Identification and Culture Optimization of Effective Biocontrol Agent on Thosea senensis for Tea Plantations
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摘要:目的 筛选适宜生态有机茶园防治扁刺蛾的生防菌。方法 采用温度筛选法从自然罹病死亡的扁刺蛾肠道体内初筛生防菌，浸液饲喂法测定生防菌对扁刺蛾幼虫的室内毒力；综合菌株的形态特征、分子生物学鉴定以及构建的系统发育树分析进行菌株的鉴定；通过单因素和正交试验对生防菌的发酵参数条件进行优化。结果 筛选到1株对扁刺蛾幼虫具有较高防效的内生生防菌X-11，扁刺蛾3龄幼虫取食经2.56×108个·mL−1 X-11菌液处理的茶枝条7 d后扁刺蛾累计校正死亡率达到90.5%，致死中时（LT50）仅为2.88 d。菌株X-11经16s rDNA分子生物学鉴定以及构建的系统发育树分析确定为偶氮还原拟杆菌（Paenibacillus azoreducens）。发酵条件优化试验表明，菌株X-11的适宜发酵条件为：菌株接种量2%，在发酵温度36℃条件下发酵培养60 h，菌株含量最高达1.34×109个·mL−1。结论 筛选到1株对扁刺蛾幼虫具有较高防效的内生生防菌x-11，可作为防治扁刺蛾幼虫的生物防治菌剂使用。Abstract:Objective A biocontrol microbe on Thosea senensis Walker suitable for organic tea agriculture was identified and optimal culture conditions studied.Method From the intestines of T. senensis died from disease in nature, microbes were cultured and screened by means of varying the temperature. Indoor virulence of the selected microbes on T. senensis was determined by immersion feeding and further identified by morphological, molecular biological, and phylogenetic tree analyses. Culture of the isolated strain was optimized by univariate and orthogonal experiments.Result The endophytic strain X-11 with high efficacy in controlling the pest was isolated. The 3rd instar larvae of T. senensis fed with a 2.56×108 conidia·mL−1 X-11 solution displayed a cumulative corrected mortality rate of 90.5% with a median lethal time LT50 of 2.88 d on the 7th day after treatment. Based on the 16S rDNA molecular identification and phylogenetic analysis, X-11 was determined to be Paenibacillus azoreducens. The optimized culture conditions for the bacterium included the use of 2% inoculum to culture for 60 h at 36℃ with a final count approaching 1.34×109 conidia·mL−1.Conclusion The endophytic strain with high control efficacy on T. senensis larvae was identified as P. azoreducens. It could be cultured to be used as a bioagent for the pest control at tea plantations.
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Keywords:
- Thosea senensis Walker /
- strain screening /
- bacteroidetes /
- culture conditions /
- orthogonal test
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0. 引言
【研究意义】扁刺蛾Thosea senensis Walker属鳞翅目Lepidoptera刺蛾科Limacodidae扁刺蛾属Thosea，俗称“痒辣子”，分布广泛，为杂食性食叶害虫[1]。扁刺蛾爆发时可将茶树及景观树冠层芽叶大面积吃光，甚至造成树木枯死，严重影响茶叶产量和茶园景观。此外，扁刺蛾幼虫体表遍布毒刺，触及人皮肤会引起皮肤发炎、疼痛、红肿，伴有剧烈灼痛感，严重影响茶园生产作业。目前生态茶园推广最广泛的普杀性物理防控技术如色板、杀虫灯等难以针对茶园刺蛾进行有效防控，适时还需要药剂防控，但长期使用化学药剂防治扁刺蛾易导致害虫产生抗药性，生态环境污染以及作物农残超标等问题[2-3]。与化学药剂相比生物菌剂具有不易产生抗药性、对天敌友好、环境污染少等优点[4-6]。因此，筛选高效的生防菌防治扁刺蛾可以有效保护茶园生态系统、减少环境污染，提升茶叶的质量安全，具有非常重要的意义。【前人研究进展】笔者调查发现刺蛾在江西南昌地区茶园一年一般发生2代，少数 3、4代，且通常第二代发生为害较严重，发生种类主要有茶刺蛾（Iragoides fasciata Moore）、扁刺蛾（Thosea senensis Walker）、褐刺蛾（Thosea haibarana Matsumura）、丽绿刺蛾（Parasa lepida Gramer）、黄刺蛾（Cnidocampa flavescens Walker）和龟形小刺蛾（Narosa nigrisigna Wileman）[7]，其中尤以扁刺蛾发生最为严重。目前报道对刺蛾有一定防效的生防菌株主要有白僵菌、金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌等[8-10]。肖锴[11]利用苏云金杆菌防治刺蛾，发现其具有较好的防治效果，致死率达到90%以上。谢小群等[12]以球孢白僵菌（Bb）、苏云金杆菌（Bt）和金龟子绿僵菌（Ma）等3种微生物农药为试验药剂，探讨了单一药剂及两两混配药剂不同浓度下对扁刺蛾幼虫的防效，结果表明，药后 24 h，Bb在不同浓度下的平均校正死亡率最高为61.11%，显著高于Bt（46.67%）和Ma（32.96%）。稀释100倍的Bb和稀释1000倍的Bt的混配药剂在药后 24 h的校正死亡率最高为72.2%。同时优化生防菌株的发酵工艺条件，提高生防菌株细胞产量不仅是保证生防菌株防效的前提，也是决定其能否从实验室走向田间的关键[13-14]。曹云娥等[15]通过结合单因素试验和响应面分析法优化了生防菌WQ-6的发酵工艺条件，发现优化后 WQ-6 发酵液对枯萎病菌的抑菌率较优化前增加了2.28%~32.16%。【本研究切入点】目前市售可选择的扁刺蛾高防效生物药剂还较少，有关专一性防治刺蛾的生防菌剂还有待深入研究。【拟解决的关键问题】从扁刺蛾尸虫肠道体内筛选对扁刺蛾具有高防效的生防菌株，优化生防菌株的发酵工艺条件，提高对茶园扁刺蛾的生防防效，以期解决使用化学药剂防治扁刺蛾造成的茶园生态环境污染，茶叶农残超标等问题，为该生防菌剂的工业发酵生产及产品开发提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试虫源
扁刺蛾幼虫采集于江西省凤凰沟风景区内套种樱花茶园，幼虫以新鲜茶枝饲养于人工气候培养箱中，光周期16L∶8D，温度（28±1） ℃，相对湿度80%，3 d后选择健康、大小一致的扁刺蛾3龄幼虫用于生防菌毒力测定。
1.2 培养基
GYS 培养基：硫酸铵 2.0 g，磷酸氢二钾 5.0 g，葡萄糖 1.0 g，酵母 2.0 g，硫酸锰 0.06 g，硫酸镁 0.4 g，氯化钙 0.08 g，水1 L；牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，水1 L，pH 7.3；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯300 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L，pH 自然；牛肉膏蛋白胨液体培养基：NA培养基不加琼脂，用来发酵培养细菌。
1.3 生防菌株筛选
1.3.1 菌株初筛
将从茶园收集到的自然罹病死亡的扁刺蛾尸虫用大量无菌水冲洗晾干，取其肠道内含物研磨成匀浆后备用。采用温度筛选法进行菌株的分离[16]，取适量匀浆物至50 mL GYS培养液中振荡发酵培养48 h，设置发酵条件为30 ℃、220 r·min−1，发酵完后取1 mL发酵液离心沉降固体物，取其上清液于70 ℃水浴锅内热处理5 min，然后取200 μL稀释液涂抹于NA和PDA培养基上30 ℃恒温培养72 h。细菌菌株毒力采用浸液饲喂法测定[17]，取幼嫩的茶树枝条洗净、晾干后置于发酵好的菌液中浸湿30 min，自然风干后供扁刺蛾取食。真菌菌株毒力采用直接喷雾法[12]测定，将菌液直接喷雾于扁刺蛾表面，然后以无任何处理的茶树幼嫩枝条饲养扁刺蛾。每个菌株处理选取20只健康、生长状况较一致的扁刺蛾3龄幼虫，处理后的幼虫放入人工气候箱中饲养，每天观察记录扁刺蛾死亡状况（用笔轻触幼虫吸盘无收缩力，视为死虫）。
1.3.2 菌株复筛
以初筛到的对扁刺蛾有致死作用的5株细菌为试验对象，选择市售生物农药苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）为阳性对照，NA液体培养液为阴性对照。菌株复筛方法与初筛方法相同，复筛菌株于30 ℃、120 r·min−1的发酵条件下发酵培养48 h后，将发酵好的菌液使用血球计数板计数测定菌液浓度，用无菌水将各复筛菌株浓度均稀释至2.56×108个·mL−1，每个菌株的毒力试验选取20只健康、生长状况较一致的扁刺蛾3龄幼虫，重复3次。每天观察记录扁刺蛾死亡状况，计算扁刺蛾累计校正死亡率。使用统计软件SAS8.1计算致死中时 LT50。
死亡率/% ＝ [（供试虫数−活虫数）/供试虫数]×100；
校正死亡率/% ＝ [（处理组虫口死亡率−对照组虫口死亡率）/（1−对照组虫口死亡率）]×100。
1.4 菌株鉴定
形态学观察：将分离纯化得到的生防菌采用平板划线法接种到固体NA培养基上，30 ℃培养72 h后观察菌落形态。菌株系统发育学分析：采用DNA提取试剂盒提取菌株DNA，设计细菌16S rDNA全序列通用引物P0：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P6：5′-CATCGGCTACCTTGTTACGA-3′进行PCR扩增，PCR扩增反应体系（25 μL）：细菌总DNA模板（100 ng·μL−1）1 μL，2x Taq PCR Mix 12.5 μL，引物 P0（10 μmol·L−1）1 μL，引物 P6（10 μmol·L−1）1 μL，去离子水9.5 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物送测序公司进行测序，测序结果在 NCBI 网站进行 Blast 比对，采用 MEGA 7 软件的邻位相连算法（N-J法）对该序列构建系统进化树，Boostrap值设置为1 000来分析分支系统发育树各分支聚类的稳定性。
1.5 发酵工艺优化
1.5.1 单因素试验
设置菌株初始发酵条件为：接种量1%、发酵时间48 h、发酵温度30 ℃，转速120 r·min−1[18]。菌株发酵完成后将发酵液高速离心收集菌株，菌株经干燥完全后称重，以每升发酵液的菌株x-11生物量为评价指标，各试验处理重复3次，完全随机排列，在其他发酵条件一致的情况下，分别考察不同接种量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、发酵温度（20、25、30、35、40 ℃）以及发酵时间（24、36、48、60、72 h）对菌株有效活菌数的影响。
1.5.2 正交试验优化
根据单因素试验结果，选择接种量A（1.5%、2%、2.5%）、发酵温度B（36、39、42 ℃）以及发酵时间C（55、60、65 h）为考察因素，采用3因素3水平的正交试验设计，以每升发酵液的菌株x-11生物量为优化指标，确定菌株最佳发酵工艺，提高菌株活性，具体如表1所示。
表 1 正交试验优化因素水平Table 1. Factors and levels of orthogonal optimization test水平
Level接种量A
Inoculation
amount A/%发酵温度B
Fermentation
temperature B/℃发酵时间C
Fermentation
time C/h1 1.5 36 55 2 2 39 60 3 2.5 42 65 1.6 数据统计与分析
采用统计软件SAS8.1计算致死中时 LT50；SPSS 23.0软件计算单因素和正交试验方差分析；Excel软件进行作图分析；MEGA 7.0软件中的邻接法构建系统发育树。
2. 结果与分析
2.1 生防菌株初筛
从扁刺蛾尸虫肠道内共分离、纯化到42株菌株，室内毒力试验初筛到5株对刺蛾有致死作用的细菌，分别命名为X-2、X-7、X-9、X-11、X-12。其中BT、X-9和X-11菌液处理扁刺蛾后其进食量较对照和其他菌液处理显著减少，刺蛾几乎不取食，其他菌液处理刺蛾有取食鲜叶行为且差异不显著。药后死亡刺蛾呈明显的细菌感染症状（图1），尸虫色泽加深为褐色或黑色，身体软化肿大，伴有明显臭味。表明X-9和X-11菌的杀虫机制可能与Bt类似，通过胃毒作用使害虫停止取食，最后害虫因饥饿而死亡[19]。
2.2 生防菌株复筛
由表2可知，5株初筛菌株均在接种3 d后开始表现出明显的防治效果，扁刺蛾3龄幼虫大量死亡，药后7 d对扁刺蛾的校正死亡率高于阳性对照Bt处理的菌株有X-2和X-11，X-11对刺蛾的校正死亡率最高，为90.5%，其次分别为X-2（86.8%）、X-9（73.6%）、X-12（62.3%）和X-7（41.5%），对应的X-2和X-11的致死中时较短，分别为2.86 d和2.88 d，与其他菌株的致死中时差异显著。菌株X-11对扁刺蛾的防效最高，致死中时较短，因此将X-11菌株作为后续试验对象。
表 2 生防菌毒力测定Table 2. Determination of virulence of biocontrol bacteria菌株
Strain死亡率 Mortality /% 累计死亡率
Cumulative mortality /%累计校正死亡率
Cumulative adjusted mortality /%致死中时LT50
Lethal time
LT50/d3 d 5 d 7 d X-2 58.5±2.36 a 78.3±8.49 a 88.3±8.49 ab 88.3±8.49 ab 86.8±8.49 ab 2.86±0.23 a X-7 25.0±4.08 b 36.7±2.36 b 48.3±6.24 b 48.3±6.24 b 41.5±6.24 b — X-9 26.7±6.24 b 53.3±8.49 ab 76.7±6.24 ab 76.7±6.24 ab 73.6±6.24 ab 4.74±0.34 b X-11 58.3±8.49 a 73.3±10.27 a 91.6±2.36 a 91.6±2.36 a 90.5±2.36 a 2.88±0.32 a X-12 28.3±6.24 b 60.0±7.07 ab 66.7±6.24 b 66.7±6.24 b 62.3±6.24 b 4.56±0.48 b Bt 53.3±6.24 a 66.7±4.71 a 86.7±8.49 ab 86.7±8.49 ab 84.9±8.49 ab 2.93±0.32 a CK 5.0±4.08 c 6.67±2.36 c 11.6±2.36 c 11.6±2.36 c — — 表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同的小写字母表示 0.05 水平上差异显著。
Datas are mean±SD; those with different lowercase letters on same column indicate significant difference at 0.05 level.2.3 菌株鉴定
在NA培养基上X-11菌株呈圆形，中心稍凸，灰白色，边缘整齐的菌落形态（图2）。提取 X-11菌株的基因组 DNA，利用 PCR 技术扩增其16S rDNA，PCR产物经电泳检测显示在1 500 bp 左右有一条明显条带（图3），与16SrDNA 大小一致。因此，将该条带切胶回收后送生物测序公司测序。测序结果在 NCBI 网站进行 Blast 比对，发现其与多个拟杆菌（Bacteroides）的同源性达 99%以上，采用邻位相连算法（N-J法）对该序列构建系统进化树 （图4），X-11与6株拟杆菌模式菌株形成3个不同的分支，表明这些菌株属于3个不同的亚群，但与偶氮还原拟杆菌（Paenibacillus azoreducens）的亲缘关系最近。根据16S rDNA鉴定以及系统进化树分析，刺蛾生防菌X-11被鉴定为偶氮还原拟杆菌。目前已将菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号：CGMCC No.24117）。
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图 3 x-11菌株 16S rDNA基因扩增电泳图1：LB-1；2：空白对照；M：DL10000。Figure 3. Electrophoresis of amplified X-11 16S rDNA gene1: LB-1; 2: blank control; M: DL10000.![]()
图 4 基于16S rDNA 基于序列构建X-11菌株系统发育树Figure 4. Phylogenetic tree of X-11 based on 16S rDNA sequence2.4 菌株X-11发酵条件优化
2.4.1 单因素试验优化
2.4.1.1 接种量对菌液浓度的影响
由图5可知，在一定接种量范围内，随着接种量的增加，菌株X-11生物量随之增加，当接种量为2.0%时，X-11菌生物量最高，为295.1 mg·L−1，除与1.5%接种量下菌株生物量差异不显著外，与其他接种量下的菌株生物量差异均达显著水平，当接种量大于2.0%时，菌株生物量开始下降，推测是由于接种量过多，发酵后期菌体之间产生竞争，同时产生大量代谢废物，导致发酵液环境不利于菌株生长，因此菌株X-11发酵培养的最优接种量为2.0%。
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2.4.1.2 发酵时间对菌液浓度的影响
由图6可知，随着发酵时间的增加，菌株X-11发酵液的生物量呈先增加后逐渐下降的趋势。当发酵时间为60 h时，X-11菌株的生物量最高，为306 mg·L−1，其与低于48 h发酵时间下的菌株生物量差异显著；继续延长发酵时间，其菌株生物量开始降低，但其生物量降低不显著，推测其原因可能是由于细胞生长进入了稳定期，代谢产物的合成速度下降导致。因此菌株X-11发酵培养的最优发酵时间为60 h。
2.4.1.3 发酵温度对菌液浓度的影响
由图7可知，温度对菌株X-11的活性影响较大，发酵温度在35~40 ℃时的菌株生物量显著高于20~25 ℃，40 ℃时X-11菌株生物量最高，为353 mg·L−1，但当温度高于35 ℃时，菌株生物量随着温度升高增幅减小。推测这可能是温度过高影响了该菌株的生长代谢，从而抑制了菌株的生长，因此X-11发酵培养的最优发酵温度为35 ℃。
2.4.2 正交试验优化
正交试验结果如表3所示，RB>RC>RA，极差越大，对试验结果的影响越大，故 3 个因素对X-11菌株活性的影响为发酵温度>发酵时间>接种量；比较各列 K 值，得到最佳水平组合是 A2B1C2；进一步试验验证该最佳组合，X-11菌株生物量最高达到534.9 mg·L−1。因此确定X-11菌株的最佳发酵条件为：菌株初始接种量2%，在发酵温度36 ℃条件下发酵培养60 h。
表 3 X-11菌发酵条件优化正交试验Table 3. Orthogonal test for X-11 culture optimization序号
Serial接种量
Inoculation amount发酵温度
Fermentation temperature发酵时间
Fermentation time菌株生物量
Strain biomass/（mg·L−1）1 3 3 1 322.9 2 1 2 3 390.5 3 3 1 3 455.4 4 1 3 2 357.9 5 2 3 3 339.2 6 3 2 2 410.6 7 2 2 1 357.9 8 2 1 2 534.9 9 1 1 1 429.8 K1 392.7 473.4 370.2 K2 410.7 386.4 434.6 K3 396.4 340 395.1 R 14.3 133.4 39.5 3. 讨论与结论
生物农药是发展现代绿色农业的重要基础，生物农药因其对环境、天敌友好以及无残留等优点，具有非常好的应用前景。生物农药菌种资源的筛选、保存、评估和利用是未来生物农药研发的重要基础[20]，因此越来越多的植保科技人员将重心放在了新型生防菌株的筛选工作中。致病力是衡量菌株生防潜力的重要指标[21]，本试验采用传统微生物筛选方法从自然罹病死亡的扁刺蛾体内筛选到1株对扁刺蛾幼虫高防效的内生菌株X-11，扁刺蛾3龄幼虫取食经2.56×108个·mL−1 X-11菌液处理的茶枝条7 d后扁刺蛾累计校正死亡率达到90.5%，致死中时（LT50）仅为2.88 d。通过16s rDNA分子鉴定以及构建的系统发育分析确定该菌株为偶氮还原拟杆菌（Paenibacillus azoreducens）。
菌株的发酵条件是影响微生物生长代谢的重要因子，适宜的发酵条件可极大地促进菌株生长，提高菌株活性[22]。本试验在单因素优化试验的基础上进行了正交试验优化X-11菌的发酵条件，结果表明其最佳发酵条件为：菌株初始接种量2%，在发酵温度36 ℃条件下发酵培养60 h，较初始发酵条件大幅提高了X-11的活菌数。此外，本试验是在昆虫人工气候培养箱内进行，试验环境相对稳定，与田间试验环境具有比较大的差异，无法确定X-11菌是否在田间还具有如此好的应用效果，因此还需进一步进行菌剂防效稳定性、安全性以及测定田间防效等试验。
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图 3 x-11菌株 16S rDNA基因扩增电泳图
1：LB-1；2：空白对照；M：DL10000。
Figure 3. Electrophoresis of amplified X-11 16S rDNA gene
1: LB-1; 2: blank control; M: DL10000.
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图 4 基于16S rDNA 基于序列构建X-11菌株系统发育树
Figure 4. Phylogenetic tree of X-11 based on 16S rDNA sequence
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表 1 正交试验优化因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal optimization test
水平
Level接种量A
Inoculation
amount A/%发酵温度B
Fermentation
temperature B/℃发酵时间C
Fermentation
time C/h1 1.5 36 55 2 2 39 60 3 2.5 42 65 
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表 2 生防菌毒力测定
Table 2 Determination of virulence of biocontrol bacteria
菌株
Strain死亡率 Mortality /% 累计死亡率
Cumulative mortality /%累计校正死亡率
Cumulative adjusted mortality /%致死中时LT50
Lethal time
LT50/d3 d 5 d 7 d X-2 58.5±2.36 a 78.3±8.49 a 88.3±8.49 ab 88.3±8.49 ab 86.8±8.49 ab 2.86±0.23 a X-7 25.0±4.08 b 36.7±2.36 b 48.3±6.24 b 48.3±6.24 b 41.5±6.24 b — X-9 26.7±6.24 b 53.3±8.49 ab 76.7±6.24 ab 76.7±6.24 ab 73.6±6.24 ab 4.74±0.34 b X-11 58.3±8.49 a 73.3±10.27 a 91.6±2.36 a 91.6±2.36 a 90.5±2.36 a 2.88±0.32 a X-12 28.3±6.24 b 60.0±7.07 ab 66.7±6.24 b 66.7±6.24 b 62.3±6.24 b 4.56±0.48 b Bt 53.3±6.24 a 66.7±4.71 a 86.7±8.49 ab 86.7±8.49 ab 84.9±8.49 ab 2.93±0.32 a CK 5.0±4.08 c 6.67±2.36 c 11.6±2.36 c 11.6±2.36 c — — 表中数据为平均值±标准差；同列数据后不同的小写字母表示 0.05 水平上差异显著。
Datas are mean±SD; those with different lowercase letters on same column indicate significant difference at 0.05 level.
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表 3 X-11菌发酵条件优化正交试验
Table 3 Orthogonal test for X-11 culture optimization
序号
Serial接种量
Inoculation amount发酵温度
Fermentation temperature发酵时间
Fermentation time菌株生物量
Strain biomass/（mg·L−1）1 3 3 1 322.9 2 1 2 3 390.5 3 3 1 3 455.4 4 1 3 2 357.9 5 2 3 3 339.2 6 3 2 2 410.6 7 2 2 1 357.9 8 2 1 2 534.9 9 1 1 1 429.8 K1 392.7 473.4 370.2 K2 410.7 386.4 434.6 K3 396.4 340 395.1 R 14.3 133.4 39.5
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百度学术
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