桑葚果腐病病原菌的分离鉴定及抑菌植物提取物筛选

李青; 宋春茶; 罗建梅; 杨态娇; 聂闪闪; 张东华; 刘丽; 胡世俊; 闫晓慧

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2024.11.010

桑葚果腐病病原菌的分离鉴定及抑菌植物提取物筛选

李青^{1, 2,},
宋春茶^{1, 2},
罗建梅^{1, 2},
杨态娇^{1, 2},
聂闪闪^{1, 2},
张东华^{1, 2},
刘丽^{1, 2},
胡世俊^{2, 3, ,},
闫晓慧^{1, 2, ,}

1.
云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南　昆明　650224
2.
西南林业大学林学院，云南　昆明　650224
3.
国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南　昆明　650224

基金项目: 国家自然科学基金（32160378）；云南省高层次人才项目（YN-WR-QNBJ-2018-300）；西南林业大学博士科研启动经费项目（111711、111712）

详细信息

作者简介:
李青（2000 — ），女，硕士研究生，主要从事有害生物综合防控研究，E-mail：Lq15912856989@163.com

通讯作者:
胡世俊（1977 — ），男，博士，副教授，主要从事入侵植物研究，E-mail：shijunhu@126.com

闫晓慧（1980 — ）女，博士，教授，主要从事植物源农药研究，E-mail：luckyyxh@163.com

中图分类号: S436.6
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出版历程
- 收稿日期: 2024-04-08
- 修回日期: 2024-08-29
- 网络出版日期: 2024-12-04
- 刊出日期: 2024-11-27

Identification and Natural Antibacterial Agent of Mulberry Rot Pathogen

LI Qing^{1, 2,},
SONG Chuncha^{1, 2},
LUO Jianmei^{1, 2},
YANG Taijiao^{1, 2},
NIE Shanshan^{1, 2},
ZHANG Donghua^{1, 2},
LIU Li^{1, 2},
HU Shijun^{2, 3, ,},
YAN Xiaohui^{1, 2, ,}

1.
Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province, Kunming, Yunnan　650224, China
2.
College of Forestry，Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan　650224, China
3.
Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China(State Forestry Administation), Kunming, Yunnan　650224, China

摘要

摘要:
目的
分离鉴定桑葚果实腐烂的病原菌并筛选对其具有抑菌活性的植物提取物，为桑葚果腐病的绿色防控提供依据。
方法
采用组织分离法分离病原菌并通过真菌形态学及分子生物学对病原菌进行鉴定；采用菌丝生长速率法测定54种植物提取物对桑葚果实腐烂病原菌的抑菌活性，筛选活性较好的提取物，通过浓度梯度进行毒力测定，最后通过显微观察活性较好的提取物（EC₅₀）对菌丝形态的影响。
结果
经形态及分子生物学鉴定该致病菌为易脆毛霉（Mucor fragilis）；当提取物质量浓度为1 mg·mL⁻¹时，青蒿和天蓝鼠尾草乙醇提取物对该菌株有较好的抑菌效果，抑菌率分别为77.72%和49.06%，经毒力测定其抑菌有效中浓度（EC₅₀）分别为0.063、0.107 mg·mL⁻¹；通过显微镜观察发现，青蒿乙醇提取物可导致病菌菌丝畸变，天蓝鼠尾草对病原菌菌丝形态无明显影响。
结论
本研究发现青蒿和天蓝鼠尾草对桑葚果腐病菌易脆毛霉有较好的抑菌活性，青蒿提取物的抑菌活性尤为显著，EC₅₀仅为0.063 mg·mL⁻¹，具有进一步开发的价值。
- 桑葚果腐病 /
- 植物提取物 /
- 抑菌活性 /
- 毒力
Abstract:
Objective
Pathogen of the fruit rot on mulberries was isolated and identified, and effective antibacterial plant extracts for the disease prevention and control selected.
Method
Tissue separation method was applied to isolate potential pathogens from the infected mulberries. The morphology and molecular biology of the isolates were examined for pathogen identification. Antibacterial activity of 54 plant ethanol extracts was tested to compare the inhibition on the growth of the isolate mycelia. Virulence of the most potent extracts at gradient concentrations was determined along with microscopic observations.
Result
Growth of the identified pathogen, Mucor fragilis was significantly inhibited at a rate of 77.72% by the extract of Artemisia caruifolia on a dosage of 1 mg·mL⁻¹ rendering an EC₅₀ at 0.063 mg·mL⁻¹, and also at a rate of 49.06% by Salvia uliginosa with an EC₅₀ at 0.107 mg·mL⁻¹. In addition to a higher inhibition rate, the A. caruifolia extract induced significant mycelial distortions on the pathogens as shown under the microscope.
Conclusion
Significant antifungal activities against the mulberry rot-causing M. fragilis were found of the ethanol extracts of A. caruifolia and S. uliginosa. With a toxicity of EC₅₀ at 0.063 mg·mL⁻¹ and significant deformation on the mycelia of the pathogen, A. caruifolia was considered the choice candidate as a biocontrol agent against the disease.
- Mulberry rot disease /
- plant extracts /
- antibacterial activity /
- toxicity

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0. 引言

【研究意义】桑葚（Fructus Mori）是桑科（Moraceae）桑属（Morus）植物成熟果穗的统称，别名为桑乌、桑果、桑枣^[1]，桑葚富含维生素、氨基酸、花青素、多糖和蛋白质等，具有很高的营养价值和保健作用^[2−4]。我国桑树病害200余种，其中真菌病害占80%左右^[5]，严重影响了桑果的产量和品质，给相关产业造成巨大的经济损失。桑葚果实腐生性病害是在采后是造成桑葚减产的主要因素，探寻无毒和环境友好抑菌手段可降低果桑产业发展过程中因桑葚果实腐烂造成的危害。【前人研究进展】桑葚果实腐烂致病菌有毛霉属（Mucor spp.）、匐枝根霉属（Rhizopus stolonifer spp. ）、葡萄孢属（Botrytis spp.）和层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）^[6−8]。目前已发现约有1400种植物具有杀菌活性；具有抑菌、杀菌活性的植物主要为菊科、豆科、伞形科、姜科、松科、樟科、禾本科、百合科、桃金娘科、唇形科等植物^[9−12]。据报道，麻黄乙醇提取物、八角茴香和厚朴乙醇提取物对桑葚菌核病具有较好的抑菌活性^[13−14]；王彩霞等^[15]对87种药用植物进行抑菌筛选，发现厚朴和麻叶蟛蜞菊提取物对葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）有较好的抑菌活性，厚朴、乌药和麦冬提取物对禾谷镰孢（Fusarium graminearum）有较好的抑菌活性；苟亚峰等^[16]对23种植物进行抑菌筛选，发现圆滑番荔枝提取物对胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）有较好的抑菌活性。【本研究切入点】关于桑葚果腐病病原菌及防治该病害的相关研究报道较少。【拟解决关键问题】通过组织分离法从桑葚果腐病病果上分离纯化得到病原菌，结合形态学及分子生物学技术鉴定该病原菌。通过菌丝生长速率法测定54种植物提取物对该病原菌的抑制作用，旨在为桑葚采后病害的绿色防控提供依据，为开发新型植物源杀菌剂奠定基础。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

供试植物分属于22科，共54种，分别采自辽宁、广西、云南等地，由西南林业大学林学院胡世俊副教授鉴定，详见表1。

表 1 供试植物名录

Table 1. List of tested plants

序号 Number	植物名称 Plants	科 Family	提取部位 Plant parts	采集地点 Location
1	牛尾蒿 Artemisia dubia	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
2	千里光 Senecio scandens	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
3	鱼眼草 Dichrocephala integrifolia	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
4	黑蒿 A. palustris	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
5	茵陈蒿 A. capillaris	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
6	小花鬼针草 Bidens parviflora	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
7	全叶马兰 Aster pekinensis	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
8	革命菜 Crassocephalum crepidioides	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
9	藿香蓟 Ageratum conyzoides	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
10	银胶菊 Parthenium hysterophorus	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
11	香丝草 Erigeron bonariensis	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
12	金腰箭 Synedrella nodiflora	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
13	翼齿六棱菊 Laggera pterodonta	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
14	野蒿茼 Crassocephalum crepidioides	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
15	微甘菊 Mikania micrantha	菊科 Asteraceae	地上部分	云南德宏
16	青蒿 A. caruifolia	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
17	天名精 Carpesium abrotanoides	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
18	紫茎泽兰 Ageratina adenophora	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
19	香青 Anaphalis sinica	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
20	土木香 Inula helenium	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
21	小鱼眼草 Dichrocephala benthamii	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
22	假臭草 Praxelis clematidea	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
23	火绒草 Leontopodium leontopodioides	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
24	尼泊尔香青 Anaphalis nepalensis	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
25	钻叶紫菀 Symphyotrichum subulatum	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
26	芳香堆心菊 Helenium aromaticum	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
27	水棘针 Amethystea caerulea	唇形科 Lamiaceae	全草	辽宁朝阳
28	益母草 Leonurus japonicus	唇形科 Lamiaceae	全草	云南昆明
29	墨西哥鼠尾草 Salvia leucantha	唇形科 Lamiaceae	地上部分	云南昆明
30	香茶菜 Isodon amethystoides	唇形科 Lamiaceae	地上部分	云南昆明
31	天蓝鼠尾草 Salvia uliginosa	唇形科 Lamiaceae	地上部分	云南昆明
32	山薄荷 Dracocephalum moldavica	唇形科 Lamiaceae	全草	辽宁朝阳
33	马鞭草 Verbena officinalis	马鞭草科 Verbenaceae	全草	云南昆明
34	牛筋果 Harrisonia perforata	芸香科 Rutaceae	地上部分	云南昆明
35	臭椿 Ailanthus altissima	苦木科 Simaroubaceae	枝叶	辽宁朝阳
36	拔毒散 Sida szechuensis	锦葵科 Malvaceae	地上部分	云南昆明
37	土牛膝 Achyranthes aspera	苋科 Amaranthaceae	全草	云南昆明
38	土荆芥 Dysphania ambrosioides	苋科 Amaranthaceae	全草	云南昆明
39	粉花月见草 Oenothera rosea	柳叶菜科 Onagraceae	地上部分	云南昆明
40	黄花酢浆草 Oxalis pes-caprae	酢浆草科 Oxalidaceae	全草	云南昆明
41	荨麻 Urtica fissa	荨麻科 Urtiaceae	全草	云南昆明
42	女萎 Clematis apiifolia	毛茛科 Ranunculaceae	地上部分	云南昆明
43	老鹳草 Geranium wilfordii	牻牛儿苗科 Geraniaceae	全草	云南昆明
44	络石 Trachelospermum jasminoides	夹竹桃科 Apocynaceae	枝、叶	云南昆明
45	线萼山梗菜 Lobelia melliana	桔梗科 Campanulaceae	地上部分	云南昆明
46	黄精 Polygonatum sibiricum	天门冬科 Asparagaceae	地上部分	辽宁朝阳
47	曼陀罗 Datura stramonium	茄科 Solanaceae	枝、叶	云南昆明
48	忍冬 Lonicera japonica	忍冬科 Caprifoliaceae	地上部分	云南昆明
49	马桑 Coriaria nepalensis	马桑科 Coriariaceae	枝、叶	云南昆明
50	毛蕊花 Verbascum thapsus	玄参科 Scrophulariaceae	地上部分	云南昆明
51	紫红獐芽菜 Swertia punicea	龙胆科 Gentianaceae	全草	云南昆明
52	罗汉松 Podocarpus macrophyllus	罗汉松科 Podocarpaceae	枝、叶	云南昆明
53	假酸浆 Nicandra physalodes	茄科 Solanaceae	地上部分	云南昆明
54	角蒿 Incarvillea sinensis	紫葳科 Bignoniaceae	地上部分	辽宁朝阳

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1.1.2 供试药剂

60%唑醚·代森联水分散粒剂购自巴斯夫（中国）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的制备

采用乙醇回流法^[17−18]提取植物样品。植物材料风干粉碎后称取粗粉200 g，用95%乙醇加热回流提取1 h，重复3次并合并提取液，通过旋转蒸发仪浓缩回收溶剂，得到乙醇提取物，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 病原菌的分离纯化

采用组织分离法^[19]对病原菌进行分离。将发病的桑葚果实用无菌水冲洗干净，75%乙醇消毒5 s，取出后用无菌水清洗并吸干水分，无菌条件下切取约5 mm×5 mm的病组织块，置于PDA培养基中，在28 ℃电热恒温培养箱中培养3 d，待病组织块长出菌丝后，挑取菌落边缘菌丝进行纯化，直到平板上长出单一菌落。

1.2.3 病原菌的形态学观察

用无菌打孔器在已分离纯化得到的菌株边缘打取6 mm的菌饼，置于新的PDA培养基上，28 ℃恒温培养箱中暗培养，观察并记录菌株的培养性状，5 d后在光学显微镜下观察菌株的显微特征。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定

纯化的菌株送至擎科生物有限公司进行总DNA提取和ITS序列的扩展测序，采用真菌通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，其中PCR Mix (2×) 12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH₂O 9.5 μL。所得测序结果在NCBI上进行BLAST对比分析，并下载同源性相近物种序列，基于MEGA6软件构建系统发育树。

1.2.5 病原菌致病性测定

基于柯赫氏法则对病原菌的致病性进行测定。用无菌接种针将健康的桑葚果实刺伤，挑取适量菌丝贴于果实伤口处，室温保湿培养，每隔2 h观察并记录果实的发病情况，以不接种菌丝只制造伤口的桑葚果实为对照。待接种的桑葚果实出现症状，通过组织分离法进行再分离、纯化，并与原菌株进行比较。

1.2.6 抑菌活性测定

采用菌丝生长速率测定法^[20−21]测定提取物抑菌活性。用二甲基亚砜（DMSO）溶解一定量的醇提取物，使提取物母液质量浓度为100 mg·mL⁻¹，将母液置于60 ℃恒温箱30 min，消毒备用。PDA培养基经高压灭菌后降温至50 °C以下，在无菌操作台中将母液与PDA培养基充分混合，最终使带毒培养基质量浓度为1 mg·mL⁻¹，混合均匀后倒入无菌培养皿中，固化后制成带毒平板，以同等浓度的DMSO为空白对照。在菌落边缘用6 mm无菌打孔器打取菌饼，置于带毒平板中央，28 ℃恒温培养箱中倒置培养，每个处理3个重复；采用十字交叉法测量菌落直径，待对照组的菌落长到培养皿的90%，即可测量结果，计算其抑菌率。计算公式如下：纯生长量=菌落平均直径−菌饼的直径；抑菌率/%=[（对照纯生长量−处理纯生长量）/对照纯生长量]×100。

1.2.7 抑菌毒力EC₅₀测定

对抑菌活性较好的植物提取物进一步进行毒力测定。用二倍稀释法将植物提取物稀释至0.25、0.50、1.00、2.00 mg·mL⁻¹，阳性对照药剂为60%唑醚·代森联水分散粒剂，每个处理3次重复。采用1.2.5的方法进行抑菌活性测定，不同天数、不同浓度的抑菌率换算成几率值，以抑菌几率为Y轴，浓度对数为X轴，通过SPSS概率分析得到其毒力回归方程和抑制中浓度EC₅₀。

1.2.8 植物提取物对病原菌菌丝形态的影响

挑取活性较好植物提取物（EC₅₀）处理的病原菌菌落边缘菌丝体，制成玻片标本，置于40倍光学显微镜下观察植物提取物对病原菌菌丝的影响，并拍照记录。

2. 结果与分析

2.1 病害的症状及病原菌分离鉴定

桑葚感染果腐病，发病初期在果实上出现白色病斑，果实软化，随着贮藏时间延长，病斑逐渐扩大使果实表面覆盖一层白色绒毛状菌丝，并散发出腐烂的气味，果实软腐（图1A）。

图 1 病害症状及菌落形态特征

A：桑葚果腐病症状；B：FM-01菌落正面；C：FM-01菌落背面。

Figure 1. Disease symptoms and colony morphology

A: Symptoms of mulberry rot disease; B: front view of FM-01 colony; C：back view of FM-01 colony.

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通过组织分离法从腐烂的桑葚果实上分离得到1株真菌，命名为FM-01。该菌株在PDA培养基上呈圆形菌落，菌落背面无色素产生；菌丝生长茂盛，呈棉絮状，繁密成层，直立，菌落初期为白色，后期转为灰白色（图1B～C）。

显微观察发现该菌株菌丝无横隔，单轴分枝，无假根及匍匐菌丝；各分枝顶端着生球形孢子囊，囊轴直立，孢囊孢子椭圆形；接合孢子表面粗糙，球形（图2）；初步将该病原菌鉴定为毛霉属真菌。

图 2 菌株在40倍光学显微镜下的特征（10×40）

A：菌丝；B：单轴分枝；C：孢子囊；D：孢囊梗；E：孢囊孢子；F：接合孢子。

Figure 2. Microscopic image of fungus (10×40)

A: Hypha; B: monopodial branching; C: sporangia; D: sporangiophore; E: sporangiospore; F: zygospore.

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进一步通过分子生物学对菌株进行鉴定，在GenBank上经进行BLAST序列比对发现菌株FM-01的基因序列与毛霉属真菌有较高的相似度，选择相似度高的菌株序列通过Neighbor-Joining构建系统发育树（图3），从图中可看出菌株FM-01与Mucor. fragilis（登录号：MH424493）属于同一分支，亲缘关系最近，结合该菌株的形态特征，鉴定该病原菌为易脆毛霉（Mucor fragilis）。

图 3 基于ITS基因序列构建的系统发育树

Figure 3. Phylogenetic tree based on IST sequences

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2.2 病原菌的致病性测定

根据柯赫氏法则对菌株的致病性进行测定，接种病原菌3 d后，桑葚果实出现明显的发病症状，果实表面长出白色菌丝，形成白色的霉层（图4A）；而对照组桑葚果实未发病（图4B）。挑取发病果实上的菌丝在PDA培养基上培养，其菌落形态与分离到的菌株一致。

图 4 回接验证结果

A：接种易脆毛霉菌株；B：对照。

Figure 4. Reverse validation of disease-causing pathogen

A: Inoculated with M. fragilis; B: control.

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2.3 54种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌活性

采用生长速率法测定了表1中所列的54种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌活性，在质量浓度为1 mg·mL⁻¹时40种提取物表现出不同程度的抑菌活性（表2），其中青蒿和天蓝鼠尾草提取物对该菌株菌丝生长抑制效果最好，抑制率分别为77.72%、49.06%，显著高于其他提取物；其次是茵陈蒿和香青，抑制率分别为44.80%、40.22%，与其他提取物有显著差异；此外香茶菜、全叶马兰、紫茎泽兰也表现出较好的抑菌活性，抑制率分别为38.75%、31.14%、31.14%，其余植物抑菌率均在30%以下，抑菌活性相对较低。

表 2 54种植物乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌活性筛选

Table 2. Antifungal activities on M. fragilis of 54 plant ethanol extracts

植物 Plants	抑菌率 Inhibition rate/%	植物 Plants	抑菌率 Inhibition rate/%
青蒿 A. caruifolia	77.72±0.01 a	天蓝鼠尾草 S.uliginosa	49.06±0.02 b
茵陈蒿 A.capillaris	44.80±0.02 c	香青 A. sinica	40.22±0.02 d
香茶菜 I. amethystoides	38.75±0.04 d	紫茎泽兰 A.adenophora	31.14±0.01 e
全叶马兰 A. pekinensis	31.14±0.01 e	假臭草 P. clematidea	27.38±0.02 f
天名精 C. abrotanoides	27.71±0.03 f	芳香堆心菊 H.aromaticum	25.95±0.02 f
鱼眼菊 D. benthamii	22.65±0.00 g	牛尾蒿 A. dubia	22.62±0.01 g
黑蒿 A. palustris	22.31±0.01 g	土木香 I. helenium	19.81±0.03 gh
藿香蓟 A.conyzoides	19.81±0.00 gh	微甘菊 M. micrantha	18.86±0.02 he
尼泊尔香青 A. nepalensis	17.88±0.02 hei	牛筋果 H. perforata	16.03±0.02 eij
益母草 L. japonicus	15.24±0.02 ijk	假酸浆 N. physaloides	13.85±0.01 jkl
臭椿 A. altissima	13.33±0.02 jkl	小花鬼针草 B. parviflora	12.49±0.01 klm
罗汉松 P. macrophyllus	12.25±0.01 lm	女萎 C. apiifolia	11.57±0.04 lm
紫红獐牙菜 S. punicea	11.32±0.00 lm	香丝草 E.bonariensis	10.89±0.03 lmn
土牛膝 A. aspera	10.21±0.01 mn	山薄荷 D. moldavica	9.70±0.05 mn
火绒草 L. leontopodioides	8.25±0.03 no	土荆芥 C. ambrosioides	6.67±0.02 op
黄精 P. sibiricum	6.61±0.02 op	金腰箭 S. nodiflora	6.24±0.01 op
粉花月见草 O. rosea	5.80±0.02 op	络石 T. jasminoides	5.09±0.01 pq
银胶菊 P. hysterophorus	4.41±0.01 pqr	墨西哥鼠尾草 S. leucantha	3.78±0.02 qrs
黄花酢浆草 O. pes-caprae	3.61±0.02 qrs	水棘针 A. caerulea	2.66±0.03 rs
革命菜 C. crepidioides	1.78±0.02 rs	千里光 S. scandens	0.95±0.02 s
表中数据为 3 次重复的平均值，平均数±标准差，字母不同者表示差异达显著水平（ P＜0.05）。下同。 Data are presented as mean of 3 repeats±standard deviation; those with different alphabets indicate significant difference at P＜0.05. Same for below.

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2.4 高活性植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌毒力

通过0.25、0.50、1.00、2.00 mg·mL⁻¹等4个浓度测定了天蓝鼠尾草乙醇提取物和青蒿乙醇提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌作用，在0～2.00 mg·mL⁻¹，各提取物的抑菌率随着浓度的增加（图5）。

图 5 青蒿和天蓝鼠尾草提取物对易脆毛霉的抑制效果

A：青蒿；B：天蓝鼠尾草。

Figure 5. Antifungal activities on M. fragilis of A. carvifolia and S. uliginosa extracts

A: A. carvifolia; B: S. uliginosa.

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在接种后的第2～5天每天分别测定各浓度提取物的抑菌率（图6、图7），以提取物各浓度对应的抑菌率为依据，分别拟合出第2、3、4、5天两种提取物的毒力方程（表3）。其中青蒿乙醇提取物的EC₅₀在0.063～0.113 mg·mL⁻¹，接种后第2天的毒力最强；天蓝鼠尾草乙醇提取物EC₅₀在0.760～1.356 mg·mL⁻¹，接种后第2天的毒力最强。

图 6 不同质量浓度青蒿乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌效果

Figure 6. Antifungal activities on M. fragilis of A. carvifolia ethanol extract in different concentrations

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图 7 不同质量浓度天蓝鼠尾草乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌效果

Figure 7. Antifungal activities on M. fragilis of S. uliginosa ethanol extract in different concentrations

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表 3 天蓝鼠尾草、青蒿乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌毒力

Table 3. Toxicity on M. fragilis of A. carvifolia and S. uliginosa ethanol extracts

植物 Plants	培养时间 Time/ d	毒力回归方程 Toxicity regression equation	相关系数 R²	EC₅₀/ (mg·mL⁻¹)
青蒿 A.carvifolia	2	y= 1.11x + 1.31	0.946	0.063
	3	y = 1.27x +1.32	0.986	0.089
	4	y = 1.29x +1.28	0.997	0.100
	5	y = 1.30x + 1.22	0.995	0.113
天蓝鼠尾草 S.benth	2	y = 1.29x + 0.16	0.924	0.760
	3	y = 1.26x + 0.12	0.919	0.807
	4	y = 1.08x + 0.02	0.988	0.952
	5	y = 0.84x + 0.11	0.973	1.356

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2.5 两种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）菌丝形态的影响

通过光学显微镜观察发现，青蒿乙醇提取物处理过的易脆毛霉（M. fragilis）菌丝与对照组相比，原本直立光滑的菌丝变得弯曲、变粗且表面不光滑，多分叉（图8），而天蓝鼠尾草处理过的菌丝无明显变化；可能由于青蒿提取物中的活性成分影响了桑葚果腐病菌菌丝的生长，从而起到抑菌作用。

图 8 两种植物提取物对易脆毛霉菌丝形态的影响（10×40）

A：对照；B：青蒿；C：天蓝鼠尾草。

Figure 8. Effect of two plant extracts on M. fragilis mycelial morphology（10×40）

A: control; B: A. carvifolia; B: S. uliginosa.

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3. 讨论与结论

本研究通过组织分离法对桑葚果腐病病原菌进行分离、纯化，得到1株毛霉属（Mucor sp. ）真菌易脆毛霉（M. fragilis），采用传统真菌形态学及分子生物学分析方法判定该菌为桑葚果腐病的新致病菌，目前已在采后新疆甜樱桃腐烂^[22]、菜豆腐烂^[23]、草莓致腐^[24]上发现该致病菌。毛霉菌属广泛存在于自然界中，为腐生性真菌，具有较强的分解蛋白质能力，引起食物霉变，是一种条件致病性真菌，还会使采摘后的果蔬储藏期缩短，影响果蔬质量，造成腐烂，造成严重的危害^[25−26]。目前对其防治主要采用化学杀菌剂，容易引发药剂残留及病原菌的抗药性等问题。相比化学杀菌剂，植物提取物具有绿色环保环境兼容性好等优势。本研究通过生长速率法测定54种植物提取物的抑菌活性，发现青蒿和天蓝鼠尾草的乙醇提取物对易脆毛霉（M. fragilis）表现出较好的抑菌活性，为利用其开发植物源杀菌剂提供了依据。

青蒿提取物具有抑菌杀虫、抗疟疾、抗肿瘤等作用^[27]。宁睿等^[28]研究发现，青蒿水提物在质量浓度为0.1 g·mL⁻¹时对辣椒疫霉病菌（Phytophora capsici）、蘑菇湿泡病菌（Mycogone pemiciosa）抑制率达100%；霍焕燃^[29]研究发现青蒿挥发油在浓度为5 μL·mL⁻¹时对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄腐镰刀菌（F. solani）等4种镰刀菌的抑制率均在75%以上；本试验中，青蒿乙醇提取物在1 mg·mL⁻¹质量浓度下对易脆毛霉（M. fragili）的抑制率为77.72%，说明同种植物在不同溶剂、不同浓度对病原菌的抑制活性存在差异性，不同溶剂提取物的活性成分不同。天蓝鼠尾草（Salvia uliginosa Benth）是唇形科（Labiatae）鼠尾草属（Salvia）的多年生植物，鼠尾草属植物地上部分大多含精油，具有杀菌、抗氧化、抗突变、消炎等作用^[30]。王芳等^[31]研究发现，墨西哥鼠尾草挥发油在质量浓度为24 mg·mL⁻¹时对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制率为72.97%；Císarová等^[32]研究发现鼠尾草精油可以有效抑制黑曲霉（Aspergillus niger）和塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）的生长；鼠尾草属不同种植物对病原真菌均表现出不同的抑制效果。本研究发现青蒿和墨西哥鼠尾草提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的显著抑菌活性进一步丰富了该植物的抗菌谱，鉴于其良好的抑菌活性各提取物中具体抗菌活性成分值得深入研究。青蒿是常见中药材，天蓝鼠尾草是广泛种植的观赏植物，二者均对人畜无害、对环境友好。本研究为利用青蒿和天蓝鼠尾草开发新型植物源杀菌剂提供了抑菌，为桑葚果腐病的绿色防控奠定了基础。

图 1 病害症状及菌落形态特征

A：桑葚果腐病症状；B：FM-01菌落正面；C：FM-01菌落背面。

Figure 1. Disease symptoms and colony morphology

A: Symptoms of mulberry rot disease; B: front view of FM-01 colony; C：back view of FM-01 colony.

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图 2 菌株在40倍光学显微镜下的特征（10×40）

A：菌丝；B：单轴分枝；C：孢子囊；D：孢囊梗；E：孢囊孢子；F：接合孢子。

Figure 2. Microscopic image of fungus (10×40)

A: Hypha; B: monopodial branching; C: sporangia; D: sporangiophore; E: sporangiospore; F: zygospore.

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图 3 基于ITS基因序列构建的系统发育树

Figure 3. Phylogenetic tree based on IST sequences

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图 4 回接验证结果

A：接种易脆毛霉菌株；B：对照。

Figure 4. Reverse validation of disease-causing pathogen

A: Inoculated with M. fragilis; B: control.

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图 5 青蒿和天蓝鼠尾草提取物对易脆毛霉的抑制效果

A：青蒿；B：天蓝鼠尾草。

Figure 5. Antifungal activities on M. fragilis of A. carvifolia and S. uliginosa extracts

A: A. carvifolia; B: S. uliginosa.

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图 6 不同质量浓度青蒿乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌效果

Figure 6. Antifungal activities on M. fragilis of A. carvifolia ethanol extract in different concentrations

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图 7 不同质量浓度天蓝鼠尾草乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌效果

Figure 7. Antifungal activities on M. fragilis of S. uliginosa ethanol extract in different concentrations

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图 8 两种植物提取物对易脆毛霉菌丝形态的影响（10×40）

A：对照；B：青蒿；C：天蓝鼠尾草。

Figure 8. Effect of two plant extracts on M. fragilis mycelial morphology（10×40）

A: control; B: A. carvifolia; B: S. uliginosa.

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表 1 供试植物名录

Table 1 List of tested plants

序号 Number	植物名称 Plants	科 Family	提取部位 Plant parts	采集地点 Location
1	牛尾蒿 Artemisia dubia	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
2	千里光 Senecio scandens	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
3	鱼眼草 Dichrocephala integrifolia	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
4	黑蒿 A. palustris	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
5	茵陈蒿 A. capillaris	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
6	小花鬼针草 Bidens parviflora	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
7	全叶马兰 Aster pekinensis	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
8	革命菜 Crassocephalum crepidioides	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
9	藿香蓟 Ageratum conyzoides	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
10	银胶菊 Parthenium hysterophorus	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
11	香丝草 Erigeron bonariensis	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
12	金腰箭 Synedrella nodiflora	菊科 Asteraceae	全草	广西宾阳
13	翼齿六棱菊 Laggera pterodonta	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
14	野蒿茼 Crassocephalum crepidioides	菊科 Asteraceae	全草	云南昆明
15	微甘菊 Mikania micrantha	菊科 Asteraceae	地上部分	云南德宏
16	青蒿 A. caruifolia	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
17	天名精 Carpesium abrotanoides	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
18	紫茎泽兰 Ageratina adenophora	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
19	香青 Anaphalis sinica	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
20	土木香 Inula helenium	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
21	小鱼眼草 Dichrocephala benthamii	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
22	假臭草 Praxelis clematidea	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
23	火绒草 Leontopodium leontopodioides	菊科 Asteraceae	地上部分	辽宁朝阳
24	尼泊尔香青 Anaphalis nepalensis	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
25	钻叶紫菀 Symphyotrichum subulatum	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
26	芳香堆心菊 Helenium aromaticum	菊科 Asteraceae	地上部分	云南昆明
27	水棘针 Amethystea caerulea	唇形科 Lamiaceae	全草	辽宁朝阳
28	益母草 Leonurus japonicus	唇形科 Lamiaceae	全草	云南昆明
29	墨西哥鼠尾草 Salvia leucantha	唇形科 Lamiaceae	地上部分	云南昆明
30	香茶菜 Isodon amethystoides	唇形科 Lamiaceae	地上部分	云南昆明
31	天蓝鼠尾草 Salvia uliginosa	唇形科 Lamiaceae	地上部分	云南昆明
32	山薄荷 Dracocephalum moldavica	唇形科 Lamiaceae	全草	辽宁朝阳
33	马鞭草 Verbena officinalis	马鞭草科 Verbenaceae	全草	云南昆明
34	牛筋果 Harrisonia perforata	芸香科 Rutaceae	地上部分	云南昆明
35	臭椿 Ailanthus altissima	苦木科 Simaroubaceae	枝叶	辽宁朝阳
36	拔毒散 Sida szechuensis	锦葵科 Malvaceae	地上部分	云南昆明
37	土牛膝 Achyranthes aspera	苋科 Amaranthaceae	全草	云南昆明
38	土荆芥 Dysphania ambrosioides	苋科 Amaranthaceae	全草	云南昆明
39	粉花月见草 Oenothera rosea	柳叶菜科 Onagraceae	地上部分	云南昆明
40	黄花酢浆草 Oxalis pes-caprae	酢浆草科 Oxalidaceae	全草	云南昆明
41	荨麻 Urtica fissa	荨麻科 Urtiaceae	全草	云南昆明
42	女萎 Clematis apiifolia	毛茛科 Ranunculaceae	地上部分	云南昆明
43	老鹳草 Geranium wilfordii	牻牛儿苗科 Geraniaceae	全草	云南昆明
44	络石 Trachelospermum jasminoides	夹竹桃科 Apocynaceae	枝、叶	云南昆明
45	线萼山梗菜 Lobelia melliana	桔梗科 Campanulaceae	地上部分	云南昆明
46	黄精 Polygonatum sibiricum	天门冬科 Asparagaceae	地上部分	辽宁朝阳
47	曼陀罗 Datura stramonium	茄科 Solanaceae	枝、叶	云南昆明
48	忍冬 Lonicera japonica	忍冬科 Caprifoliaceae	地上部分	云南昆明
49	马桑 Coriaria nepalensis	马桑科 Coriariaceae	枝、叶	云南昆明
50	毛蕊花 Verbascum thapsus	玄参科 Scrophulariaceae	地上部分	云南昆明
51	紫红獐芽菜 Swertia punicea	龙胆科 Gentianaceae	全草	云南昆明
52	罗汉松 Podocarpus macrophyllus	罗汉松科 Podocarpaceae	枝、叶	云南昆明
53	假酸浆 Nicandra physalodes	茄科 Solanaceae	地上部分	云南昆明
54	角蒿 Incarvillea sinensis	紫葳科 Bignoniaceae	地上部分	辽宁朝阳

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表 2 54种植物乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌活性筛选

Table 2 Antifungal activities on M. fragilis of 54 plant ethanol extracts

植物 Plants	抑菌率 Inhibition rate/%	植物 Plants	抑菌率 Inhibition rate/%
青蒿 A. caruifolia	77.72±0.01 a	天蓝鼠尾草 S.uliginosa	49.06±0.02 b
茵陈蒿 A.capillaris	44.80±0.02 c	香青 A. sinica	40.22±0.02 d
香茶菜 I. amethystoides	38.75±0.04 d	紫茎泽兰 A.adenophora	31.14±0.01 e
全叶马兰 A. pekinensis	31.14±0.01 e	假臭草 P. clematidea	27.38±0.02 f
天名精 C. abrotanoides	27.71±0.03 f	芳香堆心菊 H.aromaticum	25.95±0.02 f
鱼眼菊 D. benthamii	22.65±0.00 g	牛尾蒿 A. dubia	22.62±0.01 g
黑蒿 A. palustris	22.31±0.01 g	土木香 I. helenium	19.81±0.03 gh
藿香蓟 A.conyzoides	19.81±0.00 gh	微甘菊 M. micrantha	18.86±0.02 he
尼泊尔香青 A. nepalensis	17.88±0.02 hei	牛筋果 H. perforata	16.03±0.02 eij
益母草 L. japonicus	15.24±0.02 ijk	假酸浆 N. physaloides	13.85±0.01 jkl
臭椿 A. altissima	13.33±0.02 jkl	小花鬼针草 B. parviflora	12.49±0.01 klm
罗汉松 P. macrophyllus	12.25±0.01 lm	女萎 C. apiifolia	11.57±0.04 lm
紫红獐牙菜 S. punicea	11.32±0.00 lm	香丝草 E.bonariensis	10.89±0.03 lmn
土牛膝 A. aspera	10.21±0.01 mn	山薄荷 D. moldavica	9.70±0.05 mn
火绒草 L. leontopodioides	8.25±0.03 no	土荆芥 C. ambrosioides	6.67±0.02 op
黄精 P. sibiricum	6.61±0.02 op	金腰箭 S. nodiflora	6.24±0.01 op
粉花月见草 O. rosea	5.80±0.02 op	络石 T. jasminoides	5.09±0.01 pq
银胶菊 P. hysterophorus	4.41±0.01 pqr	墨西哥鼠尾草 S. leucantha	3.78±0.02 qrs
黄花酢浆草 O. pes-caprae	3.61±0.02 qrs	水棘针 A. caerulea	2.66±0.03 rs
革命菜 C. crepidioides	1.78±0.02 rs	千里光 S. scandens	0.95±0.02 s
表中数据为 3 次重复的平均值，平均数±标准差，字母不同者表示差异达显著水平（ P＜0.05）。下同。 Data are presented as mean of 3 repeats±standard deviation; those with different alphabets indicate significant difference at P＜0.05. Same for below.

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表 3 天蓝鼠尾草、青蒿乙醇提取物对易脆毛霉的抑菌毒力

Table 3 Toxicity on M. fragilis of A. carvifolia and S. uliginosa ethanol extracts

植物 Plants	培养时间 Time/ d	毒力回归方程 Toxicity regression equation	相关系数 R²	EC₅₀/ (mg·mL⁻¹)
青蒿 A.carvifolia	2	y= 1.11x + 1.31	0.946	0.063
	3	y = 1.27x +1.32	0.986	0.089
	4	y = 1.29x +1.28	0.997	0.100
	5	y = 1.30x + 1.22	0.995	0.113
天蓝鼠尾草 S.benth	2	y = 1.29x + 0.16	0.924	0.760
	3	y = 1.26x + 0.12	0.919	0.807
	4	y = 1.08x + 0.02	0.988	0.952
	5	y = 0.84x + 0.11	0.973	1.356

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[32]	CÍSAROVÁ M, TANČINOVÁ D, MEDO J. Antifungal activity of lemon, Eucalyptus, thyme, oregano, sage and lavender essential oils against Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis isolated from grapes [J]. Potravinarstvo Slovak Journal of Food Sciences, 2016, 10(1): 83−88. DOI: 10.5219/554

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图(8) / 表(3)

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0. 引言
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料
1.1.2 供试药剂
1.2 试验方法
1.2.1 植物提取物的制备
1.2.2 病原菌的分离纯化
1.2.3 病原菌的形态学观察
1.2.4 病原菌分子生物学鉴定
1.2.5 病原菌致病性测定
1.2.6 抑菌活性测定
1.2.7 抑菌毒力EC50测定
1.2.8 植物提取物对病原菌菌丝形态的影响
2. 结果与分析
2.1 病害的症状及病原菌分离鉴定
2.2 病原菌的致病性测定
2.3 54种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌活性
2.4 高活性植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌毒力
2.5 两种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）菌丝形态的影响
3. 讨论与结论

0. 引言
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料
1.1.2 供试药剂
1.2 试验方法
1.2.1 植物提取物的制备
1.2.2 病原菌的分离纯化
1.2.3 病原菌的形态学观察
1.2.4 病原菌分子生物学鉴定
1.2.5 病原菌致病性测定
1.2.6 抑菌活性测定
1.2.7 抑菌毒力EC₅₀测定
1.2.8 植物提取物对病原菌菌丝形态的影响
2. 结果与分析
2.1 病害的症状及病原菌分离鉴定
2.2 病原菌的致病性测定
2.3 54种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌活性
2.4 高活性植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）的抑菌毒力
2.5 两种植物提取物对易脆毛霉（M. fragilis）菌丝形态的影响
3. 讨论与结论

参考文献(32)

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桑葚果腐病病原菌的分离鉴定及抑菌植物提取物筛选

作者简介: 李青（2000 — ），女，硕士研究生，主要从事有害生物综合防控研究，E-mail：Lq15912856989@163.com

通讯作者: 胡世俊（1977 — ），男，博士，副教授，主要从事入侵植物研究，E-mail：shijunhu@126.com 闫晓慧（1980 — ）女，博士，教授，主要从事植物源农药研究，E-mail：luckyyxh@163.com

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