A Multiplex RT-PCR Assay for Detecting Three Pathogens Infecting Citrus Plants
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摘要:目的 建立柑橘黄化脉明病毒（citrus yellow vein clearing virus, CYVCV）、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus, CTV）和啤酒花矮化类病毒（hop stunt viroid, HSVd）的多重RT-PCR检测体系。方法 设计多重RT-PCR引物，分析其特异性，确定其最佳浓度比、最适退火温度及灵敏度，在此基础上对福建地区的柑橘样品进行检测。结果 确定了CYVCV-F/R、CTV-F/R和HSVd-F/R等3对引物的最佳浓度比例为1∶1∶2，最适退火温度为52.9 ℃，灵敏度结果显示该体系可检测模板稀释到10−2的阳性样品。应用该体系对采自福建部分地区的157份柑橘样品进行检测，结果发现，CYVCV、CTV和HSVd的检出率分别为47.1%、56.7%和22.9%。结论 成功建立了柑橘CYVCV、CTV和HSVd病原的多重RT-PCR检测方法，为该类病害的检测提供准确、快速的检测方法。Abstract:Objective A multiplex RT-PCR assay to simultaneously detect citrus yellow vein clearing virus (CYVCV), citrus tristeza virus (CTV), and hop stunt viroid (HSVd) was developed.Method Multiplex RT-PCR primers were designed, and their specificity was analyzed. The optimal concentration ratio, annealing temperature and sensitivity of primers were determined. Moreover, citrus samples from Fujian region were detected by the established multiplex RT-PCR.Result The optimized concentration ratio of CYVCV-F/R, CTV-F/R, and HSVd-F/R primers was 1:1:2, and the annealing temperature at 52.9 ℃ for the assay. The assay displayed a sensitivity at 10-2 dilution and the positive detections on CYVCV of 47.1%, on CTV of 56.7%, and on HSVd of 22.9% on 157 detected samples.Conclusion A rapid, accurate, applicable multiplex RT-PCR method for CYVCV, CTV, and HSVd detections was successfully established.
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0. 引言
【研究意义】柑橘（Citrus reticulata Blanco）属于芸香科（Rutaceae）、柑橘属（Citrus）植物，是世界第一大水果，也是重要的经济作物之一。中国种植柑橘有着悠久历史，种植面积和产量都位居世界首位[1]，主产区包括广西、福建、江西等8个省份（自治区）。柑橘是多年生树种，主要通过无性繁殖进行栽培，在长期嫁接繁殖的过程中，由于农事操作和媒介昆虫传播等原因导致柑橘极易感染病毒和类病毒病害，造成果树生长发育受限，果实品质变差，产量降低，严重的还会导致果树死亡[2]。据不完全统计全球已经发现80余种病毒和类病毒能够侵染柑橘[3]，而在中国发生并已报道的病毒和类病毒共有14种，经常存在复合侵染的现象[4]。柑橘黄化脉明病毒（citrus yellow vein clearing virus, CYVCV）属于甲型线性病毒科（Alphaflexiviridae）印度柑橘病毒属（Mandarivirus），在我国最早报道发生于云南的尤力克柠檬[5]，随后发现在我国柑橘产区普遍发生[6]。柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus, CTV）属于长线形病毒科（Closteroviridae）长线形病毒属（Closterovirus），是世界上最具破坏性的植物病毒之一，在我国首次发现于浙江的胡柚[7]。啤酒花矮化类病毒（hop stunt viroid, HSVd）属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae）啤酒花矮化类病毒属（Hostuviroid），我国最早在杏树上发现[8]。【前人研究进展】多重PCR检测方法可一步检测多种病原物，在柑橘病害检测上具有广泛的应用。肖远辉等[9-10]建立了柑橘黄龙病（Huanglongbing, HLB）和CTV的二重PCR和CTV、柑橘裂皮类病毒（citrus exocortis viroid, CEVd）和柑橘碎叶病毒（citrus tatter leaf virus, CTLV）的三重RT-PCR检测方法，周彦等[11]建立了CYVCV和柑橘褪绿矮缩病毒（citrus chlorotic dwarf-associated virus, CCDaV）的二重RT-PCR检测方法，赵恒燕等[12]建立了CYVCV和CTV的二重RT-PCR检测方法，丁芳等 [13]建立了HLB、CEVd和CTV的三重RT-PCR检测方法，Liu等[14]建立了HLB、CTV、CEVd和CTLV的四重PCR检测方法，黄爱军等[15]建立了CTV、CTLV、CYVCV和柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus, CLBV）的四重RT-PCR检测方法。【本研究切入点】本实验室前期利用单重RT-PCR对福建三明部分地区的柑橘样品进行病原检测，结果显示CTV和CYVCV两种病毒的检出率均超过60%，HSVd的检出率也高达23%，且大部分样品都存在复合侵染的情况[16]。因此，亟须建立针对这3种病毒的三重RT-PCR检测方法。【拟解决的关键问题】建立一种能同时检测CYVCV、CTV、HSVd的多重RT-PCR反应体系，以期提高检测效率，节约检测成本，为福建地区的柑橘病毒及类病毒病害诊断提供一种快速、高效的方法。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
2021— 2022年，157份柑橘样品采自福建省福州、漳州、宁德、三明等4个地区，每份样品取3～5片叶片放入自封袋置入液氮中速冻15 s，然后迅速放进超低温冰箱中保存备用。
1.2 引物设计与合成
根据多重PCR的引物设计原则，设计HSVd的特异性引物（HSVd-F：5′-CTGGGGAATTCTCGAGTTGCC-3′，HSVd-R：5′-AGGGGCTCAAGAGAGGATCCG-3′），引用Chen等[5]设计的引物CYVCV（CYVCV-F：5′-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3′，CYVCV-R：5′-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3′）和黄爱军等[15]设计的引物CTV（CTV-F：5′-ACTCTGATAGCGATGAACGA-3′，CTV-R：5′-AGCACACTTTAAATCAGTCAAGC-3′），引物交由北京擎科生物科技有限公司合成。
1.3 总RNA提取
参考TRAN®TransZol Up说明书进行总RNA的提取。具体步骤如下：取40 mg柑橘叶片置于含有3颗灭菌陶瓷珠的2 mL RNase-Free离心管中，将离心管放入液氮中速冻，然后转移至研磨仪中，频率40 Hz研磨40 s，重复2次；离心管中加入1 mL TransZol Up，室温振荡5 min；4 ℃ 12 000 r·min−1离心5 min，取800 μL上清液至新的1.5 mL RNase-Free离心管，加入4 ℃预冷的200 μL氯仿，颠倒混匀后室温静置5 min；4 ℃ 12 000 r·min−1离心15 min，取400 μL上清液至新的1.5 mL RNase-Free离心管，加入等量4 ℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10 min；4 ℃ 12 000 r·min−1离心10 min，去上清；加入1 mL DEPC处理水配制的75%乙醇，颠倒混匀；4 ℃ 7 500 r·min−1离心5 min，去上清；室温晾干沉淀5 min；加入20 μL DEPC水溶解沉淀；样品保存于−70 ℃超低温冰箱。
1.4 反转录合成cDNA
参考GenStar® StarScript Ⅲ一管化去基因组反转录预混液说明书进行反转录，合成cDNA。体系如下：RNA模板 1 μg，StarScript Ⅲ All-in-one RT Mix 1 μL，5×StarScript Ⅲ All-in-one RT Buffer 4 μL，Nuclease-free Water （DEPC-treated）补足至20 μL。反应程序：37 ℃ 2 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，4 ℃保存。
1.5 单重PCR反应
利用2×Es Taq MasterMix （Dye）进行PCR反应，反应体系：cDNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix （Dye） 10 μL，引物F（10 μmol·L−1）1 μL，引物R（10 μmol·L−1）1 μL，ddH2O 7 μL。反应程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃ 10 min，8 ℃终止反应。
1.6 多重PCR体系优化
引物浓度优化：以cDNA为模板，CYVCV、CTV、HSVd的3对引物设计不同浓度组合（表1），进行多重PCR反应。反应程序除了将延伸时间改为45 s以外，与单重PCR相同。琼脂糖凝胶电泳分析最佳引物配比。
表 1 多重RT-PCR引物浓度组合Table 1. Primers for multiplex RT-PCR assay（单位：μmol·L−1） 引物名称
Primer name引物浓度组合
Combinations of different primer concentration1 2 3 4 5 6 7 8 CYVCV-F/R 0.2 0.2 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 CTV-F/R 0.2 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.2 0.2 HSVd-F/R 0.3 0.15 0.3 0.2 0.3 0.15 0.3 0.2 退火温度优化：根据3对引物的Tm值，设计退火温度梯度，温度区间设置为48～60 ℃，PCR仪自动生成12个温度梯度，分别为48.0、48.2、48.9、50.0、51.4、52.9、54.5、56.1、57.5、58.7、59.6、60.0 ℃，进行多重PCR反应，其余程序同单重PCR。琼脂糖凝胶电泳分析最佳退火温度。
1.7 多重RT-PCR体系的灵敏度检测
以同时含有CYVCV、CTV和HSVd的柑橘样品总RNA（初始质量浓度为500 ng·μL−1）为模板，取2 μＬ进行10倍梯度稀释，依次稀释为10−1、10−2、10−3、10−4、10−5和10−6。保持其他反应条件不变的情况下，分别进行单重RT-PCR检测和多重RT-PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析两种方法的灵敏度。
2. 结果与分析
2.1 单重RT-PCR检测
以CYVCV、CTV、HSVd侵染的柑橘样品总RNA为模板，反转录合成cDNA后，利用CYVCV-F/R、CTV-F/R、HSVd-F/R的3对特异性引物分别进行单重PCR检测，结果显示，3对引物均可扩增出特异性条带（图1），其中CYVCV 612 bp，CTV 462 bp，HSVd 296 bp。将特异性条带回收后送交擎科生物科技有限公司测序，将序列提交至NCBI上进行Blast同源性比对，结果显示，扩增片段均与目的基因序列相符，同源性均达99%以上，说明引物引用及设计合理。
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图 1 单重RT-PCR扩增结果M：D2000Plus DNA分子量标准；1：CYVCV-F/R扩增；2：CTV-F/R扩增；3：HSVd-F/R扩增。Figure 1. Amplification of single RT-PCRM: D2000Plus DNA marker; 1: amplified by CYVCV-F/R; 2: amplified by CTV-F/R; 3: amplified by HSVd-F/R.2.2 多重PCR反应体系引物浓度的优化
本研究共设计了8种引物浓度配比方案（表1），琼脂糖凝胶电泳结果显示，CYVCV的条带始终较亮（图2），说明该体系中CYVCV-F/R竞争性最强。CTV的条带亮度会受到较高CYVCV-F/R浓度的影响，当CYVCV-F/R浓度为CTV-F/R的两倍时，CTV的条带变暗（图2泳道2），但CYVCV-F/R和CTV-F/R基本不受到HSVd-F/R浓度的影响（图2）。适当提高HSVd-F/R的浓度比例，可以增加HSVd条带的亮度（图2泳道1、3、5、7）。最终确定了多重PCR反应体系中最佳引物浓度为CYVCV-F/R 0.15 μmol·L−1、CTV-F/R 0.15 μmol·L−1、HSVd-F/R 0.30 μmol·L−1（图2泳道3）。
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图 2 不同引物浓度组合的扩增结果M：D2000Plus DNA分子量标准，1～8引物浓度组合参见表1。Figure 2. Amplification of varied concentration ratios of combined primersM: D2000Plus DNA marker, 1–8: concentration ratio of combined primers as shown on Table 1.2.3 多重PCR反应体系退火温度的优化
利用梯度PCR仪设置不同退火温度，琼脂糖凝胶电泳结果显示，退火温度50 ℃及以下时，HSVd特异性条带下方出现了非特异性扩增片段，随着退火温度的提高，CYVCV和HSVd的条带逐渐变亮，而CTV的条带逐渐变暗（图3）。最终确定了多重PCR反应体系的最佳退火温度为52.9 ℃（图3）。
2.4 多重RT-PCR反应体系的灵敏度
总RNA模板初始浓度为500 ng·μL−1，将模板梯度稀释，反转录合成cDNA后，在相同反应条件下，对PCR灵敏度进行分析，结果显示，单重RT-PCR的能够检测出CYVCV、CTV和HSVd的总核酸最大稀释倍数分别是10−4、10−3和10−2（图4A —C），而多重RT-PCR能够检测出3种病原的最大稀释倍数是10−2（图4D），即该多重RT-PCR最低能从5 ng·μL−1总核酸中检测出3种病原。
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图 4 单重及多重RT-PCR灵敏度检测结果M：D2000Plus DNA分子量标准，1：100，2：10−1，3：10−2，4：10−3，5：10−4，6：10−5，7：10−6，8：阴性对照。Figure 4. Assay sensitivity of single and multiplex RT-PCRM: D2000Plus DNA marker; 1: 100; 2: 10−1; 3: 10−2; 4: 10−3; 5: 10−4; 6: 10−5; 7: 10−6; 8: negative control.2.5 多重RT-PCR反应体系的应用
应用优化后的多重RT-PCR反应体系对在福建部分地区采集的157份柑橘样品进行检测，分析田间柑橘CYVCV、CTV和HSVd的3种病原物的侵染情况，部分检测结果如图5A所示。与此同时，选择部分样品进行单重RT-PCR检测，结果与多重RT-PCR保持一致。检测结果发现，CTV阳性样品数为89，检出率最高，达56.7%，其次是CYVCV阳性样品数为74，检出率为47.1%，HSVd阳性样品数为36个，检出率最低，为22.9%（图5B）。同时被两种及以上的病原侵染的样品有67个，其中同时被3种病原侵染的样品有18个，而单一病原侵染的样品有47个（图5C）。
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图 5 多重RT-PCR体系的应用A： 多重RT-PCR检测样品； M：D2000Plus DNA分子量标准，1～16：16份柑橘样品，17：阴性对照。B： 检出率分析； C： 复合侵染分析。Figure 5. Application of multiplex RT-PCR assayA: Detection by multiplex RT-PCR; M: D2000Plus DNA marker; 1–16: 16 citrus samples; 17: negative control; B: detection rate; C: detection on mixed infections.3. 讨论
在需要检测多种病原物时，多重PCR有着突出的优势，但多重PCR反应体系中不同引物之间的竞争会影响扩增效果，本研究预试验结果发现，当CYVCV-F/R、CTV-F/R、HSVd-F/R的3对引物的浓度比例为1∶1∶1时，CYVCV-F/R和CTV-F/R的条带较亮，HSVd-F/R的条带较暗，说明CYVCV-F/R和CTV-F/R竞争性要强于HSVd-F/R，所以通过优化，最终确定3对引物的浓度比例为1∶1∶2。本研究结果发现，与单重RT-PCR相比，多重RT-PCR中CYVCV-F/R和CTV-F/R的检测灵敏度相对较低，HSVd-F/R的检测灵敏度与其单重RT-PCR基本相当，总而言之，多重RT-PCR反应体系的灵敏度要略低于单重RT-PCR，这在多重PCR体系中非常普遍[15,17−18]，推测可能的原因也与引物的竞争性有关。
除了嫁接和苗木转运，CYVCV和CTV均可通过蚜虫进行传播[19−20]，目前在我国柑橘产区分布广泛[6,16,21−26]。HSVd具有广泛的寄主范围，除了柑橘外，还可侵染啤酒花、李、桑树等[27−29]。本实验室前期发现福建省三明地区的柑橘经常被这3种病原物单一或复合侵染[16]，给本地区柑橘产业带来潜在威胁。本研究利用建立的多重RT-PCR体系发现福建省多个柑橘种植区均被以上3种病原所侵染，病原检出率与前期利用单一PCR对三明地区的检测基本一致[16]。本研究建立的多重RT-PCR体系对福建地区柑橘病毒类病害的检测提供进一步的便利。
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图 1 单重RT-PCR扩增结果
M：D2000Plus DNA分子量标准；1：CYVCV-F/R扩增；2：CTV-F/R扩增；3：HSVd-F/R扩增。
Figure 1. Amplification of single RT-PCR
M: D2000Plus DNA marker; 1: amplified by CYVCV-F/R; 2: amplified by CTV-F/R; 3: amplified by HSVd-F/R.
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图 2 不同引物浓度组合的扩增结果
M：D2000Plus DNA分子量标准，1～8引物浓度组合参见表1。
Figure 2. Amplification of varied concentration ratios of combined primers
M: D2000Plus DNA marker, 1–8: concentration ratio of combined primers as shown on Table 1.
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图 4 单重及多重RT-PCR灵敏度检测结果
M：D2000Plus DNA分子量标准，1：100，2：10−1，3：10−2，4：10−3，5：10−4，6：10−5，7：10−6，8：阴性对照。
Figure 4. Assay sensitivity of single and multiplex RT-PCR
M: D2000Plus DNA marker; 1: 100; 2: 10−1; 3: 10−2; 4: 10−3; 5: 10−4; 6: 10−5; 7: 10−6; 8: negative control.
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图 5 多重RT-PCR体系的应用
A： 多重RT-PCR检测样品； M：D2000Plus DNA分子量标准，1～16：16份柑橘样品，17：阴性对照。B： 检出率分析； C： 复合侵染分析。
Figure 5. Application of multiplex RT-PCR assay
A: Detection by multiplex RT-PCR; M: D2000Plus DNA marker; 1–16: 16 citrus samples; 17: negative control; B: detection rate; C: detection on mixed infections.
表 1 多重RT-PCR引物浓度组合
Table 1 Primers for multiplex RT-PCR assay
（单位：μmol·L−1） 引物名称
Primer name引物浓度组合
Combinations of different primer concentration1 2 3 4 5 6 7 8 CYVCV-F/R 0.2 0.2 0.15 0.15 0.2 0.15 0.15 0.15 CTV-F/R 0.2 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.2 0.2 HSVd-F/R 0.3 0.15 0.3 0.2 0.3 0.15 0.3 0.2 
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