0.   引言

【研究意义】微生物在自然界中无处不在，它具有个体小、代谢旺、分布广、数量多等特点，还具有强大的分解能力。微生物活动保障生态系统的物质循环，同时净化生态系统，协调生态平衡^[1-3]。随着工农业的不断发展，以微生物为原料的菌剂受到了资本方越来越多的青睐。当前微生物菌剂产品在国内就有千亿元规模的市场，被广泛应用于废弃物资源化利用、微生物菌肥、土壤修复、有毒有害物质降解、水污染及环境污染治理等方面^[4-8]。微生物菌剂根据形态可分为液体微生物菌剂和固体微生物菌剂两种。相较液体菌剂，固体菌剂具有包装成本低、容易运输、菌含量高、常温保存不易失活、菌群含量全、与复合酶制剂结合效果优、使用方便、可高温制粒、方便自动供料系统大规模运用等诸多优势。【前人研究进展】目前常用的微生物菌剂的固定化载体主要包括有机载体和无机载体，如蛭石、沸石、活性炭、硅藻土、玉米粉、豆粕等。不同的载体，性能不一，根据不同的菌剂，吸附固定化效果亦不同。因此，选择合适的载体至关重要。王微等^[9]利用硅藻土作为吸附剂，获得了性能较好的微生物菌剂；赵旭等、高书锋等^[10-11]分别试验了谷糠、炉渣等作为功能性微生物载体的可行性。麦饭石具有双重的吸附性：一方面是因为它以硅酸盐为主，具有很好的吸附性；另一方面由于麦饭石多含高岭石等黏土矿物，是多孔性海绵状特殊结构，有强烈的静电引力^[12]，因此在吸附方面具有重要应用价值。改性麦饭石是通过各种理化方法对麦饭石结构、空隙等进行疏通，提高麦饭石比表面积、孔隙度，进一步提升其吸附能力。陈丽红等^[13]采用覆膜法对麦饭石进行改性，研究其对重金属Cd的吸附性能，结果表明，改性麦饭石较天然麦饭石吸附效率提高了3.5倍。陈琳荔等^[14]采用稀土对麦饭石进行改性，发现稀土改性麦饭石的氨氮和总磷去除率分别达到89%和75%，远高于未改性的麦饭石。固定化载体改性的主要方法有无机酸、碱和无机盐改性。通过物理化学反应及离子交换的作用，麦饭石载体的比表面积及孔径得以增大，为固定化微生物提供更大的空间。张琪^[15]对天然沸石、白沸石、红外线环进行改性，发现天然沸石在0.6 mol·L⁻¹的NaCl溶液中改性2 h后，吸附菌体干重效果最好。纳豆芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌纳豆菌的亚种，具有广谱的抗菌活性和极强的抗氧化能力，同时还有一定的耐酸和耐热特性，可以调节肠道菌群增加细胞的免疫反应。此外，它生成的多种蛋白酶，特别是碱性蛋白酶、糖化酶、脂肪酶等营养物质，都能够增强机体内分泌代谢，有利于营养物质的吸收，可预防疾病的发生，起到保健效果。【本研究切入点】课题组在前期研究中，发现麦饭石作为纳豆芽胞杆菌的固定化载体具有较好的吸附效果^[16]，因此试图通过对麦饭石改性来进一步提升麦饭石的菌剂吸附能力。【拟解决的关键问题】本研究以麦饭石为固定化载体，通过不同酸碱、无机盐等条件对其进行改性，以期提高该载体的吸菌量。同时通过添加不同保护剂（葡萄糖、淀粉、糊精）考察固化菌剂的保藏期，为麦饭石作为高效菌剂载体提供技术支持，同时为纳豆芽胞杆菌固体菌剂的规模化生产与应用奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   菌剂及载体

纳豆芽胞杆菌（Bacillus natto）由某单位分离保藏；麦饭石经0.4 mm筛网分筛121 ℃高温高压灭菌30 min后，烘干备用。

1.1.2   培养基

液体发酵培养基：葡萄糖15 g·L⁻¹、大豆蛋白胨10 g·L⁻¹、（NH₄）₂SO₄ 5 g·L⁻¹、Na₂HPO₄ 1 g·L⁻¹、NaH₂PO₄ 1 g·L⁻¹、NaCl 5 g·L⁻¹、FeCl₂ 0.02 g·L⁻¹、MgCl₂ 0.2 g·L⁻¹、MnCl₂ 0.15 g·L⁻¹和CaCl₂ 0.2 g·L⁻¹，初始pH 7的培养基，培养温度37 ℃，接种量4%。固体培养基：蛋白胨 10 g·L⁻¹，牛肉膏 10 g·L⁻¹，酵母粉 5 g·L⁻¹，琼脂 15～20 g·L⁻¹。

用平板菌落计数法检测有效活菌数。

1.2   试验方法

1.2.1   纳豆芽胞杆菌发酵条件优化

为提高纳豆芽胞杆菌液体发酵有效活菌数，本文对影响发酵的重要因素（温度、pH）进行优化。将活化的纳豆芽胞杆菌，按2%接种量接种到液体发酵培养基中，35 ℃、pH 7.0、150 r·min⁻¹ 条件下进行发酵培养18 h（对数生长末期），取样测定发酵有效活菌数。温度分别设为30、35、40、45，50 ℃；pH设置为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5等7个梯度；每组设置3个平行，分别测定相应有效活菌数。

有效活菌数检测：采用平板计数法，分别称取菌剂（液体1mL/固体1 g），用无菌水进行逐级稀释，涂布板，测定其有效活菌数；每个样品重复3次，3次测得的总菌数除以菌液体积或载体质量，即为单位体积或单位载体的吸菌量。

1.2.2   麦饭石载体改性方法

称取0.4 mm筛网分筛的天然沸石100 g（灭菌），在500 mL浓度为0.1～3.0 mol·L⁻¹的无菌NaCl、HCl、H₂SO₄和NaOH溶液中浸泡1 h，无菌纱布过滤，烘干至恒重，备用。

1.2.3   菌剂吸附固定化方法

将发酵好的20 mL纳豆芽孢杆菌菌液，与20 g改性麦饭石混匀，于转速150 r·min⁻¹摇床上进行震荡吸附60 min，静置30 min，倒去上清，再于40 ℃下恒温干燥至恒重，即得固化菌剂。每个处理3次重复，对分别获得的初产品进行取样，检测有效活菌数。

1.2.4   保护剂对固化菌剂保藏期的影响

将1 g保护剂（葡萄糖、淀粉、糊精）溶解于10 mL无菌水中，与50 g固体纳豆芽胞杆菌菌剂混匀（保护剂∶菌剂=1∶50），再于40 ℃下恒温干燥至恒重。对获得的固化菌剂，分别在1、2、3、4、5、6月取样测定有效活菌数。

2.   结果与分析

2.1   温度对纳豆芽胞杆菌生长的影响

为了研究适宜纳豆芽孢杆菌生长的最佳温度，在pH 7.0、150 r·min⁻¹ 条件下，设置温度分别为30、35、40、45，50 ℃进行发酵培养18 h（对数生长末期）。由图1 可以看出，不同温度下，纳豆芽胞杆菌培养至对数生长末期，进入稳定期后，有效活菌数各不相同，随着培养温度升高（25～40 ℃），有效活菌数逐渐升高，当培养温度为40 ℃时，有效活菌数达到最大值12.88×10⁸ CFU·mL⁻¹。之后随温度继续升高（40～50 ℃），有效活菌数逐渐降低，由此可见，纳豆芽胞杆菌最适培养温度为40 ℃。

图  1  不同培养温度对纳豆芽胞杆菌有效活菌数的影响

Figure  1.  Effect of culture temperature on viable B. natto count

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2.2   pH对纳豆芽胞杆菌生长的影响

为了研究适宜枯草芽孢杆菌生长的最佳pH值，将菌液pH值分别调节为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5等7个梯度，分别放入最适培养温度为40 ℃的震荡摇床中培养至对数生长末期（18 h），测其有效活菌数。pH对纳豆芽孢杆菌生长的影响如下图2所示。随着培养pH升高（5.5～7.5），有效活菌数逐渐升高，当培养pH为7.5时，有效活菌数达到最大值13.68×10⁸ CFU·mL⁻¹。之后随pH继续升高（7.5～8.5），有效活菌数逐渐降低，由此可见，纳豆芽胞杆菌最适培养pH为7.5。

图  2  不同培养pH对纳豆芽胞杆菌有效活菌数的影响

Figure  2.  Effect of pH on viable B. natto count

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2.3   不同改性剂及浓度对载体吸菌效果的影响

采用不同浓度改性剂（酸、 碱、 盐）对麦饭石进行处理，考察改性后的麦饭石对纳豆芽胞杆菌的吸附效果，结果如图3所示。

图  3  不同改性剂及浓度对纳豆芽胞杆菌吸附效果的影响

Figure  3.  Adsorption of maifanshi affected by type and concentration of modifiers

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由图3可知，在低浓度改性剂条件下（小于0.5 mol·L⁻¹），纳豆芽孢杆菌的吸附有效活菌数随着浓度升高，呈逐渐增长趋势；究其原因，由于在较低的改性浓度下，天然麦饭石原本被堵塞的孔径，在改性剂的作用下，逐渐被打通，随着改性剂溶液浓度增加，改性效果渐好，吸附有效活菌数也随之增加；当改性剂浓度高于0.5 mol·L⁻¹时，吸附纳豆芽孢杆菌的有效活菌数随着改性剂浓度增加而逐渐减少，这可能是由于过高改性剂浓度对纳豆芽孢杆菌活性产生了抑制的缘故，因此当改性剂浓度超过一定值后，吸附的有效活菌数反而随浓度升高而降低。以未改性麦饭石为对照[（11.35±0.35）×10⁸ CFU·g⁻¹]，当改性剂浓度为0.5 mol·L⁻¹时，吸附纳豆芽孢杆菌有效活菌数均达到最大值，经氯化钠、盐酸、硫酸和氢氧化钠溶液改性后的麦饭石吸附最大有效活菌数分别13.17±0.44、12.6±0.33、12.7±0.38和11.9±0.42（×10⁸ CFU·g⁻¹）。其中，0.5 mol·L⁻¹氯化钠溶液改性的麦饭石，其吸附纳豆芽孢杆菌效果最好，吸附有效活菌数达到13.17±0.44（×10⁸ CFU·g⁻¹）。

2.4   改性前后吸附效果比较

由表1可以看出，未改性麦饭石吸附纳豆芽胞杆菌有效活菌数为11.35±0.35（×10⁸ CFU·g⁻¹），吸附率83%；而经过0.5 mol·L⁻¹ NaCl溶液改性的麦饭石有效活菌数达到了13.17±0.44（×10⁸ CFU·mL⁻¹），吸附率达96.3%，相比未改性前，吸附率提高了13.3%。究其原因，多孔性海绵结构的麦饭石经NaCl溶液改性后，空隙打开，比表面积增大，加之麦饭石较强的静电吸附力，从而进一步提高了其吸菌效率。由此可见，改性麦饭石在微生物固体菌剂制备中具有重要应用价值。

表  1  麦饭石改性前后吸附效果比较

Table  1.  Maifanshi adsorption property after modification treatments

项目 Item	天然麦饭石 Natural Maifan stone	改性麦饭石 Modified Maifan stone
改性条件 Modification conditions	未改性 Unmodified	0.5 mol·L−1 NaCl溶液 0.5 mol·L−1 NaCl solution
吸附有效活菌数 Amount of bacteria absorbed/ （×108 CFU·g−1）	11.35±0.35	13.17±0.44
初始纳豆芽胞杆菌 Bacillus natrius/ （×108 CFU·mL−1）	13.68	13.68
吸附率 Adsorption rate/%	83	96.3
注：数据为平均值 ± 标准差。 Note: Data are mean±standard deviation.

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2.5   载体固定化微生物

为更直观地反映麦饭石改性前后对纳豆芽孢杆菌吸附效果的影响，通过扫描电镜观察麦饭石表面结构变化，如图4所示。2500倍扫描电镜下可以清晰的看出，与未改性麦饭石（图4-A）相比，改性后的麦饭石（图4-B）表面去除了许多细小颗粒、杂质，大量的空隙被疏通，极大提高了载体孔隙度和比表面积。改性麦饭石吸附菌液后（图4-C），观察到载体大量空隙被纳豆芽胞杆菌充满，同时表面附着大量的纳豆芽孢杆菌，结合表1载体吸附率，进一步说明改性麦饭石具有更强的吸菌能力。

图  4  吸附纳豆芽胞杆菌在扫描电镜下观察图

注：A为改性前；B为改性后；C为改性吸附后。

Figure  4.  Scanning electron microscope images of B. natto on maifanshi

Note: A: unmodified; B: modified; C: adsorption after modification.

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2.6   保护剂对固化菌剂保藏期的影响

固态菌剂保藏费用低、可以直接投入发酵，且在运输和贮藏、质量控制等方面有其独特的优势。本文考察了3种保护剂（糊精、葡萄糖、淀粉）在纳豆芽胞杆菌固体菌剂中的应用效果。结果如图5所示，未添加保护剂的对照组在整个保藏期内，菌剂有效活菌数始终低于同时期的试验组（2%糊精、2%葡萄糖、2%淀粉）。菌剂保藏第一个月，添加保护剂的试验组，有效活菌数均有不同程度提高，尤其是葡萄糖作为保护剂时，有效活菌数达到13.65×10⁸ CFU·g⁻¹，而对照组略有下降；从第二个月开始，随着保藏期的延长，有效活菌数均呈下降趋势，保藏至6个月时，对照组、糊精、葡萄糖、淀粉有效活菌数分别为2.91、4.1、5.42、4.63（×10⁸ CFU·g⁻¹），活菌数残留率为初始活菌数的22%、31%、41%、35%。与对照组相比，添加不同保护剂均有效提高了活菌数的残留率，其中添加葡萄糖保护剂的有效活菌数残留率提高了1.86倍。由此可见，保护剂的添加，对纳豆芽胞杆菌固体粉剂的保藏具有重要影响。

图  5  不同保护剂对纳豆芽胞杆菌有效活菌数的影响

Figure  5.  Effects of protectants on viable B. natto count

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3.   讨论与结论

本研究首先对纳豆芽胞杆菌的液体培养条件进行初步研究，确定其最适培养温度为40 ℃，最适培养pH为7.5，在150 r·min⁻¹ 条件下进行发酵培养18 h（对数生长末期），有效活菌数可达13.68×10⁸ CFU·mL⁻¹。其次，在不同改性条件下，对麦饭石进行处理，确定了经0.5 mol·L⁻¹ NaCl溶液改性后麦饭石吸附纳豆芽胞杆菌效果最好，有效活菌数达13.17×10⁸ CFU·g⁻¹，相比未改性前，吸附率提高了13.3%。最后，考察不同保护剂对纳豆芽胞杆菌固体粉剂保藏期的影响，确定2%的葡萄糖保护剂效果最好，经过6个月保藏期后，其有效活菌数5.42×10⁸ CFU·g⁻¹，有效活菌数残留率达41%，是对照组的1.86倍。

麦饭石表面带有大量阳离子，具有强烈静电引力及离子交换功能；氯化钠溶液作为改性剂，通过钠离子交换，改变了麦饭石表面结构中的阳离子，使麦饭石静电场加强，从而增强了对芽胞杆菌的吸附能力。另外，由于强酸强碱环境会杀死或抑制微生物生长，而偏中性的氯化钠更适合微生物生长，因此，同浓度下盐（氯化钠）改性效果始终高于酸碱（盐酸、硫酸、氢氧化钠）。此外葡萄糖保护剂效果优于糊精及淀粉，究其原因，首先葡萄糖作为小分子保护剂，具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键，在干燥过程中，可与芽胞杆菌菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构域功能的完整性^[17]，其次葡萄糖可作为碳源直接被微生物吸收利用，为微生物提供一定的营养，保证芽胞杆菌在干燥的保藏环境中仍能维持一定的生长，使其保藏初期固体菌剂有效活菌数有一定幅度的提升，同时在整个保藏期内维持着一定的养分水平，使其活菌数残留率相比对照组明显提升。

有鉴于改性麦饭石对其吸附能力的巨大潜力，在本研究的基础上考虑进一步采用热改性、MnO₂改性、稀土镧改性等方法，进一步提升麦饭石吸附能力，制备高效的微生物固体粉剂，同时可用于农牧渔业，医药卫生及食品酿造业等，也可用于日用化学，环境保护等方面，提高其市场应用潜力。