Conditions to Rapidly Increase Dastarcus helophoroides Population in Pine Forest
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摘要:目的
林间释放花绒寄甲控制松褐天牛防治松材线虫病具有持效、长效控制作用，为探寻找影响林间花绒寄甲种群数量积累、快速提升的关键因素，于2020～2023 年在江西部分疫区开展“疫木不砍伐或不清除仅释放花绒寄甲”试验。
方法通过花绒寄甲亲本来源、体型大小、室内繁育世代数（活性）、释放比率、释放次数等对比试验，调查分析这些因子对林间花绒寄甲种群密度提升的影响。
结果疫木不清理有利于林间花绒寄甲种群数量的迅速积累，而采用现砍现烧的疫木处理方式，则不利于花绒寄甲种群数量积累；在疫木不清理的条件下，释放当地花绒寄甲种源、释放室内繁育世代数低（即活性强的F3代）的亲本、释放体型更大的个体于林间，释放比率1∶1（松褐天牛侵入孔数∶花绒寄甲成虫数）、释放3次（即连续3年，每年3月释放1次），这些措施的综合应用，即能显著、快速提升林间花绒寄甲种群密度，4年间可提升426.16%～706.23%，是释放前的5.26～8.06倍。这些因素综合分析表明，疫木处理方式是影响林间花绒寄甲快速提升的最重要因素。
结论释放的花绒寄甲本身特性[包括其亲本来源、体型大小、室内繁育世代数（活性）]、人工释放技术（包括释放时间、释放比率、释放次数）及疫木处理方式等，是影响林间花绒寄甲种群数量积累、快速提升的关键因素，可为林业生产上应用花绒寄甲防治松褐天牛控制松材线虫病提供科学依据。
Abstract:ObjectiveFactors conducive to rapid rise and maintain the Dastarcus helophoroides population for a sustainable, long-term control of pine wood nematode disease in a forest were analyzed.
MethodExperiments were conducted in nematode-infected areas in Jiangxi Province by releasing D. helophoroides without cutting down or clearing diseased trees were conducted from 2020 to 2023. Impacts of the body size and indoor breeding generations (activity) of D. helophoroides as well as the rate and frequency of the release on the insect density and disease control at the sites were monitored.
ResultBoth the increase rate and accumulation of D. helophoroides populations were significantly encouraged by not clearing the infected woods or cutting and burning the diseased trees at the sites. Thus, under the conditions, various D. helophoroides release measures were implemented. It was found that the release of the local species from parents with low indoor breeding generations (i.e., the highly active F3 generation) and large body at a rate of 1∶1 (i.e., number of nematode invasion holes on trees by Monochamus alternatus : number of D. helophoroides adults) once in March for 3 consecutive years significantly rose the insect density by 426.16-706.23% in 4 years. The increase was 5.26 to 8.06 times higher than without the release.
ConclusionThe experimented method significantly increased D. helophoroides population at the sites. The application conditions included, in addition to not clearing, cutting, or burning the diseased trees at the sites, releasing the local D. helophoroides of specific parental source, body size, and indoor breeding generations (activity) at the specified time, rate, and frequency. The implementation significantly accelerated the increase of the insect population and effectively helped control the pine wilt disease spread by M. alternatus infestation in the forest.
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0. 引言
【研究意义】在植物的生长和发育过程中，常常会受到各种程度的生物和非生物胁迫的影响。近年来，极端高温天气的频繁发生使得非生物胁迫成为限制植物生长的一个重要因素。严酷的高温条件不仅会导致植物的生长和发育受到抑制，甚至可能导致植株的死亡，从而对作物的产量和品质产生显著的负面影响。热激转录因子（Heat shock transcription factors, HSF）是植物在应对高温胁迫中发挥关键调控作用的重要因子，通过参与调控编码热激蛋白（Heat shock protein, HSP）的相关基因的表达，从而参与植物抵抗高温的生理生化反应。火龙果属于仙人掌科（Cactaceae）蛇鞭柱属（Selenicereus）植物，起源于南美洲热带地区，天然对高温具有耐受性，但高温环境仍会影响其座果率[1,2]，为此对火龙果 HSF 基因家族展开研究具有重大的经济效益与现实意义。【前人研究进展】当植物受到高温胁迫时，体内会启动一系列生化反应以应对高温伤害。其中一项重要手段是产生热HSP，而HSP的基因直接受HSF调控[3]。在高温环境下，HSF 会特异性地与 HSP 基因启动子区域的热激元件（Heat shock element, HSE）结合，从而激活 HSP 基因进行转录和翻译，进一步影响整个热激反应[4,5]。植物体内有多种转录因子，广泛参与植物的生理生化反应调节机制，通过与基因特定位点结合，从而影响基因表达[6,7]。HSF 是植物应对高温胁迫的重要转录因子，根据其蛋白质结构可大致被分为 A、B、C 三种类型。其中A 类 HSF 是参与热胁迫响应的重要调控因子，因为只有 A 类 HSF 具有转录激活功能的 AHA 基序[8−10]。HSF 在真核生物中具有结构和功能上的保守性，包含N端的 DNA 结合域（DNA binding domain, DBD ）、寡聚化结构域（oligomerization domain, OD）、核定位信号（nuclear localization signal, NLS ）以及C端核输出信号（ nuclear export signal, NES ）和 C端转录激活结构域（ C-terminal transcriptional activation domain, CTAD ）共5个结构域。其中，DBD 是HSF 中结构和功能最保守的结构域[5,11−13]。【本研究切入点】目前， HSF 基因家族已在多个物种中被鉴定，但有关火龙果 HSF 基因家族的研究报道却很少。【拟解决的关键问题】本研究利用生物信息学方法对火龙果 HSF 进行基因家族鉴定，分析其基因结构以及组织特异性表达，同时通过高温胁迫分析验证 HSF 基因家族在应对高温胁迫中的重要作用。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
本研究使用的试验材料为‘大红’火龙果。选取 27 根长势良好且生长状态相似的火龙果枝条，以每 9 根枝条一组随机分为 3 组。每组中将 3 根枝条视为一个重复，共设 3 个重复。所有枝条先在室温下（25 ℃）适应 72 h，随后空白对照组继续在 25 ℃ 恒温条件下培养 48 h，试验组则分别置于 40 ℃ 恒温条件下培养 24 h和 48 h，其他培养条件保持一致，即光照 12 h/黑暗 12 h，光照强度为
5000 lx，相对湿度为 70% 。将处理的完成的样本迅速用液氮冷冻，然后储存于−80 ℃的超低温冰箱中备用。1.2 基因准备与鉴定
从 pitayagenomic （http://www.pitayagenomic.com/）获取火龙果全基因组文件、CDS 文件以及 GFF3 文件，并从 tair (https://www.arabidopsis.or)网站获取拟南芥 HSF基因家族序列。以拟南芥 HSF 基因家族 21 条序列（AT4G17750、AT5G16820、AT1G32330、AT3G02990、AT2G26150、AT5G03720、AT4G18880、AT5G45710、AT4G13980、AT5G43840、AT3G22830、AT3G51910、AT3G63350、AT1G67970、AT5G54070、AT4G36990、AT5G62020、AT4G11660、AT2G41690、AT1G46264、AT3G24520）为参考，利用 Blast 比对（blastn, e-value ＞ 1e-5）获得火龙果 HSF 基因家族序列，并使用NCBI数据库对结果进一步确认。通过 ExPASy 网站（https://web.expasy.org/compute_pi/）对火龙果 HSF 基因家族所编码的蛋白质进行理化性质分析。
1.3 Motif分析、基因结构分析和基因位置分析
运用 TBtools 软件中的 Simple MEME Wrapper 功能、BioSequence Structure Illstrator 功能和 Show Genes on Chromosome 功能分别进行 Motif 分析、基因结构分析和基因位置分析，并借助软件自带的数据可视化功能绘制相应的 Motif 图、基因结构图和基因位置图[14]。
1.4 启动子顺式作用元件分析
利用 TBtools 对火龙果基因组文件进行处理，获取 HSF 家族基因上游 2000bp 提交到 PlantCARE 数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）以预测顺式作用元件[15]。将检测结果与序列长度文件添加到 TBtools 中，对数据进行可视化处理，即可得到启动子序列分析图谱。
1.5 基因结构域的预测
通过 NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）的 CD Search 功能对火龙果 HSF 蛋白文件进行基因结构域的预测，预测结果使用TBtools进行可视化。
1.6 基因进化树的构建
将火龙果、拟南芥、甜菜、小麦、番茄和玉米的 HSF 基因家族序列进行多序列比对，利用 MEGA 软件构建进化树，并利用 iTOL 网站(https://itol.embl.de)进化树进行美化。
1.7 基因表达分析
借助 pitayagenomic （http://www.pitayagenomic.com/）官网中获取火龙果不同组织（果肉、刺座、花和果皮）和部分组织不同发育阶段的转录组数据，提取其中 HSF 基因表达数据（以TPM计），使用热图展示HSF 基因在火龙果不同组织中的表达量。
1.8 qPCR分析
利用 Omega 植物RNA 提取试剂盒（R6827-01）提取 RNA，并使用NanoDrop™One（Thermo Fisher）检测纯度和浓度，最后使用 Takara 反转录试剂盒（PrimeScriptTRT reagent Kit）逆转录获得 cDNA 。
使用 Primer Premier 5.0 软件设计相应引物，使用诺唯赞 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Q712-02）按照说明书对相应基因表达进行相对定量分析，每个样品重复 3 次，根据 2−∆∆CT 法计算相对表达量。
2. 结果与分析
2.1 火龙果HSF基因家族鉴定
通过Blast 比对从结果中筛选出 13 个火龙果 HSF 基因家族序列，分别命名为 SpHSF1~SpHSF13（表1）。这13 个基因家族成员的编码区序列（CDS）长度为 798~
1518 bp，HSF 基因家族编码的氨基酸数目为 265~505 aa，蛋白质相对分子量为 30.59~55.32 kDa ，等电点（PI）为 4.66～9.18 ，不稳定系数为42.91～72.24 。根据不稳定系数分析，由于其数值均大于40，说明 13 个 HSF 基因编码的蛋白均为不稳定蛋白。表 1 火龙果 HSF 基因家族信息Table 1. Information on HSFs in pitaya基因ID
Gene ID编码区长度
CDS length/bp编码蛋白质特性
Characteristic of the coding protein氨基酸数目
Amino acid number/aa分子量
Molecular weight/kDa等电点
isoelectric point不稳定系数
Instability coefficientHU02G02398.1 1368 455 50.22 5.28 65.89 HU04G00163.1 969 322 34.39 4.89 61.69 HU04G01591.1 1479 492 54.93 5.57 59.68 HU04G01952.1 1146 381 43.68 5.37 52.94 HU05G00210.1 1518 505 55.32 4.82 55.18 HU05G01887.1 846 281 31.31 5.53 42.91 HU08G01904.1 1230 409 46.78 5.18 52.64 HU10G00758.1 1131 376 42.85 4.66 51.09 HU10G01009.1 798 265 30.59 7.73 60.05 HU10G01257.1 1005 334 37.31 5.45 48.87 HU10G01285.1 1461 486 53.76 5.27 72.24 HU10G01592.1 882 293 33.26 9.18 48.85 HU11G00478.1 1017 338 38.32 6.09 57.00 2.2 Motif分析
通过Motif 分析，鉴定出 8 个保守基序 Motif（图1-A）。13 个 HSF 基因家族成员都含有 Motif 1、Motif 2、Motif 3 和 Motif 4 等4个保守基序。其中，HU04G01591.1、HU04G01952.1、HU05G00210.1、HU08G01904.1 和 HU10G01285.1 等5个基因拥有 8 个 Motif 基序，具有最多的保守区域。
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图 1 HSF 基因家族蛋白基序预测分析（A）及 HSF 结构基因（B）Figure 1. Protein motif prediction on HSF family (A) and HSF structure gene (B)2.3 HSF基因家族成员基因结构分析
在基因结构分析中（图1-B），发现火龙果 13 个 HSF 基因家族成员中， 10个基因仅含有一个内含子， HU04G01591.1 和 HU10G01257.1 有两个内含子，HU08G01904.1 具有三个内含子。
2.4 HSF基因家族成员染色体定位
HSF 的 13 个基因家族成员分布在火龙果 11 条染色体中的 6 条上（图2）。其中 chr10 染色体含有 5 个 HSF 基因家族成员，chr04 含有 3 个，chr05 含有 2 个，chr02、chr08 和 chr11 分别含有 1 个基因家族成员。从分布位置特征来看， HU05G00210.1、HU05G01887.1、HU04G00163.1、HU04G01952.1 和 HU08G01904.1 这几个基因分布在基因密度较大的染色体区域。
2.5 启动子顺式作用元件分析
火龙果 HSF 基因家族共检测到 16 种启动子顺式作用元件（图3），可分为四类：（1）激素响应元件，如生长素响应元件，赤霉素响应顺式作用元件，脱落酸响应顺式作用元件，水杨酸响应顺式作用元件等；（2）逆境胁迫相关元件，如防御和应激响应顺式作用元件，低温响应顺式元件，厌氧诱导基础顺式调节元件，茉莉酸甲酯响应调节元件，玉米醇溶蛋白代谢顺式调控元件，缺氧特异性诱导类增强子元件，干旱诱导的 MYB 结合位点，类黄酮生物合成基因调控 MYB 结合位点等；（3）植物生长发育调控相关元件，如昼夜节律控制顺式调控元件，与分生组织表达相关的顺式调控元件，栅栏组织细胞分化作用元件等；（4）光响应相关元件，如参与光响应的顺式调节元件和参与光响应性 MYB 结合位点。
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图 3 HSF 基因启动子区域顺式作用元件的预测Figure 3. Predicted cis-acting elements in promoter region of HSF2.6 基因结构域的预测
对火龙果 HSF 基因家族成员所编码的 HSF 进行蛋白质结构预测，结果显示（图4），13 个 HSF 基因家族成员中的 10 个含有 HSF domains 结构域，另外三个成员中HU08G01904.1 和 HU10G00758.1含有 HSF 1 superfamily 结构域，HU10G01257.1含有 HSF_DNA-bind 结构域。此外，HU05G00210.1、HU04G01591.1、HU04G01952.1 和 HU11G00478.1 四个基因除了含有 HSF domains 结构域外，还分别含有 SMC_prok_B_superfamily、bZIP superfamily、GumC superfamily 和 PRK03918 superfamily 结构域。
2.7 基因进化树的构建
使用火龙果、拟南芥、甜菜、番茄和小麦等5个物种的 HSF 基因序列共同构建的系统进化树显示（图5），五个物种的 HSF 基因家族被分为 4 个类群，其中火龙果HU10G01592.1 和 HU10G00758.1 这两个基因分别与小麦的 TraesCS2A02G146600.1 和番茄的 Solyc09g059520.3.1 基因的亲缘关系较近，其余的基因都与甜菜的基因亲缘关系相近。
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图 5 5个物种 HSF 基因家族序列系统进化树AT 为拟南芥基因序列、HU 为火龙果基因序列、XP 为甜菜基因序列、TraesCS 为小麦基因序列、Solyc 为番茄基因序列Figure 5. Phylogenetic tree of HSF sequences in 5 speciesAT: Arabidopsis gene sequence; HU: pitaya gene sequence; XP: beet gene sequence;TraesCS: wheat gene sequence; Solyc: tomato gene sequence.将火龙果的 13 个 HSF 基因构建系统进化树（图6），结果表明，13 个 HSF 基因可以被分为四类。HU08G01904.1 和 HU10G01285.1 亲缘关系较近，HU11G00478.1 和 HU04G01952.1 亲缘关系较近，HU04G01591.1 和 HU05G00210.1 亲缘关系较近，HU10G01257.1 和 HU04G00163.1 亲缘关系较近。
2.8 基因表达分析
结果（图7）显示，在火龙果果肉中 HU02G02398.1的表达量最高，其他基因的表达量相对较低；在刺座中 HU04G00163.1 表达量最高，其次是 HU05G01887.1；在花、花粉和子房等生殖器官中 HU05G01887.1 都有很高的表达量，而且 HU05G01887.1 在果皮、根系和鳞片中表达量也是最高的；HU04G01591.1 和 HU08G01904.1 两个基因在花丝中的表达量较高，而且两个基因的表达量十分相近；而 HU10G01592.1 和 HU04G01952.1 两个基因在上述组织中几乎不表达。
2.9 qPCR分析
根据火龙果 HSF 基因的组织表达特性及在枝条的表达情况（qPCR显示，大部分HSF基因在枝条几乎不表达），选择表达量相对较高的5个基因 HU05G00210.1、HU04G00163.1、HU05G01887.1、HU02G02398.1 和 HU10G01257.1进行 qPCR 分析，使用 Actin 作为本次实验的内参基因，相关引物见表2 所示。
表 2 引物序列Table 2. Primer sequences基因
GeneF端引物
F primerR端引物
R primerActin AAAGGCTAACAGG
GAGAAAAGACCACTGGCGTAA
AGAGAAHU05G00210.1 TCGCCAGCTCAAC
ACCTATCTTCCTCCAGCC
CAAATHU04G00163.1 TGTTTGGCGACC
TGCTGGCGTCGTTGGTG
TATTCGHU05G01887.1 CCGAGCACTGATG
ATGTGATTTGTCCGGCACT
GTTTTHU02G02398.1 TCTCCAGTTTCG
TCCGTCCTTCTCCCTCCTCA
ACTTCTHU10G01257.1 TTTGCTCCCGCG
TTATTTTGTCTTCCGTCGC
TGTATTT结果（图8）表明，其中有3个基因的表达量显示上升趋势，一个基因的表达量则呈下降趋势，而另外一个基因的表达量表现为先下降后升高的变化趋势。HU05G00210.1 在经过 24 h 热处理后表达量对比空白对照组上升 4 倍，热处理 48 h 基因的表达量几乎不变；HU05G01887.1 经过 24 h 热处理和 48 h 热处理后表达量对比空白组上升 3 倍多；HU10G01257.1 在经过 24 h 热处理后表达量几乎与空白组相当，但经过 48 h 热处理后，其表达量相较于空白组提高了接近 4 倍；HU02G02398.1 的表达量在 24 h 热处理后先轻微降低，在 48 h 热处理后表达量又出现上升趋势；而 HU04G00163.1 在 24 h 热处理和 48 h 热处理实验中都呈现下降趋势。
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图 8 部分 HSF 基因家族在高温胁迫下的表达情况Figure 8. Expressions of some HSFs under high temperature stress3. 讨论
本研究基于火龙果基因组数据共鉴定出 13 个 HSF 基因家族成员。对这 13 个基因编码的蛋白质进行理化性质分析，发现这些 HSF 蛋白均为不稳定蛋白。火龙果 HSF 基因家族编码的大部分蛋白质等电点（PI）小于7，为酸性蛋白，仅 有HU10G01009.1 和 HU10G01592.1 编码的蛋白质PI大于7，为碱性蛋白。由此可见，火龙果 HSF 基因家族编码的蛋白质性质不完全相同，氨基酸数量也存在明显差异，每个基因家族成员可能具有不同的功能并参与不同的调控机制，但这 13 种蛋白也有共同点，即都是不稳定蛋白。在 郭存等[16]的研究中，发现烟草的 HSF 在理化性质上同样存在着较大的差异，烟草 HSF 的氨基酸数量、相对分子量和等电点都在一个范围较大的区间内，与火龙果 HSF 的理化性质相似。通过基因结构域分析和 Motif 基序分析，发现13 个 HSF 基因都含有 HSF 相关结构域且具有较高的保守性。在胡亚威等[17]的研究中，鉴定出柑橘的HSF 含有 20 个 Motif 保守基序，在 刘丹等[18]的研究中，同样也鉴定出桑树的 HSF 含有 20 个 Motif 保守基序，保守的 Motif 在不同物种中可能具有相似功能。通过对比不同物种间的 Motif，研究人员可以了解基因家族的进化关系和功能演变，这对于理解生物多样性和进化历程具有重要意义。火龙果大部分 HSF 基因家族含有 HSF domain、HSF_DNA-bind或 HSF 1 superfamily等HSF 基因家族基本结构域，部分基因家族成员还拥有SMC_prok_B_superfamily、bZIP superfamily、GumC superfamily和 PRK03918 superfamily 等结构域。这些结构域功能多样，比如SMC_prok_B_superfamily属于结构维持染色体（Structural Maintenance of Chromosomes, SMC）蛋白家族，可以确保高温胁迫中遗传物质的稳定性[19]；bZIP superfamily广泛参与应激反应，比如高温胁迫，相关基因表达调控[20]；GumC superfamily和生物膜的形成和稳定性有关，维持生物膜稳定性也是应对高温胁迫中的关键[21]，PRK03918 superfamily的具体功能不太清楚，这仍需后续深入研究加以解析。从上述分析可知，发现火龙果 HSF 基因家族编码的蛋白既有一定的相似程度，又各具特点，具有从多个角度应对高温胁迫的基因结构。
根据火龙果 HSF 启动子顺式作用元件分析结果（图3），发现大部分为激素响应元件和逆境胁迫元件。比如 ABRE 和 P1BS，ABRE 在逆境条件下对Cat1 基因的表达具有重要调控作用，而P1BS顺式作用元件则在低磷胁迫条件下调控氨基酸转运蛋白基因的表达。这些调控元件通过与目标基因的相对空间作用，影响目标基因的表达，进而影响相应蛋白的合成，从而实现对植物生理过程的调节[22,23]。在火龙果 HSF 基因家族启动子元件中，还发现了茉莉酸甲酯响应调节元件，茉莉酸甲酯是一种重要的植物生长调节剂，能够激发植物的防御反应，并对多种生物和非生物胁迫做出响应[24−26]。茉莉酸甲酯响应调节元件涉及多个层面的分子调控机制，响应 MeJA 信号并调控植物的生长发育和防御反应[27,28]。在 Gul 的研究中，已证明茉莉酸甲酯在应对环境温度胁迫方面有明显影响[29]。这可能也是HSF涉及防御反应以及应对环境温度胁迫的作用方式之一。
根据亲缘关系，火龙果的 HSF 基因家族被分为 4 个类群。在其他植物的 HSF 的基因进化分析中，花生[30]、百香果[31]和菠萝[32]的 HSF 基因家族被分为 3 个类群；水稻[33]的 HSF 基因家族被分为 4 个类群；火龙果的 HSF 基因家族的分类与它们的分类相类似。从系统进化树结果分析可知，火龙果 HSF 基因家族与拟南芥、番茄和小麦的 HSF 基因家族亲缘关系较远，而与甜菜的亲缘关系较近，所以火龙果 HSF 基因家族的功能可能与甜菜 HSF 基因家族的功能相似或相同。此外，本研究还构建了火龙果 HSF 基因家族内部成员的基因进化树，发现 13 个基因家族成员内部也存在较为明显的亲缘关系差异，Motif 分析的结果也从侧面印证了同一分支的基因具有相似或相同的保守基序。
根据基因表达分析结果发现，不同基因在火龙果不同组织的表达量存在明显的差异，例如 HU05G01887.1、HU04G01591.1、HU08G01904.1 等基因在火龙果营养器官表达量较高，HU10G01257.1、HU10G01592.1、HU04G01952.1、HU10G01009.1、HU11G00478.1 等基因在火龙果的大部分组织的表达量都相对较低，这说明火龙果 HSF 基因家族具有较强的组织特异性。小麦、番茄、芝麻、蒲公英和猕猴桃等植物都已证明 HSF 基因在植物的在不同组织表达量存在较大的差异，与火龙果 HSF 基因在不同组织的表达情况相类似[34−38]。
从 qPCR 结果分析结果分析（图8），枝条组织HSF 基因家族成员在经过高温（40 ℃）处理后，表达量以升高为主。其中 HU10G01257.1 基因在 24 h 热处理中的表达量没有明显变化，48 h 热处理后该基因表达量显著上升，可能是因为HU10G01257.1对高温的响应较慢，或者是参与一些高温损伤修复过程。HU05G01887.1、HU05G00210.1表达量则随着处理时长增加而增加，可能是枝条应对高温胁迫的关键HSF基因。同时出现了两个特殊的基因 HU02G02398.1 和 HU04G00163.1，其中 HU04G00163.1 在 24 h 热处理和 48 h 热处理试验中都呈现轻微下降趋势，而 HU02G02398.1 表达量虽然随着处理和处理时间增加，但是也增加的不显著，这2个基因在对枝条24 h及48 h高温处理似乎没有明显的响应。在 Liu [39]的研究中，发现 HSFA2 突变体的拟南芥比野生型的拟南芥能更加敏感地感受温度的变化，增强植株的耐热性，说明拟南芥 HSFA2 具有应对高温胁迫重要作用。在小麦[40]、大豆[41]、柑橘[17]、水稻[42]、玉米[43]和烟草[16]等植物中，都有研究证明 HSF 基因能够响应高温胁迫，防止植物在高温环境中受到损伤。试验结果表明火龙果的HSF基因也对火龙果应对高温胁迫起着重要作用，尤其是HU05G01887.1、HU05G00210.1和HU02G02398.1可能是火龙果只填组织应对高温胁迫的关键基因。
4. 结论
本研究从 Motif 分析、基因结构分析、基因结构域预测、染色体定位、启动子分析和系统进化树分析等多方面，对火龙果 HSF 基因家族进行了较为系统性的分析，鉴定出 13 个火龙果 HSF 基因家族成员。根据亲缘关系，这 13 个 HSF 基因家族成员可以被分为四类，并且 HSF 基因所编码的热激转录因子全部都是不稳定蛋白。本研究通过高温胁迫实验发现，HU05G01887.1和HU05G00210.1两个基因可能是火龙果枝条响应高温胁迫的关键基因，而HU02G02398.1可能更主要作用于高温损伤后的修复。本研究从生物信息学分析和热胁迫响应分析入手，获得了火龙果HSF 基因家族的基本信息和特性，验证了 HSF 基因在枝条热胁迫中的反应，为全面探究 HSF 基因家族提供了一定的理论依据。
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图 1 各试验处理对花绒寄甲密度提升率影响的比较
图中不同大写字母表示差异显著（P＜0.01）。
Figure 1. Effect of experimental method on insect density at test sites
Data with different capital letters indicate significant difference at P＜0.01.
表 1 试验地点、时间及试验处理基本情况
Table 1 Experimentation sites, time, and basic information
地点
Location code处理组数
Number of
processing groups试验区面积
Test area/hm2树高
Tree height/m胸径
DBH/cm试验前的疫木处理方式
Treatment of Phytophthora
before the test试验项目
Experimental projectNK 3 16.31 7.06 9.13 CB 释放比率试验
Release ratio testWA 4 39.08 9.43 11.24 NT 繁育世代数试验
Breeding generations testXJ 2 11.07 7.95 12.72 CB 疫木处理试验
Epidemic wood treatment testYF 5 35.13 8.07 11.92 CB 释放次数、种源试验
Release frequency and natural enemy source testXF 4 31.44 9.87 11.69 CB 体型试验
Individual size test①地点代码为试验地所在县的县名拼音首字母。 ②疫木处理方式“CB”代表“现砍现烧”，“NT”代表“不处理”。
① Location codes are expressed with first letter of pinyin name of county of test site. ② CB: cutting and burning diseased trees; NT: no treatment.
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表 2 试验方法
Table 2 Experimental methods
地点
Location code试验项目
Experimental project种源
D. helophoroides
source繁育代数
Breeding enerations体型
Body individuals释放比率
Release ratio释放次数
Release frequency疫木处理
Epidemic wood
treatmentYF1 种源试验
D. helophoroides source testGN、GB F3 B 1∶1 3 NT WA 繁育世代数试验
Breeding generations testGN F3、F11 B 1∶1 3 NT XF 体型试验
Body size testGN F3 A、B 1∶1 3 NT NK 释放比率试验
Release ratio testGN F3 B 2∶1、1∶1、1∶2 3 NT YF2 释放次数试验
Release frequency testGN F3 B 1∶1 1、2、3 NT XJ 疫木处理试验
Epidemic wood treatment testGN F3 B 1∶1 3 NT、CB 体型“A”代表“大型个体”，“B”代表“混合型个体”；其他同表1。
Large body individual; B: individuals of mixed body types; others: same aslisted in Table 1.
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表 3 花绒寄甲种源对其林间种群密度的影响
Table 3 Effect of D. helophoroides source on population density at test sites
年份 Year 寄甲密度 D. helophoroides density/（头·hm−2） 种群密度提升率 Population density improvement rate/% 种源GN Source GN 种源GB Source GB 种源GN Source GN 种源GB Source GB 2019 927.86 915.85 2020 1931.62 1615.85 108.18 76.43 2021 2796.56 1961.57 201.40 114.18 2022 3969.27 2853.29 327.79 211.55 2023 5531.37 4067.12 496.15±11.94 A 344.08±16.10 B 同行均值（平均值±标准差）后不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。下同。
Data with different capital letters after mean (mean±SD) on same row indicate significant difference at P＜0.01. Same for following tables.
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表 4 花绒寄甲繁育代数对其林间种群密度提升的影响
Table 4 Effect of breeding generation of D. helophoroides on population density at test sites
年份Year 寄甲密度 D. helophoroides density/（头·hm−2） 种群密度提升率 Population density improvement rate/% F3 F11 F3 F11 2019 1211.58 1176.27 2020 2927.86 2241.69 141.66 90.58 2021 3809.96 3114.76 214.46 164.80 2022 4857.27 3953.29 300.90 236.09 2023 6374.83 4759.09 426.16±20.28 A 304.59±13.92 B
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表 5 花绒寄甲体型大小对其林间种群密度提升的影响
Table 5 Effect of body size of D. helophoroides on population density at test sites
年份
Year寄甲密度 D. helophoroides density/（头·hm−2） 种群密度提升率 Population density improvement rate/% 大型个体
Large body individuals混合型
Mixed individuals大型个体
Large body individuals混合型
Mixed individuals2019 786.06 741.45 2020 2076.77 1625.85 164.20 119.28 2021 3186.51 2435.29 305.38 228.45 2022 4379.56 3264.80 457.15 340.32 2023 5917.28 4525.69 652.77±29.84 A 510.38±45.28 B
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表 6 花绒寄甲释放比率对其林间种群密度提升的影响
Table 6 Effect of release rate of D. helophoroides on population density at test sites
年份Year 寄甲密度 D. helophoroides density/（头·hm−2） 种群密度提升率 Population density improvement rate/% 2∶1 1∶1 1∶2 2∶1 1∶1 1∶2 2019 761.32 759.87 747.58 2020 1467.49 1875.65 2497.56 92.76±9.29 A 146.84±15.36 B 234.09±19.55 C 2021 2148.70 2554.66 3177.63 182.23±17.81 A 236.20±22.50 B 325.06±24.11 C 2022 2747.56 a3469.80 b3941.04 b260.89±21.34 A 356.63±20.48 B 427.17±18.73 C 2023 3552.18 a4519.27 b4753.89 b366.58±17.55 A 494.74±20.81 B 535.90±19.20 C
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表 7 花绒寄甲释放次数对其林间种群密度提升的影响
Table 7 Effect of number of D. helophoroides release on insect density at test sites
年份 Year 寄甲密度 D. helophoroides density/（头·hm−2） 种群密度提升率 Population density improvement rate/% 释放1次
Release once释放2次
Release twice释放3次
Release 3 times释放1次
Release once释放2次
Release twice释放3次
Release 3 times2019 834.61 860.71 849.48 2020 1587.52 1702.65 1657.09 90.21 97.82 95.07 2021 1997.24 2265.45 2673.16 139.30 163.21 214.68 2022 2430.06 2911.38 3534.44 191.16±18.37 A 238.25±21.46 B 316.07±22.85 C 2023 2947.57 4172.19 5269.27 253.17±12.76 A 384.74±11.41 B 520.29±18.07 C
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表 8 疫木处理方式对花绒寄甲林间种群密度提升的影响
Table 8 Effect of diseased tree treatments on nsect density at test sites
年份 Year 寄甲密度 D. helophoroides density/（头·hm−2） 种群密度提升率 Population density improvement rate/% 疫木不处理
No treatment for epidemic wood现砍现烧
Felled and immediate burning疫木不处理
No treatment for epidemic wood现砍现烧
Felled and immediate burning2019 517.91 343.65 2020 1479.14 427.91 185.60 24.52 2021 2086.11 552.37 302.80 60.74 2022 2991.56 778.26 477.62 126.47 2023 4175.52 960.84 706.23 179.60
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