙果大部分 HSF 基因家族含有 HSF domain、HSF_DNA-bind或 HSF 1 superfamily等HSF 基因家族基本结构域，部分基因家族成员还拥有SMC_prok_B_superfamily、bZIP superfamily、GumC superfamily和 PRK03918 superfamily 等结构域。这些结构域功能多样，比如SMC_prok_B_superfamily属于结构维持染色体（Structural Maintenance of Chromosomes, SMC）蛋白家族，可以确保高温胁迫中遗传物质的稳定性[19]；bZIP superfamily广泛参与应激反应，比如高温胁迫，相关基因表达调控[20]；GumC superfamily和生物膜的形成和稳定性有关，维持生物膜稳定性也是应对高温胁迫中的关键[21]，PRK03918 superfamily的具体功能不太清楚，这仍需后续深入研究加以解析。从上述分析可知，发现火龙果 HSF 基因家族编码的蛋白既有一定的相似程度，又各具特点，具有从多个角度应对高温胁迫的基因结构。
根据火龙果 HSF 启动子顺式作用元件分析结果（图3），发现大部分为激素响应元件和逆境胁迫元件。比如 ABRE 和 P1BS，ABRE 在逆境条件下对Cat1 基因的表达具有重要调控作用，而P1BS顺式作用元件则在低磷胁迫条件下调控氨基酸转运蛋白基因的表达。这些调控元件通过与目标基因的相对空间作用，影响目标基因的表达，进而影响相应蛋白的合成，从而实现对植物生理过程的调节[22,23]。在火龙果 HSF 基因家族启动子元件中，还发现了茉莉酸甲酯响应调节元件，茉莉酸甲酯是一种重要的植物生长调节剂，能够激发植物的防御反应，并对多种生物和非生物胁迫做出响应[24−26]。茉莉酸甲酯响应调节元件涉及多个层面的分子调控机制，响应 MeJA 信号并调控植物的生长发育和防御反应[27,28]。在 Gul 的研究中，已证明茉莉酸甲酯在应对环境温度胁迫方面有明显影响[29]。这可能也是HSF涉及防御反应以及应对环境温度胁迫的作用方式之一。
根据亲缘关系，火龙果的 HSF 基因家族被分为 4 个类群。在其他植物的 HSF 的基因进化分析中，花生[30]、百香果[31]和菠萝[32]的 HSF 基因家族被分为 3 个类群；水稻[33]的 HSF 基因家族被分为 4 个类群；火龙果的 HSF 基因家族的分类与它们的分类相类似。从系统进化树结果分析可知，火龙果 HSF 基因家族与拟南芥、番茄和小麦的 HSF 基因家族亲缘关系较远，而与甜菜的亲缘关系较近，所以火龙果 HSF 基因家族的功能可能与甜菜 HSF 基因家族的功能相似或相同。此外，本研究还构建了火龙果 HSF 基因家族内部成员的基因进化树，发现 13 个基因家族成员内部也存在较为明显的亲缘关系差异，Motif 分析的结果也从侧面印证了同一分支的基因具有相似或相同的保守基序。
根据基因表达分析结果发现，不同基因在火龙果不同组织的表达量存在明显的差异，例如 HU05G01887.1、HU04G01591.1、HU08G01904.1 等基因在火龙果营养器官表达量较高，HU10G01257.1、HU10G01592.1、HU04G01952.1、HU10G01009.1、HU11G00478.1 等基因在火龙果的大部分组织的表达量都相对较低，这说明火龙果 HSF 基因家族具有较强的组织特异性。小麦、番茄、芝麻、蒲公英和猕猴桃等植物都已证明 HSF 基因在植物的在不同组织表达量存在较大的差异，与火龙果 HSF 基因在不同组织的表达情况相类似[34−38]。
从 qPCR 结果分析结果分析（图8），枝条组织HSF 基因家族成员在经过高温（40 ℃）处理后，表达量以升高为主。其中 HU10G01257.1 基因在 24 h 热处理中的表达量没有明显变化，48 h 热处理后该基因表达量显著上升，可能是因为HU10G01257.1对高温的响应较慢，或者是参与一些高温损伤修复过程。HU05G01887.1、HU05G00210.1表达量则随着处理时长增加而增加，可能是枝条应对高温胁迫的关键HSF基因。同时出现了两个特殊的基因 HU02G02398.1 和 HU04G00163.1，其中 HU04G00163.1 在 24 h 热处理和 48 h 热处理试验中都呈现轻微下降趋势，而 HU02G02398.1 表达量虽然随着处理和处理时间增加，但是也增加的不显著，这2个基因在对枝条24 h及48 h高温处理似乎没有明显的响应。在 Liu [39]的研究中，发现 HSFA2 突变体的拟南芥比野生型的拟南芥能更加敏感地感受温度的变化，增强植株的耐热性，说明拟南芥 HSFA2 具有应对高温胁迫重要作用。在小麦[40]、大豆[41]、柑橘[17]、水稻[42]、玉米[43]和烟草[16]等植物中，都有研究证明 HSF 基因能够响应高温胁迫，防止植物在高温环境中受到损伤。试验结果表明火龙果的HSF基因也对火龙果应对高温胁迫起着重要作用，尤其是HU05G01887.1、HU05G00210.1和HU02G02398.1可能是火龙果只填组织应对高温胁迫的关键基因。
4. 结论
本研究从 Motif 分析、基因结构分析、基因结构域预测、染色体定位、启动子分析和系统进化树分析等多方面，对火龙果 HSF 基因家族进行了较为系统性的分析，鉴定出 13 个火龙果 HSF 基因家族成员。根据亲缘关系，这 13 个 HSF 基因家族成员可以被分为四类，并且 HSF 基因所编码的热激转录因子全部都是不稳定蛋白。本研究通过高温胁迫实验发现，HU05G01887.1和HU05G00210.1两个基因可能是火龙果枝条响应高温胁迫的关键基因，而HU02G02398.1可能更主要作用于高温损伤后的修复。本研究从生物信息学分析和热胁迫响应分析入手，获得了火龙果HSF 基因家族的基本信息和特性，验证了 HSF 基因在枝条热胁迫中的反应，为全面探究 HSF 基因家族提供了一定的理论依据。
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图 1 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对的多种病原真菌的抑菌图
图中编号对应表1中编号。
Figure 1. Antimicrobial property of P. polymyxa NPDY05-8 against fungal pathogens
Numbers correspond to those in Table 1.
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图 2 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8基因组圈图
从内到外，第1圈代表CDS、rRNA、tRNA在基因组上的位置；第2圈代表Depth of nanopore；第3圈代表测序深度Depth of ilumina；第4圈代表G+C skew；第5圈代表G+C含量；第6圈代表基因组序列信息。
Figure 2. Genomic map of P. polymyxa NPDY05-8
From inside out, 1st circle represents position of CDS, rRNA, and tRNA on genome; 2nd circle, depth of nanopore; 3rd circle, depth of sequencing of Illumina; 4th circle, G+C skew; 5th circle, G+C content; 6th circle, genomic sequence information.
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图 5 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的GO功能分类图
Figure 5. GO functional classification of P. polymyxa NPDY05-8
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图 4 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的COG功能分类图
Figure 4. COG functional classification of P. polymyxa NPDY05-8
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图 6 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的KEGG通路分布图
Figure 6. KEGG pathway distribution of P. polymyxa NPDY05-8
表 1 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8抑菌率
Table 1 Antimicrobial spectrum of P. polymyxa NPDY05-8
编号
NO病原菌
Pathogens抑菌率
Antimicrobial
spectrum/%1 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea 88.57±2.86a 2 水稻纹枯病立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 86.06±4.57ab 3 玉米叶斑病平脐蠕孢菌 Bipolaris 73.33±1.05cd 4 番茄枯萎病尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 65.21±2.17fg 5 香蕉褐缘灰斑病菌 Mycosphaerella musicola 75.15±4.18cd 6 茄子黄萎病轮枝菌 Verticillium dahliae 64.66±6.44fg 7 莲雾软腐病拟盘多毛孢菌 Pestalotiopsis microspora 79.36±7.27bc 8 芦笋颈枯病菌 Phomopsis asparagi 92.00±2.00a 9 丝瓜枯萎尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 62.79±2.32fg 10 大豆根腐尖孢镰刀菌 Fusarium．oxysporum 63.64±3.03fg 11 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 66.66±6.11efg 12 白菜菌核核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 90.00±3.22ae 13 大豆炭疽病菌 Colletotrichum chlorophyti 73.33±2.23cde 14 草莓拟盘多毛孢根腐病菌 Neopestalotiopsis 65.71±2.86efg 15 柑橘炭疽菌 Colletotriehum gloeosporioides 74.69±2.83cd 16 吊瓜交链格孢叶斑病 Alternaria pathogens 60.00±2.22g 17 小麦赤霉病亚洲镰刀菌 Fusarium asiaticum 65.18±2.57fg 18 玉米茎基腐病禾谷镰刀菌 Fusarium graminearum 69.63±2.56def 19 玉米茎基腐病腐皮镰刀菌 Fusarium solani 65.55±1.58fg 同列数据后不同的小写字母表示 0.05 水平上差异显著。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant difference at 0.05 level.
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表 2 编码基因注释结果统计
Table 2 Statistics on annotation of coding genes
项目 Item 数量 Count 占比 Percentage/% All 4 949 100.00 Annotation 4 896 98.93 KEGG 1 391 28.11 Pathway 1 377 27.82 Nr 4 894 98.89 Uniprot 4 853 98.06 GO 3 489 70.50 COG 3 902 78.84 Pfam 3 893 78.66 Refseq 4 851 98.02 Tigerfam 2 530 51.12
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表 3 多粘类芽孢杆菌命名为NPDY05-8次级代谢产物基因簇
Table 3 Gene clusters of secondary metabolites of P. polymyxa NPDY05-8
基因簇 Cluster 类型 Type 长度 Length 相似度 Similarity/% 产物 Product 1 NRPS 62 374 100 杀镰刀菌素B fusaricidi B 2 cyclic-lactone-autoinducer 19 055 8 表面活性剂 surfactin 3 proteusin 20 236 未知 Unknown 4 lassopeptide 24 060 40 多粘菌素 paeninodin 5 lanthipeptide-class-i 23 778 100 多粘菌素 paenilan 6 lanthipeptide-class-i 26 449 71 多粘菌素 paenicidin B 7 NRPS-like, cyclic-lactone-autoinducer 60 154 未知Unknown 8 NRPS, PKS-like 84 649 80 tridecaptin 9 NRPS, betalactone 52 075 33 杆菌肽，枯草杆菌抗生素 bacitracin 10 NRPS, cyclic-lactone-autoinducer 65 035 未知Unknown 11 transAT-PKS, NRPS, T3PKS, PKS-like 101 859 35 aurantinin B/aurantinin C/aurantinin D
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