Anti-infection Effects of Modified Yupingfeng Decoction on Dehua Black Chicken Infected with Eimeria Tenella
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摘要:目的 探明玉屏风加减煎剂对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）感染德化黑鸡抗氧化、抗炎、免疫功能的影响及抗球虫效果。方法 将120只45日龄德化黑鸡随机分为6组，分别是空白对照组（K组）、感染对照组（G组）、常山青蒿低剂量组（CQL组）、玉屏风加减低剂量组（YL组）、常山青蒿高剂量组（CQH组）、玉屏风加减高剂量组（YH组），除空白对照组外，其余各组均感染柔嫩艾美耳球虫，24 h后开始连续7 d饮水给药，第8 d测定比较各组抗球虫指数、免疫功能、抗氧化能力等指标的差异。结果 与感染对照组（G组）相比，中药处理组CQH、YH、CQL、YL的血便、盲肠病变症状依次减轻。除CQH组外，其他组盲肠病变计分、盲肠黏膜下淋巴细胞密度显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；除CQH组OPG显著下降（P＜0.05）外，其他3个中药组OPG下降极显著（P＜0.01）；YL组和YH组盲肠上皮细胞脱落计分极显著降低（P＜0.01）。与CQL、CQH组相比，YL、YH组MDA、盲肠病变计分、盲肠上皮细胞脱落计分和OPG下降极显著（P＜0.01）。与G组相比，4个中药组 IL-6、 IFN-γ、TNF-α、丙二醛（MDA）含量极显著降低（P＜0.01），而 IL-2含量、 SIgA水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、 超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、总抗氧化能力（T-AOC）极显著升高（P＜0.01）；YL组IL-2含量、 SIgA水平、GSH-Px活性、SOD活性、CAT活性极显著增高（P＜0.01），YH组GSH-Px、 SOD活性极显著升高（P＜0.01）。与K组相比，G组、CQL组、YL组、CQH组、YH组的相对增重率分别是79.88%、103.49%、107.27%、95.05%、96.06%，抗球虫指数（anti-coccidial index, ACI）分别是96、165.5、177、133.5、162.5。结论 玉屏风加减煎剂对人工感染柔嫩艾美耳球虫德化黑鸡具有更好抗炎、抗氧化、提高免疫功能的免疫调节作用，并相应具有更好的抗球虫效果，且以玉屏风加减低剂量组（YL）抗球虫效果最好。Abstract:Objective To study the effects of modified Yupingfeng decoction on antioxidant, anti-inflammatory and immune function and anti-coccidial effect of Dehua black chickens infected with Eimeria tenella.Methods The treated 120 45-day-old Dehua black chickens were randomly divided into 6 groups, namely, blank control group (K group), infected control group (G group), low-dose group of Radix dichroa and Artemisia annua (CQL group), low-dose group of modified Yupingfeng decoction (YL group), high-dose group of Radix dichroa and Artemisia annua (CQH group), and high-dose group of modified Yupingfeng decoction (YH group). Except for the K group, all other groups were infected with Eimeria tenella. Treatment with the respective decoctions began 24 hours after infection and continued for 7 days. On the 8th day, various indices including anti-coccidial index, immune function, and antioxidant capacity were measured.Results Compared with the infection control group (G group), the symptoms of bloody stool and cecal lesions were alleviated in the CQH, YH, CQL, and YL groups in order. Except for the CQH group, the cecal lesion scores and submucosal lymphocyte density in the cecum were significantly or extremely significantly reduced (P＜0.05 or P＜0.01); oocyst per gram (OPG) was deduced extremely in the other three traditional Chinese medicine groups (P＜0.01), while OPG in CQH group was reduced significantly (P＜0.05); the cecuml epithelial cell shedding score was decreased extremely in YL group and YH group(P＜0.01). Compared with the CQL and CQH groups, the YL and YH groups showed extremely significant reductions in MDA, cecal lesion scores, epithelial cell shedding scores, and OPG levels (P＜0.01). Compared with G group, the contents of IL-6, IFN-γ, TNF-α and malondialdehyde (MDA) in the four Chinese medicine groups were significantly decreased (P＜0.01). In contrast, IL-2 content, SIgA level, and the activity of glutathione peroxides (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), Catalase (CAT) and total antioxidant capacity (T-AOC) were significantly increased (P＜0.01). IL-2 content, SIgA level, and the activity of GSH-Px, SOD, and CAT were significantly increased in the YL group (P＜0.01), and GSH-Px and SOD activities were significantly increased in the YH group (P＜0.01). Compared with K group, the relative weight gain rate of the G group, CQL group, YL group, CQH group, and YH group were 79.88%, 103.49%, 107.27%, 95.05%, and 96.06%, and the ACI were 96, 165.5, 177, 133.5, and 162.5, respectively.Conclusion The modified Yupingfeng decoction has better immunomodulation effect of improving anti-inflammatory, antioxidant and immune function on Dehua black chickens infected with Eimeria tenella, and correspondingly has better anti-coccidia effect, while the Yupingfeng modified low-dose group (YL) has the best anticoccidia effect.
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0. 引言
【研究意义】家禽养殖业中，鸡球虫病危害大，造成的经济损失严重。据统计，全球家禽业每年因球虫病造成的经济损失达30亿美元[1]。鸡球虫病是由艾美球虫属（Eimeria）寄生虫引起的一类原虫病，公认的有７种，其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是致病性最强的一种[1]，由于疫苗预防存在一定的安全隐患，且成本较高，所以药物防治仍是主要的防治手段[2]。然而，我国各地区柔嫩艾美耳球虫、混种艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫对大部分常用药物的抗药性越来越强，尤其是华东和华南地区[3]。中草药或复方中药在抵抗球虫感染、增强免疫力、缓解临床症状等方面具有独特的优势，且中草药具有廉价易得、毒性较低、抗虫谱广、不易产生耐药性等优点，在防治球虫方面有较好的应用前景[4]。德化黑鸡现存栏约100万只，对球虫敏感，如果没有用药，基本都会感染球虫，并且德化黑鸡50日龄之前常需要保温而采取集中平养，因此50日龄之前更容易发生球虫病。【前人研究进展】中草药具有杀虫抑虫、增强免疫力、抗菌消炎等方面作用[4]。目前，单味中药的研究主要集中在常山（Radix dichroa）[5−7]、青蒿（Artemisia annua）[8]、葡萄原花青素（Grape Procyanidins）[9]、白术（Atractylodis macrocephalae Koidz.）[10]、酵母细胞壁多糖（yeast cell wall polysaccharides）[11]、油樟叶精油（essential oil from cinnamomum longepaniculatum leaf）[12]、苦参（Sophora flavescens）、白头翁（ Pulsatilla chinensis）和姜黄（Curcuma longa L.）等[4]，研究最多的是常山和青蒿。有关复方中草药制剂抗球虫的研究近年来更是备受青睐，如中药联合复合益生菌[13]、苦参九煎散[14]、常山和黄芪多糖组方、青蒿常山组方、白头翁苦参散、五草汤等[4]。【本研究切入点】玉屏风是扶正固表的经典中药方剂，本课题组前期研究表明，玉屏风煎剂对德化黑鸡[15]具有提高免疫功能、增强抗氧化能力、抗炎等作用[16]。目前未见针对玉屏风煎剂对德化黑鸡抗球虫感染效果的相关研究。【拟解决的关键问题】本研究通过检测抗球虫指数（ACI）、免疫功能、抗氧化能力等指标，研究玉屏风加减（玉屏风方剂保留黄芪和白术，防风替换成常山和青蒿）煎剂对人工感染柔嫩艾美耳球虫德化黑鸡的影响，为利用复方中药防治鸡球虫病提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 中药方剂
本试验保留玉屏风方剂（黄芪、白术、防风质量比2∶2∶1）中的黄芪、白术，把防风替换为常山、青蒿，各味中药均购于福建同春药业股份有限公司，黄芪、白术按质量比1∶1混合制成煎制（煎剂1），常山、青蒿按质量比2∶1混合制成煎制（煎剂2），煎制方法为冷水浸泡30 min，煮沸后文火慢煎30 min，煎制3遍，合并，浓缩成含生药1 g·mL−1，备用。
1.2 试验动物的饲养管理及柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊
随机选取120只30日龄体重相近、健康、粪便检测无球虫感染的德化黑鸡，在无球虫的环境和饲料中不添加任何抗生素和抗球虫药物的情况下，按《德化黑鸡饲养管理》标准继续饲养至15日龄用于试验。柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊由福建农林大学殷光文教授惠赠。
1.3 动物分组与处理
45日龄的德化黑鸡随机分为6组，每组20只鸡（公母各半），分别为空白对照组（K）、感染对照组（G）、常山青蒿低剂量组（CQL）、玉屏风加减低剂量组（YL）、常山青蒿高剂量组（CQH）、玉屏风加减高剂量组（YH）。除空白对照组外，其余各组鸡只经口灌服1×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊悬液，攻虫24 h后开始按中药与水体积比1∶20早晚饮水给药，连续7 d（46～52日龄）。中药剂量在前期研究基础上确定[16]，试验各组处理方法见表1。每天观察鸡的精神、食欲、饮水、粪便情况，如有死亡，及时剖检。
表 1 试验鸡分组与处理Table 1. Grouping and treatment of the chicken组别 Group 动物数 Total number/只 处理 Treatment 空白对照组 K 20 不攻虫不给药 感染对照组 G 20 攻虫不给药 常山青蒿低剂量组 CQL 20 攻虫给药；煎剂2剂量2.5 mL·天−1·只−1 玉屏风加减低剂量组 YL 20 攻虫给药；煎剂1剂量2 mL·天−1·只−1+煎剂2剂量2.5 mL·天−1·只−1 常山青蒿高剂量组 CQH 20 攻虫给药；煎剂2剂量5 mL·天−1·只−1 玉屏风加减高剂量组 YH 20 攻虫给药；煎剂1剂量2 mL·天−1·只−1+煎剂2剂量5 mL·天−1·只−1 1.4 样品采集
1.4.1 血样采集
试验第8天（53日龄），每个试验组随机选取8只鸡，翅静脉采血4～5 mL，放置至析出血清后，
3000 r·min−1 离心10 min，收集血清，分装于Eppendorf管中，−20 ℃保存，用于血清免疫指标、抗氧化指标检测。1.4.2 盲肠样品采集
试验第8天（53日龄），鸡采血后，处死，观察盲肠病变情况，收集盲肠内容物，用于检查盲肠卵囊数；取盲肠，4%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，镜检观察盲肠形态结构；另取一段盲肠（2 cm左右）−20 ℃保存，用于检测肠道分泌型抗体SIgA。
1.5 测定项目及方法
1.5.1 盲肠形态观察及测量
使用Eclipse Ci-L拍照显微镜对盲肠组织切片进行200倍成像。照片用Image-Pro Plus 6.0软件统一以mm作为标准单位，分别测量每张切片中3个视野内淋巴细胞数量；并测量对应组织面积，计算出淋巴细胞密度（淋巴细胞数/组织面积）；盲肠上皮细胞脱落计分标准见表2。
表 2 盲肠上皮细胞脱落计分标准Table 2. Cecal epithelial cell shedding scoring criteria分值 Score 标准 Standard 0 黏膜层上皮完整、细胞形态正常，固有层肠腺数量丰富、分布均匀，淋巴细胞分布均匀；未见明显的炎性改变 1 黏膜层偶见上皮细胞坏死脱落，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失；固有层肠腺数量丰富、分布均匀，淋巴细胞分布均匀；未见明显的炎性改变。 2 黏膜层少见上皮细胞坏死脱落，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失；固有层肠腺数量丰富、分布均匀，淋巴细胞分布均匀；未见明显的炎性改变。 3 黏膜层多处上皮细胞缺失，固有层裸露；固有层淋巴细胞数量增多，肠腺间距较宽，排列稍不规则，淋巴数量轻度增多。 4 黏膜层大面积上皮细胞缺失，固有层裸露；固有层明显水肿，结缔组织排列疏松，肠腺间距增宽，排列稍不规则，淋巴细胞数量增多。 1.5.2 抗球虫指标检测
（1）相对增重率和存活率。分别于接种球虫前和53日龄称重（称重前禁食12 h，不禁水），计算各组试验鸡平均增重，统计相对增重率和存活率，相对增重率/%=（非空白对照组平均增重/空白对照组平均增重）×100，存活率/%=（各组鸡总数−各组死亡鸡总数）/各组鸡总数×100。
（2）每克粪便卵囊数（oocyst per gram, OPG）和卵囊值。参照GB∕T 18647—2020《动物球虫病诊断技术》[17]测定OPG；取盲肠内容物2 g，加入少量自来水搅匀，经60目尼龙网过滤后自来水冲洗滤网，反复冲洗过滤2～3次，收集滤液经
2500 r·min−1 离心10 min，弃上清液，沉淀加入一定量饱和食盐水搅匀，然后用麦氏计数板进行计数，并计算卵囊值。根据卵囊比判定卵囊值，卵囊比/%=（感染给药组卵囊数/感染不给药组卵囊数）×100；当卵囊比为0%～1%时，则卵囊值为0；卵囊比为1%～25%时，则卵囊值为5；卵囊比为26%～50%时，则卵囊值为10；卵囊比为51%～75%时，则卵囊值为20；卵囊比为76%～100%时，则卵囊值为40。（3）盲肠病变值。病变记分参照Johnson等[18]的病变记分方法，两侧盲肠病变不一致者以严重一侧为准（表3）。病变值=每组盲肠平均病变记分×10。
表 3 盲肠病变计分标准Table 3. Cecal lesions scoring criteria分值
Score标准
Standard0 无肉眼可见病变 1 盲肠肠壁存在少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常 2 盲肠病变病理变化较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚 3 盲肠内有多量血液或有肠芯，盲肠壁明显增厚，盲肠中粪便含量少甚至无粪便存在 4 盲肠内充满大量血液或肠芯，盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，或鸡死亡 （4）抗球虫指数（anti-coccidial index, ACI）。按美国Merck公司计算公式[19]，ACI=（相对增重率+存活率）−（病变值+卵囊值）。以ACI判定药效方法：ACI＞180为高效；160＜ACI＜180为良好；120＜ACI＜160为低效；ACI＜120为无效。
1.5.3 血清细胞因子及肠道SIgA测定
血清细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α及肠道SIgA含量的测定采用ELISA检测法，试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司，所用酶联免疫检测仪Infinite F50购自瑞士帝肯（Tecan），具体操作按试剂盒说明书进行。
1.5.4 抗氧化指标的测定[20]
硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde, MDA）浓度，比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxides, GSH-Px）活性， Fe3+ 还原法测定总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC），黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性，比色法测定过氧化氢酶（catalase, CAT）活性，检测仪器为V-
1200 型可见光分光光度计（上海美普达仪器有限公司），具体操作按试剂盒说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.6 数据处理
所得数据应用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析和LSR多重比较，数据值以“平均值±标准差”表示，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡临床症状的影响
结果显示，感染对照组（G）试验鸡攻虫后第5天开始出现临床症状，精神萎靡，食欲减退，排出血便，而CQH、YH、CQL、YL中药组试验鸡临床症状、血便依次减轻。空白健康对照组（K）试验鸡精神状态和饮食均正常。
2.2 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡盲肠病变的影响
盲肠剖检结果显示，感染对照组（G）试验鸡盲肠肿大，内容物中血液较多，盲肠壁增厚，有较多出血；而CQH、YH、CQL、YL中药组试验鸡盲肠肿大、内容物血液、盲肠壁增厚、出血依次减轻。空白健康对照组（K）试验鸡，盲肠无肿大、内容物无血液、盲肠壁无肉眼可见病变。
由表4及图1盲肠切片染色镜检可见：和K组相比，G组盲肠上皮细胞脱落计分、盲肠黏膜下淋巴细胞密度极显著升高（P＜0.01）。和G组相比，YL组和YH组盲肠上皮细胞脱落计分均极显著降低（P＜0.01）；除CQH组外，其他3个中药组盲肠黏膜下淋巴细胞密度显著下降（P＜0.05）。和相应的CQL、CQH组相比，相应的YL、YH组盲肠上皮细胞脱落计分极显著下降（P＜0.01）。以上结果可看出，除CQH组外，其他3个中药组都能降低球虫感染引起的盲肠上皮细胞脱落计分和盲肠黏膜下淋巴细胞密度升高，并且YL、YH组比相应的CQL、CQH组效果好，YL组效果最好。
表 4 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡盲肠病变指标的影响Table 4. Effect of modified Yupingfeng decoction on cecuml lesion scores of Dehua black chicken infected with coccidia组别
Group盲肠上皮细胞脱落情况计分
Epithelial cell shedding盲肠黏膜下淋巴细胞密度
Submucosal lymphocyte density/
(个·mm−²)空白对照组 K 0 Cc 611.90±107.60 Ab 感染对照组 G 3.50±0.46 Aa 1156.00 ±532.40 Aa常山青蒿低剂量组 CQL 2.75±1.17 Aa 772.40±275.00 Ab 玉屏风加减低剂量组 YL 1.00±0.93 Bb 674.40±85.87 Ab 常山青蒿高剂量组 CQH 3.25±0.71 Aa 916.20±169.20 Aa 玉屏风加减高剂量组 YH 1.25±1.28 Bb 708.00±177.30 Ab 同列数据后不同大、小写字母分别表示差异极显著（P＜0.01）或差异显著（P＜0.05）。下表同。
Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate extremely significant difference (P＜0.01) or significant difference (P＜0.05). Same for below.![]()
图 1 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡盲肠形态结构的影响（200×）Figure 1. Effect of modified Yupingfeng decoction on cecuml morphology of Dehua black chicken infected with coccidia （200×）2.3 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡抗球虫指标的影响
2.3.1 增重率
由表5可见，和K组相比，G组、CQL组、YL组、CQH组、YH组的相对增重率分别是79.88%、103.49%、107.27%、95.05%、96.06%，G组相对增重率降低，CQL组、YL组相对增重率分别升高3.49、7.27个百分点，而CQH组、YH组相对增重率分别降低4.95、3.84个百分点。
表 5 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡增重率的影响Table 5. Effect of modified Yupingfeng decoction on relative weight gain rate of Dehua black chicken infected with coccidia组别
Group感染前体重
Average initial weight/g感染7 d后体重
Average final weight/g平均日增重
Average weight gain/g相对增重率
Relative weight gain rate/%空白对照组 K 638.70±85.51 756.00±103.40 117.30 100.00 感染对照组 G 667.90±96.57 760.70±117.20 93.70 79.88 常山青蒿低剂量组 CQL 662.90±120.90 784.30±141.90 121.40 103.49 玉屏风加减低剂量组 YL 657.10±120.30 782.90±138.90 125.80 107.27 常山青蒿高剂量组 CQH 671.40±93.47 782.90±112.50 111.50 95.05 玉屏风加减高剂量组 YH 682.90±94.66 795.70±103.50 112.80 96.16 2.3.2 抗球虫指数（ACI）
由表6可见，和G组相比，除CQH组外，其他3个中药组盲肠病变计分显著或极显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；除CQH组OPG下降显著（P＜0.05），其他3个中药组OPG下降极显著（P＜0.01）；YL组盲肠病变计分、OPG最低。和K组相比，G组、CQL组、YL组、CQH组、YH组ACI分别是96、165.5、177、133.5、162.5，根据抗球虫指数（ACI）判断药效标准， CQH组为低效，CQL组、 YL组、YH组为良好，抗球虫效果最好的是 YL组。
表 6 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡ACI的影响Table 6. Effect of modified Yupingfeng decoction on ACI of Dehua black chicken infected with coccidia组别
Group存活率
Survival rate/%盲肠病变计分
Lesion平均克粪便卵囊量
Oocyst per gram /(×105)卵囊值
Oocyst valueACI 空白对照组 K 100 0 Cc 0 Dd 0 感染对照组 G 95 2.75±0.70 Aa 8.68±1.03 Aa 40 96.0 常山青蒿低剂量组 CQL 100 1.75±1.17 Ab 5.75±0.96 BCc 20 165.5 玉屏风加减低剂量组 YL 100 1.00±0.53 Bb 4.63±0.83 Cc 20 177.0 常山青蒿高剂量组 CQH 100 2.25±0.71 Aa 7.06±0.86 Ab 40 133.5 玉屏风加减高剂量组 YH 100 1.25±0.46 Bb 5.56±0.72 BCc 20 162.5 2.4 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡血清细胞因子及肠道SIgA抗体的影响
由表7可见：与K组相比，G组IL-6、IFN-γ、TNF-α极显著升高（P＜0.01），IL-2、SIgA极显著降低（P＜0.01）。和G组相比，4个中药组 IL-6、 IFN-γ、TNF-α均极显著降低（P＜0.01），IL-2、SIgA极显著升高（P＜0.01）。和相应的CQL、CQH组相比，YL、YH组 IL-6、 IFN-γ、TNF-α较低，IL-2、SIgA较高；YL组IL-2、SIgA较CQL组极显著升高（P＜0.01）。以上结果可看出，4个中药组都能减轻球虫感染引起的IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-2、SIgA的含量变化，YH组效果更好。
表 7 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡血清细胞因子及肠道SIgA抗体的影响Table 7. Effect of modified Yupingfeng decoction on cytokines and SIgA of Dehua black chicken infected with coccidia组别Group IL-2/(pg·mL−1) IL-6/(pg·mL−1) IFN-γ/(pg·mL−1) TNF-α/(pg·mL−1) SIgA/(μg·mL−1) 空白对照组 K 178.10±22.00 ABa 20.55±1.75 Bbc 57.42±3.72 Bb 48.83±4.31 Bb 1228.00 ±102.00 Bb感染对照 G 134.70±15.56 Cc 29.64±2.55 Aa 67.78±4.91 Aa 69.01±4.54 Aa 948.60±72.05 Cc 常山青蒿低剂量组 CQL 172.90±18.60 Bb 23.76±2.13 Bb 52.79±3.72 Bb 49.15±5.05 Bb 1225.00 ±57.14 Bb玉屏风加减低剂量组 YL 191.80±9.63 Aa 22.20±1.46 Bbc 52.21±2.30 Bb 48.62±1.91 Bb 1357.00 ±64.49 Aa常山青蒿高剂量组 CQH 183.50±13.08 Aa 20.72±2.03 Bbc 53.25±4.72 Bb 47.22±4.29 Bb 1340.00 ±83.53 Aa玉屏风加减高剂量组 YH 203.90±17.68 Aa 20.12±2.34 Bc 52.43±5.41 Bb 43.78±2.73 Bb 1385.00 ±81.46 Aa2.5 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡抗氧化功能的影响
由表8可见：和K组相比，G组MDA浓度极显著升高（P＜0.01），GSH-Px、SOD、CAT活性极显著降低（P＜0.01）。和G组相比，4个中药组MDA浓度极显著降低（P＜0.01），GSH-Px、SOD、CAT活性及T-AOC极显著升高（P＜0.01）。和相应的CQL、CQH组相比，YL、YH组MDA浓度极显著降低（P＜0.01），YL组GSH-Px、 SOD、CAT活性极显著升高（P＜0.01），YH组GSH-Px、 SOD活性极显著升高（P＜0.01）；和YL组相比，YH组GSH-Px活性极显著提高（P＜0.01）。以上结果可看出，4个中药组都能降低MDA浓度，升高GSH-Px、SOD、CAT活性及T-AOC，YL、YH组比相应的CQL、CQH组效果更好。
表 8 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡抗氧化功能的影响Table 8. Effect of modified Yupingfeng decoction on antioxidant indexes of Dehua black chicken infected with coccidia组别
Group丙二醛
MDA/(nmol·mL−1)谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U·mL−1)超氧化物歧化酶
SOD/(U·mL−1)总抗氧化能力
T-AOC/(U·mL−1)过氧化氢酶
CAT/(U·mL−1)空白对照组 K 4.31±0.56 Dd 435.90±33.56 Aa 61.21±5.84 Aa 18.45±1.95 BCb 176.00±24.19 Aa 感染对照组 G 8.63±0.58 Aa 182.40±15.43 Ee 26.67±2.90 Dd 16.35±1.21 Cc 112.50±12.19 Cc 常山青蒿低剂量组 CQL 7.53±0.14 Bb 250.90±6.88 Dd 35.91±4.54 Cc 19.16±1.50 Bb 132.60±15.31 Bb 玉屏风加减低剂量组 YL 5.82±0.19 Cc 315.9±20.96 Cc 46.56±5.12 Bb 22.88±1.89 Aa 161.40±9.40 Aa 常山青蒿高剂量组 CQH 6.99±0.47 Bb 287.60±16.27 Cc 38.72±4.48 Cc 20.90±2.18 ABa 150.40±14.87 Aa 玉屏风加减高剂量组YH 5.83±0.45Cc 370.00±18.08 Bb 49.93±6.40 Bb 22.72±2.80 ABa 163.40±25.67 Aa 3. 讨论
3.1 玉屏风加减煎剂组方辩证分析
柔嫩艾美耳球虫在鸡盲肠内经历裂殖生殖、配子生殖、孢子生殖3个阶段，整个生活史4～7 d[21]。鸡球虫病初期表现为食少神怠，便溏带血，恶臭，肛门红肿，口渴喜饮，中兽医辩证为湿热入侵大肠。常山性寒，《本草纲目》中记载：“常山有截痰截疟之功”，在民间主要用于治疗疟疾。《肘后备急方》治疗寒热疟的39方中14方含有常山[22]，现代研究表明，常山的主要成分常山酮可抑制鸡球虫早期对盲肠的侵入[23]，对球虫孢子、一代、二代裂殖体有抑制作用[24−25]。青蒿清热解暑、退虚热、杀虫，现代研究表明，青蒿的主要成分青蒿素能使球虫的第二代裂殖子大量凋亡[26]。青蒿和常山均对动物机体有一定的毒性，口服安全性更高，联合使用不但可以降低毒性还可增进药效[27−28]；玉屏风散中增强机体正气的主要是黄芪和白术，其中白术补脾益气，同时燥湿利水，也有一定的抗球虫作用[10]，因此本研究保留玉屏风中的黄芪、白术，防风换成具有清热、杀球虫作用的常山和青蒿，采用煎剂，起到减少毒性、增强机体正气、清热燥湿、杀虫之功。
3.2 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡盲肠病变及抗球虫效果的观察
柔嫩艾美耳球虫主要寄生在鸡盲肠隐窝上皮细胞[29]，可造成盲肠黏膜损伤，上皮细胞肿胀、坏死崩解和脱落[30]，从而阻碍肠道对于养分的吸收而影响机体的新陈代谢，影响增重，严重时导致死亡。本研究表明，4个中药组，盲肠上皮细胞损伤减轻，盲肠下炎症细胞减少，OPG下降，但青蒿常山组（CQL和CQH）的上皮细胞损伤、盲肠炎性细胞和OPG值均比相应的玉屏风加减组（YL和YH）大，提示玉屏风加减煎剂的黄芪白术能增强青蒿常山的抗球虫效果，减少球虫对盲肠黏膜上皮的损伤，减轻炎症。但本研究发现玉屏风加减高剂量组（YH）的黏膜损伤比玉屏风加减低剂量组（YL）大，而增重率更是玉屏风加减低剂量组（YL）最高，这可能和常山青蒿都有一定毒性，会损伤肝肾[27]、肠道[27−28]有关。常山青蒿剂量加大，杀虫效果更好，但对肠道损伤也同时增大，达到一定高剂量反而减少增重率，特别是常山，在小鼠试验中，发现治疗指数小，安全窗窄[31]，常山的主要成分常山酮剂量超过6 mg·kg−1就显著降低饲料转化率[7]。这也符合中兽医辩证，常山青蒿都是寒凉之药，易致脾虚。本研究中低剂量的常山青蒿组（CQL）由于剂量小未伤及脾气，可去湿热，从而提高增重率，玉屏风加减由于含有黄芪、白术，补益脾气，提高了增重率；而高剂量的常山青蒿，由于损伤脾气，导致脾虚，运化差，增重率下降，就是添加黄芪、白术的玉屏风加减高剂量组，也没能恢复正常水平；另外，由于正气被削弱，常山青蒿高剂量组（CQH）不但增重率下降，抗球虫能力也没有因为剂量的升高而升高，反而下降，OPG最高。因此，4个中药组，虽然玉屏风加减高剂量组（YH）整体的抗炎、抗氧化、免疫功能指标比低剂量组（YL）有略好趋势，但由于常山青蒿的毒性和寒性影响，整体效果不如玉屏风加减低剂量组（YL）。本研究山青蒿组的ACI值和前期研究[32]有一定差异，陈永亮等[33]也发现类似现象，这可能和鸡的品种、用药剂量等有一定关系，需进一步验证。
3.3 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡免疫功能和抗氧化功能的影响观察
IL-2是机体正常免疫功能的关键和免疫调节的中心[34]；SIgA是肠黏膜免疫主要效应因子，是黏膜免疫应答的标志指标，是肠黏膜免疫的重要免疫屏障[35−36]。本研究结果显示，德化黑鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫后，和正常对照相比，IL-2、SIgA降低，提示德化黑鸡球虫感染会降低免疫应答，破坏黏膜免疫。有研究表明，土鸡品种贵农黄金鸡感染球虫后，IL-2也降低[13]，但肉鸡、仔兔感染球虫后，出现IL-2[37−38]、 SIgA[9]升高，这可能和动物种类、品种不同有关；IL-6 、TNF-α介导免疫应答的同时，也是机体重要的促炎细胞因子[39−40]，特别是TNF-α是炎症反应过程中最早、最重要的炎症介质之一[41]； IFN-γ对柔嫩艾美耳球虫在鸡体内的发育有抑制作用，同时可促进巨噬细胞和其他一些细胞产生自由基，以杀伤球虫或宿主细胞，从而使鸡抵抗球虫感染[42]。本研究结果显示，德化黑鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫后，促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ升高，在土鸡品种贵农黄金鸡[13]、肉鸡[14]、仔兔[38]也出现类似结果，提示不同种类、品种的鸡感染球虫后，都会出现促炎细胞因子升高。机体利用炎症反应抗球虫的同时，也可造成组织炎症损伤；机体代谢过程中产生的过氧离子、羟基自由基等会造成细胞损伤，细胞内的GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶能清除氧自由基的堆积和减少过氧化物分解，保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物损害，T-AOC、SOD、GSH-Px及CAT等指标可直观反映机体抗氧化能力[20]，MDA可作为反映机体氧化程度的指标[43]。本研究结果显示，德化黑鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫后，MDA升高，而GSH-Px、SOD、CAT降低，在肉鸡[11]、仔兔[38]也出现了类似结果，提示不同种类、品种的鸡感染球虫后，都会出现氧化应激，抗氧化系统失衡。LILLEHOJ等[44]研究表明，机体利用氧自由基杀虫的同时，也杀伤宿主细胞，过量氧自由基会损伤T细胞，可能引起免疫抑制，本研究IL-2、SIgA的降低证实了这一点。因此，德化黑鸡球虫感染会引起免疫抑制、炎症反应及氧化应激，需要合适的免疫调节剂进行调节。
提高免疫功能、增强抗氧化能力及抗炎作用是中药抗球虫的机制之一[4]。研究表明，青蒿主要成分青蒿素可降低感染柔嫩艾美耳球虫鸡促炎性因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6）、降低氧化因子（一氧化氮和一氧化氮合酶）、提高肠黏膜SIgA[8]及IL-2水平[45]，具有抗炎、抗氧化、提高免疫功能作用；常山主要成分常山碱可降低感染疟原虫小鼠氧化因子一氧化氮、促炎性因子IFN-γ的含量[31]，具有抗炎、抗氧化作用。本研究结果显示，由常山、青蒿组成的常山青蒿中药煎剂可提高人工感染球虫德化黑鸡IL-2、 SIgA、T-AOC、SOD、GSH-Px及CAT，降低TNF-α、IFN-γ、IL-6及MDA，具有抗炎、抗氧化、提高免疫功能作用，达到一定的抗球虫作用，吻合常山青蒿的功效。本课题组前期研究显示，玉屏风煎剂可提高德化黑鸡IL-2、 SIgA、T-AOC、SOD、GSH-Px及CAT，降低TNF-α、IFN-γ、IL-6及MDA，具有较好的抗炎、抗氧化、提高免疫功能的作用[16]。本研究表明，相比单纯使用常山青蒿煎剂，玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡的抗炎、抗氧化、提高免疫功能效果更好。
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图 1 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡盲肠形态结构的影响（200×）
Figure 1. Effect of modified Yupingfeng decoction on cecuml morphology of Dehua black chicken infected with coccidia （200×）
表 1 试验鸡分组与处理
Table 1 Grouping and treatment of the chicken
组别 Group 动物数 Total number/只 处理 Treatment 空白对照组 K 20 不攻虫不给药 感染对照组 G 20 攻虫不给药 常山青蒿低剂量组 CQL 20 攻虫给药；煎剂2剂量2.5 mL·天−1·只−1 玉屏风加减低剂量组 YL 20 攻虫给药；煎剂1剂量2 mL·天−1·只−1+煎剂2剂量2.5 mL·天−1·只−1 常山青蒿高剂量组 CQH 20 攻虫给药；煎剂2剂量5 mL·天−1·只−1 玉屏风加减高剂量组 YH 20 攻虫给药；煎剂1剂量2 mL·天−1·只−1+煎剂2剂量5 mL·天−1·只−1 
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表 2 盲肠上皮细胞脱落计分标准
Table 2 Cecal epithelial cell shedding scoring criteria
分值 Score 标准 Standard 0 黏膜层上皮完整、细胞形态正常，固有层肠腺数量丰富、分布均匀，淋巴细胞分布均匀；未见明显的炎性改变 1 黏膜层偶见上皮细胞坏死脱落，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失；固有层肠腺数量丰富、分布均匀，淋巴细胞分布均匀；未见明显的炎性改变。 2 黏膜层少见上皮细胞坏死脱落，胞核固缩深染、碎裂或溶解消失；固有层肠腺数量丰富、分布均匀，淋巴细胞分布均匀；未见明显的炎性改变。 3 黏膜层多处上皮细胞缺失，固有层裸露；固有层淋巴细胞数量增多，肠腺间距较宽，排列稍不规则，淋巴数量轻度增多。 4 黏膜层大面积上皮细胞缺失，固有层裸露；固有层明显水肿，结缔组织排列疏松，肠腺间距增宽，排列稍不规则，淋巴细胞数量增多。
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表 3 盲肠病变计分标准
Table 3 Cecal lesions scoring criteria
分值
Score标准
Standard0 无肉眼可见病变 1 盲肠肠壁存在少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常 2 盲肠病变病理变化较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚 3 盲肠内有多量血液或有肠芯，盲肠壁明显增厚，盲肠中粪便含量少甚至无粪便存在 4 盲肠内充满大量血液或肠芯，盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，或鸡死亡
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表 4 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡盲肠病变指标的影响
Table 4 Effect of modified Yupingfeng decoction on cecuml lesion scores of Dehua black chicken infected with coccidia
组别
Group盲肠上皮细胞脱落情况计分
Epithelial cell shedding盲肠黏膜下淋巴细胞密度
Submucosal lymphocyte density/
(个·mm−²)空白对照组 K 0 Cc 611.90±107.60 Ab 感染对照组 G 3.50±0.46 Aa 1156.00 ±532.40 Aa常山青蒿低剂量组 CQL 2.75±1.17 Aa 772.40±275.00 Ab 玉屏风加减低剂量组 YL 1.00±0.93 Bb 674.40±85.87 Ab 常山青蒿高剂量组 CQH 3.25±0.71 Aa 916.20±169.20 Aa 玉屏风加减高剂量组 YH 1.25±1.28 Bb 708.00±177.30 Ab 同列数据后不同大、小写字母分别表示差异极显著（P＜0.01）或差异显著（P＜0.05）。下表同。
Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate extremely significant difference (P＜0.01) or significant difference (P＜0.05). Same for below.
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表 5 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡增重率的影响
Table 5 Effect of modified Yupingfeng decoction on relative weight gain rate of Dehua black chicken infected with coccidia
组别
Group感染前体重
Average initial weight/g感染7 d后体重
Average final weight/g平均日增重
Average weight gain/g相对增重率
Relative weight gain rate/%空白对照组 K 638.70±85.51 756.00±103.40 117.30 100.00 感染对照组 G 667.90±96.57 760.70±117.20 93.70 79.88 常山青蒿低剂量组 CQL 662.90±120.90 784.30±141.90 121.40 103.49 玉屏风加减低剂量组 YL 657.10±120.30 782.90±138.90 125.80 107.27 常山青蒿高剂量组 CQH 671.40±93.47 782.90±112.50 111.50 95.05 玉屏风加减高剂量组 YH 682.90±94.66 795.70±103.50 112.80 96.16
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表 6 玉屏风加减煎剂对人工感染球虫德化黑鸡ACI的影响
Table 6 Effect of modified Yupingfeng decoction on ACI of Dehua black chicken infected with coccidia
组别
Group存活率
Survival rate/%盲肠病变计分
Lesion平均克粪便卵囊量
Oocyst per gram /(×105)卵囊值
Oocyst valueACI 空白对照组 K 100 0 Cc 0 Dd 0 感染对照组 G 95 2.75±0.70 Aa 8.68±1.03 Aa 40 96.0 常山青蒿低剂量组 CQL 100 1.75±1.17 Ab 5.75±0.96 BCc 20 165.5 玉屏风加减低剂量组 YL 100 1.00±0.53 Bb 4.63±0.83 Cc 20 177.0 常山青蒿高剂量组 CQH 100 2.25±0.71 Aa 7.06±0.86 Ab 40 133.5 玉屏风加减高剂量组 YH 100 1.25±0.46 Bb 5.56±0.72 BCc 20 162.5
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表 7 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡血清细胞因子及肠道SIgA抗体的影响
Table 7 Effect of modified Yupingfeng decoction on cytokines and SIgA of Dehua black chicken infected with coccidia
组别Group IL-2/(pg·mL−1) IL-6/(pg·mL−1) IFN-γ/(pg·mL−1) TNF-α/(pg·mL−1) SIgA/(μg·mL−1) 空白对照组 K 178.10±22.00 ABa 20.55±1.75 Bbc 57.42±3.72 Bb 48.83±4.31 Bb 1228.00 ±102.00 Bb感染对照 G 134.70±15.56 Cc 29.64±2.55 Aa 67.78±4.91 Aa 69.01±4.54 Aa 948.60±72.05 Cc 常山青蒿低剂量组 CQL 172.90±18.60 Bb 23.76±2.13 Bb 52.79±3.72 Bb 49.15±5.05 Bb 1225.00 ±57.14 Bb玉屏风加减低剂量组 YL 191.80±9.63 Aa 22.20±1.46 Bbc 52.21±2.30 Bb 48.62±1.91 Bb 1357.00 ±64.49 Aa常山青蒿高剂量组 CQH 183.50±13.08 Aa 20.72±2.03 Bbc 53.25±4.72 Bb 47.22±4.29 Bb 1340.00 ±83.53 Aa玉屏风加减高剂量组 YH 203.90±17.68 Aa 20.12±2.34 Bc 52.43±5.41 Bb 43.78±2.73 Bb 1385.00 ±81.46 Aa
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表 8 玉屏风加减对人工感染球虫德化黑鸡抗氧化功能的影响
Table 8 Effect of modified Yupingfeng decoction on antioxidant indexes of Dehua black chicken infected with coccidia
组别
Group丙二醛
MDA/(nmol·mL−1)谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U·mL−1)超氧化物歧化酶
SOD/(U·mL−1)总抗氧化能力
T-AOC/(U·mL−1)过氧化氢酶
CAT/(U·mL−1)空白对照组 K 4.31±0.56 Dd 435.90±33.56 Aa 61.21±5.84 Aa 18.45±1.95 BCb 176.00±24.19 Aa 感染对照组 G 8.63±0.58 Aa 182.40±15.43 Ee 26.67±2.90 Dd 16.35±1.21 Cc 112.50±12.19 Cc 常山青蒿低剂量组 CQL 7.53±0.14 Bb 250.90±6.88 Dd 35.91±4.54 Cc 19.16±1.50 Bb 132.60±15.31 Bb 玉屏风加减低剂量组 YL 5.82±0.19 Cc 315.9±20.96 Cc 46.56±5.12 Bb 22.88±1.89 Aa 161.40±9.40 Aa 常山青蒿高剂量组 CQH 6.99±0.47 Bb 287.60±16.27 Cc 38.72±4.48 Cc 20.90±2.18 ABa 150.40±14.87 Aa 玉屏风加减高剂量组YH 5.83±0.45Cc 370.00±18.08 Bb 49.93±6.40 Bb 22.72±2.80 ABa 163.40±25.67 Aa
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