OsPLGG1-enhanced Photorespiratory Bypass in Rice
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摘要:目的
在已构建GOC（乙醇酸氧化酶OsGLO、草酸氧化酶OsOXO和过氧化物酶OsCAT）光呼吸支路的工程水稻中，敲除乙醇酸转运体编码基因OsPLGG1a或OsPLGG1b，以优化光呼吸支路的改造，提高水稻光合效率。
方法以GOC工程水稻为背景材料，通过CRISPR-Cas9技术分别敲除OsPLGG1a或OsPLGG1b基因，通过抗性筛选和测序鉴定osplgg1a-GOC和osplgg1b-GOC纯合敲除株系，并测定光合速率。
结果获得敲除OsPLGG1a或OsPLGG1b的GOC代谢支路的纯合株系（osplgg1a-GOC和osplgg1b-GOC）。osplgg1a-GOC植株与ZH11背景中OsPLGG1a敲除突变体表型相似，均表现出黄化矮小生长抑制的表型；osplgg1b-GOC植株相比GOC水稻的净光合速率提高，说明OsPLGG1b突变有利于叶绿体中滞留乙醇酸，增加GOC支路的代谢通量，进一步提高叶绿体中的CO2浓度。
结论相对于GOC水稻，osplgg1b-GOC部分株系的净光合速率和气孔导度增加，暗示敲除OsPLGG1b可用于光呼吸代谢支路的优化。
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关键词:
- 乙醇酸/甘油酸转运体 /
- 水稻 /
- 光呼吸 /
- GOC 代谢支路
Abstract:ObjectiveBy deleting either OsPLGG1a or OsPLGG1b to optimize the pathway in the pre-engineered GOC rice for enhancing photosynthesis and photorespiration of the plant was postulated.
MethodThe knockout vectors osplgg1a-Cas9 or osplgg1b-Cas9 were constructed and transformed into the GOC rice to obtain transgenic homozygous lines with OsPLGG1a or OsPLGG1b deleted. Resulting photosynthesis and photorespiration of the rice plant were measured to determine the validity of the proposed hypothesis.
ResultThe transgenic homozygous lines were successfully obtained to show a similar phenotype of osplgg1a-GOC and osplgg1a plants with stunted growth. The osplgg1b-GOC plants displayed a net photosynthetic rate increase over that of GOC rice. That indicated the OsPLGG1b mutation to be conducive to the retention of chloroplast glycolate, rise of metabolic flux through GOC bypass, and reduction of plant photorespiration metabolism manifested with enriched CO2 in the chloroplasts.
ConclusionCompared with the GOC rice, the transgenic osplgg1b-GOC plants had an elevated net photosynthetic rate and stomatal conductance. It suggested that the deletion of OsPLGG1b could be a means to enhance the photorespiration metabolism in a rice plant.
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Keywords:
- glycolate/glycerate transporter /
- rice /
- photorespiration /
- GOC metabolic pathway
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马齿苋Portulaca oleracea L.为马齿苋科马齿苋属草本植物，又名长命菜、五行菜、猪母菜，广泛生长于全世界温带和热带地区，我国南北地区均有分布[1]。它既是一味药材，也是一种颇具特色的酸味野菜，列入我国卫生部颁布的药食两用植物名录。马齿苋主要含有机酸类、黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类、挥发油及多糖等化学成分，具有抗炎、抑菌、降血脂、降血糖、抗氧化、止咳平喘等作用，具有较高的开发利用价值[2-3]。
目前，关于马齿苋功能饮料的研发已有一些研究报道，按原料主要分为两类：一类为新鲜马齿苋制备的饮料[4-6]，其功效成分保存较好，但生味重，消费者喜好度较低；另一类为干燥马齿苋制备的饮料[7-9]，干马齿苋比鲜马齿苋易于贮运保存，便于饮料加工生产，且制得的饮料生味比鲜马齿苋汁略淡。然而不论是用鲜马齿苋还是干马齿苋制备的饮料，都存在着生味较重的问题。虽然，在加工过程中可以通过调节糖酸比减轻生味，但因考虑健康因素，糖的添加量受到一定限制；且在榨汁、浸提或烘干等加工过程中，马齿苋茎表皮红色素的降解，饮料褐变，最终饮料呈黄至棕褐色，影响色泽品质。根据文献推测，这可能与马齿苋中未被钝化的内源性生物酶有关[10-12]。
本研究以茎表皮为红色的新鲜野生马齿苋为原料，采用微波对干制前的马齿苋进行灭酶处理，确定马齿苋饮料护色的关键技术和参数，从而提升马齿苋饮料的色泽品质；再分别以抗氧化活性及感官评价为指标优化干马齿苋浸提和饮料调配工艺，探讨色泽和风味俱佳的低糖马齿苋功能性饮料的制备工艺和技术，为马齿苋开发利用及马齿苋功能性饮料的工业化生产提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
新鲜马齿苋，采摘自福建省农业科学院漳州试验田；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，美国sigma公司产品；95%乙醇、氢氧化钠等为国产分析纯；柠檬酸、甜菊糖甙、蔗糖等为国产食品级。
1.1.2 仪器与设备
FW135型粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司产品；WP700型微波炉，乐金电子(天津)电器有限公司产品；L5S型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；BS110S型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；HH-2型恒温水浴锅，金坛市新航仪器厂产品；GZX-9246MBE型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司产品；WZB35型数显折光仪，上海仪电物理光学仪器有限公司产品；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；PB-10型酸度计，赛多利斯有限公司产品。
1.2 试验方法
1.2.1 马齿苋饮料生产工艺流程
新鲜马齿苋→挑拣、清洗→切段→微波处理→烘干→粉碎→浸提→过滤→调配→灭菌→罐装→冷却→成品。
1.2.2 操作要点
(1) 切段：马齿苋挑拣清洗除去泥沙和残叶后，切成1 cm小段；(2)微波处理：将马齿苋小段均匀平铺于微波炉转盘中，微波处理完毕后立即打开微波炉取出马齿苋；(3)烘干、粉碎：60℃烘干至恒重，粉碎后过40目筛，得马齿苋干粉，装入自封袋保存于干燥器中备用；(4)浸提：马齿苋干粉按照一定比例加入过滤水进行水浴浸提；(5)调配：向制备好的马齿苋浸提液中用一定比例的柠檬酸、蔗糖、甜菊糖等进行调配；(6)灭菌、罐装：100℃保持5 min，降温至90℃后趁热装入无菌玻璃瓶并封盖。罐装后用冷水冷却瓶身即为成品。
1.2.3 微波处理最佳参数确定
将马齿苋小段均匀平铺后进行微波处理，设置马齿苋装载量10、30、50 g，微波时间2.0、2.5、3.0 min，微波功率140 W(小火)、420 W(中火)、700 W(大火)，处理后60℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，按料液比1:40(g·mL-1)于65℃水浴浸提2 h。以提取液的色泽为指标，确定最佳微波处理参数。
1.2.4 马齿苋浸提的单因素及正交试验
准确称量马齿苋粉末加水浸提，以DPPH自由基清除率为指标，设置料液比、浸提时间、浸提温度3个单因素进行考察，各因素水平分别设为：料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60(g·mL-1)，温度35、50、65、80、95℃，时间1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，并作L9(34)正交试验，确定最佳提取工艺。正交试验的因素和水平见表 1。
表 1 正交试验的因素水平Table 1. Orthogonal factor level table因素水平 料液比/(g·mL-1) 温度/℃ 时间/h 1 1:40 50 2.0 2 1:50 65 2.5 3 1:60 80 3.0 1.2.5 抗氧化活性测定
本试验DPPH自由基(DPPH·)清除率的测定参考Bolling BW等[13]的方法并稍作改动，DPPH·溶剂为95%乙醇，反应结束后5 000 r·min-1离心10 min，取上清液测定。DPPH·清除率按以下公式计算。
清除率=[1−Ai−AjA0]×100% 式中：A0为样品空白吸光值；Ai为样品反应吸光值；Aj为样品本底值。
1.2.6 马齿苋饮料感官评价的测定
选3个因素(柠檬酸、蔗糖和甜菊糖)的添加量对马齿苋饮料调配进行研究，根据预实验结果，设柠檬酸添加量0.5、1.0、1.5 g·kg-1，蔗糖添加量20、30、40 g·kg-1，甜菊糖添加量0.1、0.2、0.3 g·kg-1，采用L9(34)正交试验组合，共9个处理进行比较。请12名品尝员采用九点喜好标度法(9-point Hedonic Scale)[14-15]对马齿苋饮料的总体喜好度进行感官评价，以文字和数字相结合的方式对每个处理进行打分，打分标准如表 2所示。
表 2 感官评价评分标准Table 2. Sensory evaluation criteria极不喜欢 非常不喜欢 不喜欢 略不喜欢 中等 略喜欢 喜欢 非常喜欢 极喜欢 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1.2.7 理化指标的测定
根据国家标准GB/T 12143-2008[16]，以手持糖度计测定饮料的可溶性固形物；根据国标GB/T12456-2008[17]，以pH电位法测定总酸。
1.2.8 微生物指标
根据国标GB4789.21-2003[18]对饮料的菌落总数、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行检测。
1.3 数据处理
每组试验重复3次测定。采用Microsoft Word 2007和DPS 8.0对数据进行处理分析，以Origin 8.5进行作图。
2. 结果与分析
2.1 微波处理对马齿苋饮料感官品质的影响
2.1.1 装载量对马齿苋饮料色泽的影响
固定微波功率420 W、微波时间2.0 min，研究不同装载量对马齿苋饮料色泽的影响，结果如表 3所示。
表 3 装载量对马齿苋饮料色泽的影响Table 3. Effect of Load capacity on the color of purslane beverage装载量/g 10 30 50 色泽 黄棕色 橘红色 红棕色 有研究显示[19]，水分含量低会使过氧化物酶耐热性增加，不利于过氧化物酶的钝化。当装载量为10 g时，马齿苋中的水分迅速大量蒸发，含水量降低，不利于酶的钝化，因此褐变程度加重，同时红色素被破坏，提取液中红色不明显；当装载量为50 g时，灭酶不够彻底，马齿苋浸提液仍有褐变，棕色素掩盖了红色素的颜色，浸提液色泽不够明亮；当装载量为30 g时，马齿苋饮料的褐变程度最小，色泽最明亮。
2.1.2 微波功率对马齿苋饮料色泽的影响
固定单次装载量30 g、微波时间2.0 min，研究微波功率对马齿苋饮料色泽的影响，结果如表 4所示。
表 4 微波功率对马齿苋饮料色泽的影响Table 4. Effect of microwave power on the color of purslane beverage微波功率/W 140 420 700 色泽 棕色 橘红色 红色 微波灭酶的效果与微波功率的强度密切相关[20]。随着微波功率增大，马齿苋饮料的褐变程度逐渐降低，棕色减弱，同时红色素保留率升高，因此宜选择微波功率700 W进行处理。
2.1.3 微波时间对马齿苋饮料色泽的影响
固定单次装载量30 g、微波功率700 W，研究微波时间对马齿苋饮料色泽的影响，结果如表 5所示。
表 5 微波时间对马齿苋饮料色泽的影响Table 5. Effect of microwave time on the color of purslane beverage微波时间/min 2.0 2.5 3.0 色泽 红棕色 红色 红色 随着微波时间延长，马齿苋饮料的褐变程度逐渐降低，色泽逐渐明亮，与Wang J等[20]的研究结果一致。微波处理也使得马齿苋水分含量降低，当微波时间3.0 min时，微波炉中的马齿苋出现小火花，因此宜选择2.5 min。
2.1.4 微波处理对马齿苋饮料感官品质的影响
按照微波处理最佳工艺：微波时间2.5 min、微波功率700 W、单次装载量30 g，对马齿苋进行处理，与无微波处理的空白对照进行比较，结果如表 6所示。
表 6 微波处理对马齿苋饮料感官品质的影响Table 6. Effect of microwave treatment on sensory quality of purslane beverage处理 色泽 气味 口感 微波 澄清，红色 有茶香，有生味 较酸，略有涩味 空白 澄清，黄棕色 茶香较淡，生味较重 微酸，略有涩味 经微波处理后的马齿苋浸提液，较好地抑制了褐变，同时保持了马齿苋中红色素的颜色，不仅提高了马齿苋饮料的色泽品质，同时大大减轻了马齿苋的生味，改善了风味。本试验结果表明，马齿苋干制前的微波处理是马齿苋饮料护色的关键技术。此外，微波处理后的马齿苋浸提液口感略酸于空白处理，是因为马齿苋中富含有机酸, 包括丁二酸、苹果酸、柠檬酸等[21]，微波处理破坏了马齿苋细胞组织，从而提高了浸提效率，使相同浸提条件下浸提液中的有机酸含量高于空白处理。
2.2 马齿苋浸提工艺单因素及正交试验结果
2.2.1 浸提温度对浸提液抗氧化活性的影响
在固定料液比1:40(g·mL-1)、浸提时间2.0 h条件下，研究浸提温度对马齿苋浸提液抗氧化活性的影响，结果如图 1所示。在一定温度范围内，随着浸提温度的升高，马齿苋浸提液的抗氧化活性随之增高，至65℃时抗氧化活性最高；而后，随着温度升高，浸提液的抗氧化活性下降。一般情况下，温度升高可提高浸提效率，使得浸提液中的抗氧化活性成分增加。从本试验结果可见，马齿苋部分抗氧化活性物质对温度较敏感。
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图 1 浸提温度对马齿苋浸提液抗氧化活性的影响Figure 1. Effect of temperature on antioxidant activity of purslane extract2.2.2 浸提时间对浸提液抗氧化活性的影响
在固定料液比1:40(g·mL-1)、浸提温度65℃条件下，研究浸提时间对马齿苋浸提液抗氧化活性的影响，结果如图 2所示。浸提时间2.0 h内，马齿苋浸提液的抗氧化活性没有明显变化；在2.5 h时，浸提液的抗氧化活性最高，而后随着时间延长，抗氧化活性下降。
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图 2 浸提时间对马齿苋浸提液抗氧化活性的影响Figure 2. Effect of time on antioxidant activity of purslane extract2.2.3 料液比对浸提液抗氧化活性的影响
在固定浸提温度65℃、浸提时间2.5 h条件下，研究料液比对马齿苋浸提液抗氧化活性的影响，结果如图 3所示。马齿苋细胞内外渗透压差会影响细胞内抗氧化物质的溶出。当料液比的稀释倍数小于1:50(g·mL-1)时，随着稀释倍数的增加，马齿苋浸提液的抗氧化活性显著提高；当稀释倍数大于1:50(g·mL-1)时，浸提液的抗氧化活性降低。
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图 3 料液比对马齿苋浸提液抗氧化活性的影响Figure 3. Effect of solid-liquid ratio on antioxidant activity of purslane extract2.2.4 正交试验结果
由正交试验结果(表 7、8)可知，最优因素水平组合为A2B3C3，即料液比1:50(g·mL-1)、浸提温度80℃、浸提时间3.0 h，经验证实验获得：马齿苋浸提液DPPH自由基清除率为26.11%。3个因素对红凤菜花色苷提取率的影响顺序依次是温度＞料液比>时间，其中温度(P=0.0438 < P0.05)和料液比(P=0.0457 < P0.05)为显著影响因子。
表 7 马齿苋抗氧化成分提取正交试验结果Table 7. Results of orthogonal test of extraction of antioxidant components from purslane试验号 A料液比/(g·mL-1) B温度/℃ C时间/h D空列 DPPH·清除率/% 1 1 1 1 1 18.58 2 1 2 2 2 24.01 3 1 3 3 3 26.06 4 2 1 2 3 19.61 5 2 2 3 1 24.64 6 2 3 1 2 26.06 7 3 1 3 2 16.20 8 3 2 1 3 16.60 9 3 3 2 1 20.89 k1 22.883 18.130 20.413 21.370 k2 23.437 21.750 21.503 22.090 k3 17.897 24.337 22.300 20.757 极差 5.510 6.207 1.887 1.333 表 8 方差分析结果Table 8. Analysis of variance变异来源 平方和 自由度 均方 F P A料液比 55.8646 2 27.9323 20.9046 0.0457* B温度 58.3180 2 29.1590 21.8227 0.0438* C时间 5.3823 2 2.6911 2.0141 0.3318 D空列 2.6724 2 1.3362 误差 2.6724 2 1.3362 2.3 马齿苋饮料调配试验结果
通过调配大大减轻了马齿苋浸提液的生味，不同配方的马齿苋饮料感官评价结果如表 9所示。根据评分结果，以5号得分最高，该配方为柠檬酸1.0 g·kg-1、蔗糖30 g·kg-1、甜菊糖0.3 g·kg-1，调配后的饮料具有烘干马齿苋的香气，入口酸甜适中有回甘，风味饱满有层次感，喜好度较高，得分最高，为7.00分。品评员表示，马齿苋饮料的气味较特别，对果香饮料的习惯性喜好限制了其对该植物饮料的喜爱度，但作为一款低糖健康的功能性饮料，若投放市场会考虑购买。
表 9 马齿苋饮料配方感官评价结果Table 9. Sensory evaluation results of purslane beverage formula试验号 柠檬酸/(g·kg-1) 蔗糖/(g·kg-1) 甜菊糖/(g·kg-1) 平均得分 1 0.5 20 0.1 4.50 2 0.5 30 0.2 5.75 3 0.5 40 0.3 5.50 4 1.0 20 0.2 5.75 5 1.0 30 0.3 7.00 6 1.0 40 0.1 5.00 7 1.5 20 0.3 5.00 8 1.5 30 0.1 5.50 9 1.5 40 0.2 6.00 3. 成品质量检测
3.1 感官指标
调配的马齿苋饮料具有干燥马齿苋的茶香及清香；呈红色，澄清均匀透明，味酸甜适口有回甘。
3.2 理化指标
可溶性固形物3.6°Brix，总酸0.14 g·kg-1。
3.3 微生物指标
菌落总数＜100 CFU·mL-1，大肠杆菌＜10 CFU·mL-1，金黄色葡萄球菌＜100 CFU·mL-1，沙门氏菌未检出。符合GB 7101-2015[22]的要求。
4. 讨论与结论
在本研究中，微波处理的主要目的是钝化马齿苋的多酚氧化酶和过氧化氢酶等生物酶，从而抑制马齿苋饮料加工中的酶促褐变和红色素降解。经微波处理的马齿苋红色素保存率高，褐变程度低，浸提液呈酒红色，而未经微波处理的马齿苋其浸提液则为棕黄色。因此推论，酶反应是导致马齿苋饮料褐变、红色素破坏的主要原因，而微波处理是马齿苋饮料护色的关键技术。此外还发现，经微波处理的马齿苋生味更淡，浸提效率也更高。
微波处理是常用的钝化酶的方法，比热水烫漂更适合蔬菜灭酶，在对辣椒的研究中发现，经微波处理的辣椒红色素和抗坏血酸保留率更高，总抗氧化活性和DPPH自由基清除活性更强[20]。微波对酶的钝化基于其热效应和非热效应。微波的热效应使酶分子迅速升温，同时微波也使酶分子结构中的氢键松弛、断裂，从而与底物的结合力下降，最终导致酶活力下降[23]。此外，在Redondo D等[24]的研究中还发现，微波处理中产生的美拉德反应产物，可能对PPO酶产生了不可逆的抑制作用。
马齿苋水提液中具有抗氧化活性的物质包括多糖、酚类物质、黄酮类物质、抗坏血酸等[25-26]，水提液的抗氧化活性并不总是与特定某种成分的浓度正相关，且不同组分之间可能存在协同抗氧化或拮抗作用[27]。因此，在马齿苋浸提工艺的研究中，浸提液的抗氧化活性比抗氧化成分的提取量更合适作为指标。研究表明，马齿苋提取物能够增强人体抗氧化能力和免疫机制，有利于Ⅱ型糖尿病病人维持体内抗氧化机制的平衡[28-29]。与添加蔗糖或果汁相比，以甜菊糖调配的低糖饮料更适合糖尿病人饮用。
本研究探讨了低糖马齿苋抗氧化饮料的研制，明确了马齿苋饮料护色的关键技术，即采用微波处理进行灭酶，工艺参数为装载量30 g、时间2.5 min、功率700 W；以正交试验得到抗氧化成分提取最优工艺条件，即料液比1:50(g·mL-1)、浸提时间2.5 h、浸提温度80℃；最后以1.0 g·kg-1柠檬酸、30 g·kg-1蔗糖和0.3 g·kg-1甜菊糖进行调配，得到风味独特、色泽诱人、具有保健功能的植物饮料。
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图 1 osplgg1-Cas9-GOC的编辑位点
核苷酸划线“（delete X bp）”代表删除X核苷酸；“……”表示与野生型相同的部分序列。靶点设置在“CCN”或“NGG”（PAM）。黑色数字表示编码区中ATG的核苷酸位置。
Figure 1. Editing site on osplgg1-Cas9-GOC
Underscored nucleotide with "(delete-X bp)" indicates removal of X nucleotides;"......" indicates part of sequence identical to that of wild-type. Target was set at "CCN or NGG" (PAM). Number in black indicates nucleotide position of ATG in ORF.
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图 2 osplgg1a-GOC和osplgg1b-GOC植株的幼苗期表型
A、C：osplgg1a-GOC和osplgg1b-GOC表型；B、D：osplgg1a-GOC和osplgg1b-GOC株高；E：叶片灌浆期表型；F：叶绿素含量。A和C为osplgg1a-GOC和osplgg1b-GOC在空气环境条件下培养5周后的表型，在含有木村B营养液的培养箱内生长。根据Duncan法进行样本间差异显著性分析，不同小写字母表示不同植株之间差异显著（P ＜ 0.05）。图3、4同。
Figure 2. Phenotypes of osplgg1a-GOC and osplgg1b-GOC mutant seedlings
A and C: phenotypes of osplgg1a-GOC and osplgg1b-GOC plants, respectively, grown under ambient conditions for 5 weeks; B and D: plant height of osplgg1a-GOC and osplgg1b-GOC plants, respectively; E: phenotype; F: chlorophyll content. Means denoted by same letter are not significantly different at P＜0.05 according to Duncan’s multiple range tests. Same for Figs. 3 and 4.
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图 3 osplgg1b-GOC转基因植株的表型分析
A：osplgg1b-GOC转基因植株在灌浆期植株表型观察与完熟期穗形态观察；B：株高、分蘖数、剑叶长形态指标分析；C：结实率；D：穗粒数； E：穗长，n=30。
Figure 3. Phenotype of osplgg1b-GOC transgenic plant
A: phenotypic and panicle morphologic images of osplgg1b-GOC transgenic plants at grain filling stage; B: morphological indexes on plant height, tiller number, and length of flag leaf; C: seed setting rate; D: grain count per panicle; E: panicle length, n=30.
表 1 引物信息
Table 1 Primers applied
引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence （5′-3′）目的
PurposeCas9-F GAACGGTCGTAAGAGGATGC 无标记检测
Unmarked detectionCas9-R GGTGATGGACTGGTGGATGAG OsPLGG1a-pYLsgRNA-OsU6a-F1 CGTAGCGAGGCAATCATGCGTTTTAGAGCTAGAAAT 载体构建
Carrier constructionOsPLGG1a-pYLsgRNA-OsU6a-R1 GCATGATTGCCTCGCTACGCGGCAGCCAAGCCAGCA OsPLGG1a-pYLsgRNA-OsU6b-F2 TGCGACAAAGACAGCACCCCGTTTTAGAGCTAGAAAT OsPLGG1a-pYLsgRNA-OsU6b-R2 GGGGTGCTGTCTTTGTCGCACAACACAAGCGGCAGC OsPLGG1b-pYLsgRNA-OsU6a-F1 AGCCATGGGGACGGAATGCTGTTTTAGAGCTAGAAAT OsPLGG1b-pYLsgRNA-OsU6a-R1 AGCATTCCGTCCCCATGGCTCGGCAGCCAAGCCAGCA OsPLGG1b-pYLsgRNA-OsU6b-F2 CCCAGGCCCAGAATTCAAGGTTTTAGAGCTAGAAAT OsPLGG1b-pYLsgRNA-OsU6b-R2 CTTGAATTCTGGGCCTGGGCAACACAACGGCAGC M1：OsPLGG1a-Cas9-85F TCATCCACTGTCACTGCCACTG CRISPR/Cas9 突变位点检测
Detection of CRISPR/Cas9
mutation sitesM2：OsPLGG1a-Cas9-2187R GCACTACCTTTCTCTGCTTGA M3：OsPLGG1b-Cas9-2F TGGAACAGTGACGGCAGTTG M4：OsPLGG1b-Cas9-1795R GAGGTAATCACCTGGACAACC 
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