Preparation and Application of Rabbit Polyclonal Antibodies against Elizabethkingia meningosepticum on Frogs
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摘要:目的 制备蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体，建立间接ELISA检测方法，进行病原菌在宿主体内的示踪研究，为病原菌的致病机理研究奠定基础。方法 将分离自患歪头病的棘胸蛙的脑膜脓毒性伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningosepticum）RsB1151018NA甲醛灭活后，免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。通过优化反应条件，建立脑膜脓毒性伊丽莎白菌间接ELISA的检测方法；兔抗血清多克隆抗体采用Protein A亲和层析柱分离纯化，以异硫氰酸荧光素（FITC）标记，标记后的抗体与感染RsB1151018NA的棘胸蛙不同脏器组织的冷冻切片反应，荧光显微镜观察，跟踪RsB1151018NA在棘胸蛙体内的迁移。结果 试验结果表明，制备的兔抗棘胸蛙脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体血清效价为1∶5.12×105，纯化后的抗体效价为1∶1.6×104，且建立的间接ELISA方法检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌具有高度特异性，与其他水产常见病原菌没有交叉反应，检测灵敏度为1.0×104 CFU·mL−1。脑膜脓毒性伊丽莎白菌在棘胸蛙体内随血液循环而分布至全身，可侵袭肌肉、肝脏、肾脏、脾脏、肠道、心脏、眼和脑等组织器官，肾脏、眼和脑感染程度最严重，推测这三个组织器官是其靶器官；创伤感染是可能的感染途径之一。结论 建立的检测方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌，对蛙类歪头病的防控和早期诊断可提供理论参考依据；另外利用免疫荧光检测病原菌在宿主体内的迁移，研究病原的致病机理及发病过程等，能为防治药物的研发和防治方法的确定提供理论依据。
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关键词:
- 脑膜脓毒性伊丽莎白菌 /
- 多克隆抗体 /
- 酶联免疫反应 /
- 检测 /
- 蛙“歪头病”
Abstract:Objective Rabbit polyclonal antibodies against Elizabethkingia meningosepticum (Em) were prepared to establish an indirect ELISA detection to trace the pathogenic attack in organs of frogs (Rana spp).Method The strain RsB1151018NA of Em from a diseased R. spinosa was isolated, formalin-inactivated, and injected into a rabbit for the serum preparation. An optimized indirect ELISA using the rabbit polyclonal antibodies was developed for tracing RsB1151018NA. The rabbit immunoglobulin G was purified on a protein A column. The purified antibodies were marked with FITC and further purified on a desalting column Sephadex G-25 for subsequently tracing the pathogen in organs of the inoculated frogs.Results The obtained rabbit polyclonal antibodies showed a titer up to 1 ∶ 5.12×105, and 1 ∶ 1.6×104 after purification. The indirect ELISA assay on the polyclonal antibody was specific and sensitive in detecting Em without cross-reaction on other bacteria. It had a detection limit of 1.0×104 cfu·mL−1. According to the in vivo tracing test, RsB1151018NA distributed throughout the entire frog body by blood circulation with the most serious infections in the kidney, eyes, and brain.Conclusion The optimized indirect ELISA detection of Em was rapid, sensitive, and specific in tracing the bacterial infection on R. spp. It was considered applicable for early diagnosis of the “crooked-head disease” and breeding of healthy frogs for food and medicine. -
0. 引言
【研究意义】海带（Laminaria japonica Aresch）又名纶布、昆布，素有“海上之蔬”、“含碘冠军”的美誉，是我国重要的经济海藻，产量位居世界首位[1]。海带虽然价格低廉，但富含碘、甘露醇、维生素A、维生素B族、维生素C、牛磺酸、多糖等功效成分[2]，海带含有多种生物活性物质，如海带多糖、昆布氨酸、牛磺酸等，其中海带多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血脂（糖）等独特的功效，在食品、医药、化妆品、农业等方面都具有广阔的应用前景[3-4]。采用自然日晒方法将海带加工成干制品是海带加工的主要方式，但自然日晒方法受自然环境因素的影响，存在易霉变及活性成分损失大等问题，成品品质良莠不齐。因此研发可提高海带干制品质量的现代干燥技术具有重要意义。【前人研究进展】干燥方法会影响干制产品的质量，同样的原料采用不同的干燥方法可以生产出品质完全不同的产品[5]。微波具有穿透性，因此真空微波干燥技术可以有效控制生鲜食品干燥过程的干缩，提高干制品的复水速率和复水比[6]，减少多糖等功效成分的损失，并提高其抗氧化活性[7]；微波辅助提取技术也可以提高多糖等功效成分的提取率[8]；而且不同的微波功率密度对于物料干燥特性和蛋白质等营养成分保留率都有较大的影响[9-10]。【本研究切入点】已有研究表明微波处理可以提高海带多糖的提取率[11]，而且真空微波应用于海带干燥加工可以有效改善干制品的复水性等品质指标[6]；然而关于干燥加工，特别是不同微波功率密度的真空微波干燥对海带多糖的影响还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用自然日晒、热风干燥、真空干燥，以及两种不同微波功率密度真空微波-真空组合干燥5种方法对新鲜海带进行干燥，研究不同干燥方法对海带多糖的得率及其特性的影响，旨在为获取高品质海带的干燥方法提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
新鲜海带由莆田市后海垦区现代农业发展有限公司提供。
1.2 仪器与设备
RX-16ZK多功能真空微波干燥箱（带电热管加热功能，广州荣兴工业微波设备有限公司产品），DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），NDJ-8S 型数显黏度计（上海菁海仪器有限公司），UV-1900紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）等。
1.3 试验方法
1.3.1 原料处理
新鲜海带用自来水洗净，切除根部及周边较薄部分，切成1 cm×5 cm规格的海带条，沥去表面水分后用保鲜袋包装，置于5℃冰箱冷藏备用。
1.3.2 干燥试验
（1）2 W·g−1真空微波-真空组合干燥（VM-VD1）
2 000 g鲜海带条以厚度约0.6 cm薄层平铺于带硅胶垫的聚四氟乙烯盘内，在微波功率4 kW、压力−0.085～−0.090 MPa、温度（50±2）℃条件下干燥至海带条含水量30%左右，关闭微波，开启电热管，继续在压力−0.085～−0.090 MPa、电热管功率8 kW、温度（60±2）℃条件下干燥至终点。
（2）4 W·g−1真空微波-真空组合干燥（VM-VD2）
微波功率改为8 kW，其余同1.3.2（1）。
（3）真空干燥（VD）
2 000 g鲜海带条以厚度约0.6 cm薄层平铺于带硅胶垫的聚四氟乙烯网盘上，在压力−0.085～−0.090 MPa、电热管功率8 kW、温度（60±2）℃条件下干燥至终点。
（4）热风干燥（AD）
2 000 g鲜海带条以厚度约0.6 cm薄层平铺于带硅胶垫的聚四氟乙烯网盘上，置于预热到设定温度的恒温鼓风干燥箱内，在温度（60±1）℃、开启鼓风开关的条件下干燥至终点。
（5）自然日晒（ND）
2 000 g鲜海带条以厚度约0.6 cm薄层平铺于带硅胶垫的聚四氟乙烯网盘上，白天置于阳光强烈照射的通风处，夜晚收至室内，晒3 d后至终点。
1.3.3 海带粉制备
海带条水分含量低于8%为干燥终点，将不同干燥方法制备的干海带条粉碎至80目备用。
1.3.4 试验指标及测定方法
（1）海带多糖制备及多糖得率测定
海带多糖的提取参考余华等的方法[12]，称取一定重量的海带粉，加25倍蒸馏水于90℃水浴提取6 h，混合液冷却后5 000 r·min−1离心15 min，沉淀中加入海带粉15倍蒸馏水重复提取1次，合并上清液，浓缩至原体积的1/5，加入浓缩液5倍体积的95%乙醇，5℃静置过夜，5 000 r·min−1离心5 min，沉淀冷冻干燥得到海带粗多糖。海带粗多糖用蒸馏水配制成2.0 mg·mL−1的海带粗多糖溶液备用。
多糖含量采用苯酚-硫酸比色法[13]测定。吸取l.0 mL海带粗多糖溶液于具塞试管中，加入1.0 mL 6%苯酚溶液，摇匀后加入5.0 mL浓硫酸，混匀后沸水浴10 min，冷却至室温，于490 nm处测吸光值。以葡萄糖标准品作标准曲线，计算多糖含量。
海带多糖得率（%）＝海带粗多糖质量海带干粉质量×多糖含量×100% （2）海带多糖硫酸根含量的测定
采用明胶-氯化钡法测量[14]。称取一定重量的冻干海带粗多糖样品（约20 mg），加入15 mL浓HCl和4.5 mL浓HNO3硝化至微黄色止，消化液定容到50 mL，取2.5 ml硝化液，加入2.5 ml 明胶-氯化钡溶液混匀，静置15 min，于360 nm处测定吸光值。以硫酸钾标准品作标准曲线，计算海带多糖样品中硫酸根含量。
（3）海带多糖黏度的测定
用蒸馏水配制20.0 mg·mL−1的海带粗多糖溶，在20±2℃条件下，选用旋转黏度计2号转子，转速30 r·min−1测定海带多糖黏度。
（4）海带多糖清除羟自由基（·OH）活性的测定
参考孙玉军等的方法[15]，在4 mL海带多糖溶液中，分别加入9 mmol·L−1 FeSO4、9 mmol·L−1水杨酸-乙醇溶液和8.8 mmol·L−1 H2O2各0.5 mL，在37℃下反应0.5 h，以蒸馏水代替海带多糖溶液作为空白对照，于510 nm波长处测吸光度值。
清除率计算公式：
⋅OH清除率（%）=A0−AA0×100% 式中：A0
为空白对照管的吸光度值； A为样品管的吸光度值。
（5）海带多糖清除超氧阴离子自由基（O2−·）活性的测定
参考孙玉军等的方法[15]，吸取50 mmol·L−1、pH 8.0的Tis-HCl缓冲液4.5 mL，25℃水浴20 min，加入4.0 mL海带粗多糖溶液和0.1 mL 25 mmol·L−1邻苯三酚溶液（以10 mmol·L−1的HCl配制），混匀，25℃反应5 min，加入1 mL 8 mol·L−1HCl终止反应，以Tis-HCl缓冲液代替样品作为空白对照，在300 nm波长处测定吸光度值。
清除率计算公式：
O2−⋅清除率（%）=A0−AA0×100% 式中：A0空白对照管的吸光度值；
A为样品管的吸光度值。
1.3.5 统计分析
所有试验均重复3次，结果取平均值±标准差表示，采用Origin 8.5和SPSS 24软件进行数据处理。
2. 结果与分析
2.1 干燥方法对海带多糖得率的影响
不同干燥方法对海带多糖的得率（图1）有显著影响（P＜0.05）；多糖得率由小到大的顺序依次为：自然日晒、热风干燥、真空干燥、2 W·g−1真空微波-真空组合干燥、4 W·g−1真空微波-真空组合干燥。即采用自然日晒海带的多糖得率最低，为7.87%；而采用4 W·g−1真空微波-真空组合干燥海带的多糖得率最高，为13.83%。该结果表明，不同干燥方法会显著影响海带多糖的得率，其中自然日晒会导致海带多糖有较大的损失；而较高的微波功率密度（4 W·g−1）有利于提高海带多糖得率。
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图 1 干燥方法对海带多糖得率的影响注: 图柱顶部不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 1. Effect of drying methods on polysaccharide content in dried L. japonicaNote: Data with different lowercase letters on top of a column indicate significant differences among treatments at P＜0.05.2.2 干燥方法对海带多糖SO42−含量的影响
不同干燥方法对海带多糖SO42−含量的影响见图2。海带多糖SO42−含量由小到大的顺序依次为：自然日晒、热风干燥、真空干燥、4 W·g−1真空微波-真空组合干燥、2 W·g−1真空微波-真空组合干燥。采用自然日晒海带的多糖SO42−含量最低，为5.71%，明显低于其他方法干燥海带的多糖SO42−含量（P＜0.05）；而采用2 W·g−1真空微波-真空组合干燥海带的多糖SO42− 含量最高（8.79%），明显高于自然日晒、热风干燥和真空干燥的海带样品（P＜0.05），但与4 W·g−1微波功率密度的真空微波－真空组合干燥海带的多糖SO42−含量差异不显著（P＞0.05）。
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图 2 干燥方法对海带多糖SO42-含量的影响注：图柱顶部不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 2. Effect of drying methods on SO42− content of polysaccharide in dried L. japonicaNote: Data with different lowercase letters on top of a column indicate significant differences among treatments at P＜0.05.2.3 干燥方法对海带多糖黏度的影响
黏度可以粗略反映出多糖的组分及分子量情况，对于相同浓度的海带多糖溶液，多糖分子量大则其黏度高，反之则低。由图3可以看出，采用真空干燥和热风干燥海带的多糖黏度显著高于自然日晒和两种真空微波-真空组合干燥海带的多糖黏度（P＜0.05）；而采用4 W·g−1真空微波-真空组合干燥海带的多糖黏度最低。相对热风干燥和真空干燥，自然日晒海带的多糖黏度较低，说明海带在自然日晒过程中其多糖降解率较高；两种真空微波-真空组合干燥海带的多糖黏度较低，而且较高的微波功率密度（4 W·g−1）组合干燥海带的多糖黏度显著低于较低的微波功率密度（2 W·g−1）组合干燥海带的多糖黏度（P＜0.05），说明微波干燥会导致海带多糖的降解，而且微波功率密度越高其降解作用越强。
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图 3 干燥方法对海带多糖黏度的影响注：图柱顶部不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 3. Effect of drying method on viscosity of polysaccharides in dried L. japonicaNote: Data with different lowercase letters on top of a column indicate significant differences among treatments at P＜0.05.2.4 干燥方法对海带多糖体外抗氧化活性的影响
不同干燥方法对海带多糖清除羟自由基和超氧阴离子自由基活性的影响分别见图4和图5。其清除率由大到小的顺序均为：2 W·g−1真空微波-真空组合干燥、4 W·g−1真空微波-真空组合干燥、真空干燥、热风干燥、自然日晒。该结果表明，干燥方法对海带多糖的体外抗氧化活性有显著的影响（P＜0.05）；自然日晒会导致海带多糖的体外抗氧化活性大幅降低；相对于热风干燥，真空干燥可减缓海带多糖体外抗氧化活性的损失；真空微波-真空组合干燥海带多糖的体外抗氧化活性较高，而且较高的微波功率密度（4 W·g−1）干燥的海带多糖体外抗氧化活性较低（P＜0.05），说明较高的微波功率密度会造成海带多糖体外抗氧化活性的损失。
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图 4 干燥方法对海带多糖清除羟自由基（·OH）能力的影响注：图柱顶部不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 4. Effect of drying methods on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharide in dried L. japonicaNote: Data with different lowercase letters on top of a column indicate significant differences among treatments at P＜0.05.![]()
图 5 干燥方法对海带多糖清除超氧阴离子自由基（O2−·）能力的影响注：图柱顶部不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 5. Effect of drying methods on superoxide anion radical scavenging activity of polysaccharide in dried L. japonicaNote: Data with different lowercase letters on top of a column indicate significant differences among treatments at P＜0.05.3. 讨论与结论
多糖是生物体内普遍存在的一类生物大分子，具有特殊的生物活性；干燥过程会导致多糖的损失，而且干燥温度越高、时间越长，损失率越高[16]。自然日晒海带的多糖得率、SO42−含量、黏度和体外抗氧化活性低于热风干燥和真空干燥样品，应该是由于受阳光中紫外线及环境中微生物等因素的影响而导致海带多糖发生降解所致。相对于热风干燥，真空干燥可保持海带较低的品温，从而减少多糖的损失；段梦颖等[17]研究也发现真空干燥的聚合草多糖得率、SO42−含量、黏度均高于热风干燥样品。真空微波-真空组合干燥海带的多糖得率、SO42−含量和抗氧化活性较高，而黏度较低，这可能是由于微波干燥时间短，多糖损失少，但微波对多糖具有降解作用所致[18]。对于两种不同微波功率密度的真空微波-真空组合干燥，增大微波功率密度虽然可以提高海带多糖的得率，但也会降低多糖的SO42−含量、黏度和体外抗氧化活性，这是由于较高的微波功率密度对海带细胞结构的破坏作用较强，有利于胞内多糖的溶出[19]，从而提高其得率，但也会导致海带多糖因过度降解而损失。
从海带中提取的粗多糖主要包括褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉，其中褐藻糖胶是一种硫酸多糖，也是海带多糖中主要的生物活性成分[20]，因此硫酸根含量是考察海带多糖生物活性的重要指标之一[21]。此外，多糖的生物活性与其分子量及其分布有关[22]，而黏度可以粗略地反映出多糖的组分及分子量情况。多糖分子量大则黏度高，而黏度过高不利于多糖在体内的扩散和吸收，会降低其生物活性，因此对多糖进行适度降解，有利于提高其生物活性[23]。
真空微波-真空组合干燥技术可以有效减少干燥过程海带多糖的损失，但微波会导致海带多糖的降解，而且微波功率密度越高，其降解作用越强。因此，只有适宜微波功率密度的真空微波－真空组合干燥才是生产高品质海带干制品的有效途径。
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图 1 兔抗血清亲和层析纯化图谱
Figure 1. Chromatography of polyclonal antibody purified by protein A affinity method
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图 2 兔抗血清纯化效果分析
注：1：蛋白marker 2：纯化抗体。
Figure 2. SDS-PAGE analysis on purified polyclonal antibody
Note: Lane l: protein marker; Lane 2: purified polyclonal antibodies.
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图 3 Sephadex G-25脱盐柱纯化FITC标记抗体
Figure 3. Purification of IgG-FITC-marked antibodies with desalting column Sephadex G-25
表 1 用于抗体特异性测定的菌株
Table 1 Bacterium used for ELISA detection
菌株
Strain细菌种类
Bacterial speciesLCCiL90625NA-C 脑膜脓毒性伊丽莎白菌 E. meningosepticum ATCC13525 荧光假单胞菌 Pesudomonas fluorescens ATCC9027 铜绿假单胞菌 P. aeruginosa ML316 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila Ah0081 嗜水气单胞菌 A. hydrophila Ac60324 豚鼠气单胞菌 A. caviae 96-5 温和气单胞菌 A. sobria Fp60325NA 温和气单胞菌 A. sobria LCCiL90625NA 类志贺邻单胞菌 Plesiomonas shigelloides ATCC17802 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus FJ04-L1 创伤弧菌 V. vulnificus Js60517NA1 溶藻弧菌 V. alginolyticus AL60306NA1 迟缓爱德华氏菌 Edwardsiella tarda 
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表 2 兔抗多克隆抗体血清效价分析
Table 2 Titer of polyclonal antibody against Em
样品 Samples OD450 结果判定 Result 空白血清 0.1919 NC 1∶500 2.968 + 1∶2000 2.907 + 1∶8000 2.889 + 1∶32000 2.885 + 1∶128000 2.547 + 1∶512000 1.201 + 1∶2048000 0.36 − 注：NC，阴性对照，“+”表示阳性，“−”表示阴性，S/N≥2.1为阳性。
Note：“NC”indicates negative control, “+” indicates positive,“−” indicates negative, S/N≥2.1 represent for positive.
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表 3 兔多抗检测灵敏度分析
Table 3 Sensitivity of indirect ELISA assay in detecting RsB1151018NA
包被含量
Coating concentration/CFU·mL−1P/N 结果判定
Result阴性对照 1 − 1×108 42.1 + 1×107 18.2 + 1×106 7.58 + 1×105 5.06 + 1×104 3.38 + 1×103 1.66 − 注：“+”表示阳性，“−”表示阴性。
Note: +: positive; −: negative.
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表 4 纯化后抗体效价分析测定
Table 4 Titer of purified polyclonal antibody against Em
样品 Samples OD450 结果判定 Result 1︰500 2.779 + 1︰1 000 2.284 + 1︰2 000 1.963 + 1︰4 000 1.482 + 1︰8 000 1.067 + 1︰16 000 0.643 + 1︰32 000 0.415 − 空白血清 0.268 NC 注：NC，阴性对照，“+”表示阳性，“−”表示阴性，S/N≥2.1为阳性。
Note: NC: negative control; +: positive; −: negative; S/N≥2.1 indicates positive.
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表 5 多克隆抗体检测特异性分析
Table 5 Specificity of polyclonal antibody against RsB1151018NA
菌株
Strain细菌种类
Bacterial speciesOD450 nm 判定结果
ResultRsB11518018NA 脑膜脓毒性伊丽莎白菌
E.meningosepticum0.362 + LCCiL90625NA-C 脑膜脓毒性伊丽莎白菌
E. meningosepticum0.335 + ATCC13525 荧光假单胞菌
Pesudomonas fluorescens0.197 − ATCC9027 铜绿假单胞菌
P. aeruginosa0.192 − ML316 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 0.186 − Ah0081 嗜水气单胞菌
A. hydrophila0.185 − Ac60324 豚鼠气单胞菌
A. caviae0.187 − 96-5 温和气单胞菌
A. sobria0.190 − Fp60325NA 温和气单胞菌
A. sobria0.193 − LCCiL90625NA 类志贺邻单胞菌
Plesiomonas shigelloides0.187 − ATCC17802 副溶血弧菌
Vibrio parahaemolyticus0.194 − FJ04-L1 创伤弧菌
V. vulnificus0.189 − Js60517NA1 溶藻弧菌
V. alginolyticus0.195 − AL60306NA1 迟缓爱德华氏菌
Edwardsiella tarda0.208 − 阴性对照 5% 脱脂奶粉
5%dried separated milk0.106 NC 注：“+”表示阳性，“−”表示阴性
Note: +: positive; −: negative.
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表 6 FITC标记抗体效价测定
Table 6 Titer of purified IgG-FITC antibodies against Em
样品 Samples OD450 结果判定 Result 1∶50 2.287 + 1∶100 1.906 + 1∶200 1.617 + 1∶400 1.225 + 1∶800 0.781 + 1∶1600 0.567 + 1∶3200 0.342 − 空白血清 Blank serum 0.191 NC 注：NC，阴性对照，“+”表示阳性，“−”表示阴性，S/N≥2.1为阳性。
Note: NC: negative control; +: positive; −: negative; S/N≥2.1 indicates positive.
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表 7 RsB1151018NA体内示踪结果
Table 7 In vivo tracing of RsB1151018NA in frog
时间
Time/h菌数对数（lgN） 肌肉
Muscle血液
Blood肝脏
Liver肾脏
Kidney脾脏
Spleen心脏
Heart肠道
Intestinal眼
Eye脑
Brain6 1.18 0.89 0.41 0.62 0.00 0.66 0.00 0.00 0.00 12 1.08 0.85 0.51 0.93 0.26 0.64 0.00 0.00 0.00 24 0.92 0.83 0.68 1.20 0.41 0.56 0.56 0.41 0.56 36 0.83 0.91 0.75 1.23 0.53 0.45 0.64 0.58 0.83 48 0.41 0.88 0.81 1.16 0.51 0.30 0.51 0.68 0.92 60 0.00 0.83 0.53 0.82 0.45 0.48 0.48 0.72 0.89 72 0.00 0.81 0.30 0.38 0.00 0.00 0.48 0.78 0.90
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