• 中文核心期刊
  • CSCD来源期刊
  • 中国科技核心期刊
  • CA、CABI、ZR收录期刊

蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体的制备及应用

张新艳, 曾占壮, 叶小军, 卓玉琛, 钟全福, 余培建

张新艳,曾占壮,叶小军,等. 蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体的制备及应用 [J]. 福建农业学报,2021,36(7):785−792. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.07.008
引用本文: 张新艳,曾占壮,叶小军,等. 蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体的制备及应用 [J]. 福建农业学报,2021,36(7):785−792. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.07.008
ZHANG X Y, ZENG Z Z, YE X J, et al. Preparation and Application of Rabbit Polyclonal Antibodies against Elizabethkingia meningosepticum on Frogs [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2021,36(7):785−792. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.07.008
Citation: ZHANG X Y, ZENG Z Z, YE X J, et al. Preparation and Application of Rabbit Polyclonal Antibodies against Elizabethkingia meningosepticum on Frogs [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2021,36(7):785−792. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.07.008

蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体的制备及应用

基金项目: 福建省科技计划公益类专项(2019R1014-5);福建省海洋与渔业结构调整专项(闽财指[2017]1177号、闽财指[2018]829号)
详细信息
    作者简介:

    张新艳(1980−),女,硕士,高级工程师,研究方向:水产养殖动物病害(E-mail:swallowz47@163.com

    通讯作者:

    曾占壮(1972−),男,硕士,副研究员,研究方向:水产养殖动物病害(E-mail:zengzhanzhuang@126.com

  • 中图分类号: S 947

Preparation and Application of Rabbit Polyclonal Antibodies against Elizabethkingia meningosepticum on Frogs

  • 摘要:
      目的  制备蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体,建立间接ELISA检测方法,进行病原菌在宿主体内的示踪研究,为病原菌的致病机理研究奠定基础。
      方法  将分离自患歪头病的棘胸蛙的脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningosepticum)RsB1151018NA甲醛灭活后,免疫新西兰大白兔制备兔抗血清。通过优化反应条件,建立脑膜脓毒性伊丽莎白菌间接ELISA的检测方法;兔抗血清多克隆抗体采用Protein A亲和层析柱分离纯化,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记,标记后的抗体与感染RsB1151018NA的棘胸蛙不同脏器组织的冷冻切片反应,荧光显微镜观察,跟踪RsB1151018NA在棘胸蛙体内的迁移。
      结果  试验结果表明,制备的兔抗棘胸蛙脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体血清效价为1∶5.12×105,纯化后的抗体效价为1∶1.6×104,且建立的间接ELISA方法检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌具有高度特异性,与其他水产常见病原菌没有交叉反应,检测灵敏度为1.0×104 CFU·mL−1。脑膜脓毒性伊丽莎白菌在棘胸蛙体内随血液循环而分布至全身,可侵袭肌肉、肝脏、肾脏、脾脏、肠道、心脏、眼和脑等组织器官,肾脏、眼和脑感染程度最严重,推测这三个组织器官是其靶器官;创伤感染是可能的感染途径之一。
      结论  建立的检测方法能够快速、灵敏、特异地检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌,对蛙类歪头病的防控和早期诊断可提供理论参考依据;另外利用免疫荧光检测病原菌在宿主体内的迁移,研究病原的致病机理及发病过程等,能为防治药物的研发和防治方法的确定提供理论依据。
    Abstract:
      Objective  Rabbit polyclonal antibodies against Elizabethkingia meningosepticum (Em) were prepared to establish an indirect ELISA detection to trace the pathogenic attack in organs of frogs (Rana spp).
      Method  The strain RsB1151018NA of Em from a diseased R. spinosa was isolated, formalin-inactivated, and injected into a rabbit for the serum preparation. An optimized indirect ELISA using the rabbit polyclonal antibodies was developed for tracing RsB1151018NA. The rabbit immunoglobulin G was purified on a protein A column. The purified antibodies were marked with FITC and further purified on a desalting column Sephadex G-25 for subsequently tracing the pathogen in organs of the inoculated frogs.
      Results  The obtained rabbit polyclonal antibodies showed a titer up to 1 5.12×105, and 1 1.6×104 after purification. The indirect ELISA assay on the polyclonal antibody was specific and sensitive in detecting Em without cross-reaction on other bacteria. It had a detection limit of 1.0×104 cfu·mL−1. According to the in vivo tracing test, RsB1151018NA distributed throughout the entire frog body by blood circulation with the most serious infections in the kidney, eyes, and brain.
      Conclusion  The optimized indirect ELISA detection of Em was rapid, sensitive, and specific in tracing the bacterial infection on R. spp. It was considered applicable for early diagnosis of the “crooked-head disease” and breeding of healthy frogs for food and medicine.
  • 【研究意义】脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningosepticum),又称脑膜炎败血伊丽莎白菌,早期曾被称为脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)、脑膜炎败血黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum),为革兰氏阴性杆菌,广泛分布于河水、海水、土壤和医院等环境中,可引起人的败血症与脑膜炎,还能引起各器官感染性炎症,甚至是获得性骨髓炎等[1-6]。同时,脑膜脓毒性伊丽莎白菌还可对各种蛙类造成重大危害,引发蛙类“歪头病”,造成养殖蛙类的大量死亡,直接造成重大经济损失[7-12]。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将蛙脑膜炎败血金黄杆菌病列为三类动物疫病。同时该菌对其他水生动物也有一定的致病性[13-18]。鉴于此,有必要对其检测技术及在棘胸蛙体内的迁移规律进行研究,建立该病的早期诊断方法,初步掌握该病原菌的致病机理,为该病的防治提供技术支撑。【前人研究进展】 酶联免疫吸附试验(EILSA)敏感性高,操作简便,已广泛用于多种病原体的抗原或抗体的检测。多抗血清因其检测制备周期短且使用比较简单方便,检测的灵敏度较高,在水产类的细菌性疾病的诊断和流行病学调查中发挥了重要作用[19-28]。荧光素标记抗体(FA)是目前广泛应用于免疫病理、细胞化学、流式细胞学、病理学及自身抗体的临床免疫中的特异、灵敏、定性和定位相结合的免疫化学试剂[29-34]。【本研究切入点】国内外学者已开展关于脑膜脓毒性伊丽莎白菌引起的蛙类“歪头病”的研究,主要集中在PCR检测及传统的防治药物筛选,有关病原的免疫学检测及病原在宿主(蛙类)体内迁移规律及该菌对蛙类的致病机理的研究有待深入探讨。本研究通过制备蛙类脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体并建立检测方法,同时将制备的多克隆抗体进行荧光标记用于脑膜脓毒性伊丽莎白菌在蛙体内的示踪研究。【拟解决的关键问题】本研究拟建立能够快速、灵敏、特异地检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌的间接ELISA检测方法,对棘胸蛙歪头病的防控和早期诊断可提供理论参考依据;另外利用免疫荧光检测对病原菌在寄主体内的示踪,研究病原的致病机理及发病过程等,从而进一步掌握该病的发病规律,有助于对病害的诊断与防治提出更为有效的方法。

    脑膜脓毒性伊丽莎白菌菌株RsB1151018NA为本实验室分离自患“歪头病”的养殖棘胸蛙脑部,其他菌株为本实验室保存。

    新西兰大耳白兔 2 只,体重1.5 kg左右,经检疫无病原菌的一级动物,购于青岛康大生物科技有限公司。

    弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、四甲基联苯胺(TMB)、异硫氰酸荧光素(FITC)为美国 SIGMA 公司产品,ProteinA 亲和层析柱、Sephadex G-25柱、蛋白质量标准(Marker)为GE公司产品,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Goat anti rabbit IgG-HRP)为Thermo Scientific Pierce产品,其他试剂为国产分析纯。

    RsB1151018NA接种营养肉汤培养基,28 ℃、180 r·min−1振荡培养24 h,5 000 r·min−1离心10 min,弃上清,无菌PBS重悬菌体,再次离心收集菌体,4 %甲醛灭活,经涂布营养琼脂平板验证无活菌后离心弃上清,无菌PBS重悬菌体,超声波破碎菌体,12 000 r·min−1离心5 min,取上清得到抗原蛋白,蛋白定量,进行动物免疫。

    调整抗原蛋白含量,取免疫抗原与弗氏完全佐剂(基础免疫)或弗氏不完全佐剂(加强免疫)充分乳化,之后分别在兔的背部皮内多点注射。免疫两只兔子,共免疫5次,免疫量每次1 mg·只−1,每次免疫间隔20 d,第五次免疫后14 d取全血。静置30 min后3 000 r·min−1离心20 min,取上清即为多克隆抗体血清。

    调整抗原蛋白含量包被于96孔酶标板,0.1 µg·孔−1。以5%脱脂奶粉或1%BSA溶液封闭后备用。

    将兔抗血清稀释成:1∶500,1∶2 000,1∶8 000,1∶32 000,1∶16 000,1∶128 000,1∶512 000,1∶2 048 000,100 μL·孔−1用于ELISA检测。每个梯度设置2个平行组,以正常兔血清(免疫前的)1∶10 000稀释作为阴性对照。37 ℃孵育1 h,PBST清洗酶联反应孔。Goat anti rabbit IgG-HRP反应45 min,PBST清洗酶联反应孔。TMB显色10 min后加入50 μL H2SO4溶液(2 mol·L−1)终止反应。OD450 nm处测得光密度值并进行数据分析。

    脑膜脓毒性伊丽莎白菌间接ELISA检测方法的最适含量和反应条件采用方阵滴定法确定。特异性检测:取抗原蛋白及其他对照菌株(表1)蛋白包被于酶联反应孔中,封闭后用于抗体特异性测定。

    表  1  用于抗体特异性测定的菌株
    Table  1.  Bacterium used for ELISA detection
    菌株
    Strain
    细菌种类
    Bacterial species
    LCCiL90625NA-C 脑膜脓毒性伊丽莎白菌 E. meningosepticum
    ATCC13525 荧光假单胞菌 Pesudomonas fluorescens
    ATCC9027 铜绿假单胞菌 P. aeruginosa
    ML316 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila
    Ah0081 嗜水气单胞菌 A. hydrophila
    Ac60324 豚鼠气单胞菌 A. caviae
    96-5 温和气单胞菌 A. sobria
    Fp60325NA 温和气单胞菌 A. sobria
    LCCiL90625NA 类志贺邻单胞菌 Plesiomonas shigelloides
    ATCC17802 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus
    FJ04-L1 创伤弧菌 V. vulnificus
    Js60517NA1 溶藻弧菌 V. alginolyticus
    AL60306NA1 迟缓爱德华氏菌 Edwardsiella tarda
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    灵敏度检测:无菌生理盐水调整脑膜脓毒性伊丽莎白菌RsB1151018NA含量进行包被,稀释倍数从1×108 CFU·mL−1起,1%BSA封闭液封闭后,加入最适工作浓度兔抗脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体,进行间接ELISA法检测。以检测结果阳性的最小数值对应的菌体浓度为检测灵敏度。

    取10 mL兔血清用ProteinA 亲和层析柱进行抗体纯化,并进行SDS-PAGE分析其纯度。

    取6 mg抗体,用0.01 mol·L−1 PBS(pH7.4)透析,再用 0.1 mol·L−1 NaHCO3(pH9.5)调 pH 值至9.0,然后加入 FITC 混匀,避光反应 2 h,12 000 r·min−1高速离心5 min去除变性蛋白,用 Sephadex G-25 分离除去游离 FITC 并脱盐,监测回收第一峰即为 IgG-FITC 复合物。离心浓缩并冻干,使用0.01 mol·L−1PBS(pH7.4)缓冲液(含 1 %BSA,50 %甘油,0.03 %Proclin300)调整含量至2 mg·mL−1,500 μL·管−1分装。−20 ℃避光保存,避免反复冻融。

    菌株RsB1151018NA划线接种BHI平板,30 ℃培养24 h,以无菌生理盐水洗下菌苔制备菌悬液母液,平板活菌计数法计数。以无菌生理盐水稀释菌悬液母液至107 CFU·mL−1,背部皮下注射10只健康棘胸蛙,注射剂量为0.5 mL·只−1。试验持续3 d,其间水温保持18.5±1.0 ℃。于人工感染后的6、12、24、36、48、60、72 h,随机抽取试验蛙3只制备检测样本:无菌解剖试验蛙,分别取背部肌肉、肝脏、肾脏、脾脏、肠道、心脏、血液、眼、脑等器官组织,常规冷冻切片,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗脑膜脓毒伊丽莎白菌多克隆抗体与样本反应1 h,荧光显微镜观察。每个标本观察5个视野,以5个视野菌体数量平均值的对数绘制各器官组织中菌体数量动态变化曲线。

    抗体效价测定结果见表2,结果显示,兔抗多克隆抗体血清的效价达1∶5.12×105以上。

    表  2  兔抗多克隆抗体血清效价分析
    Table  2.  Titer of polyclonal antibody against Em
    样品 SamplesOD450结果判定 Result
    空白血清 0.1919 NC
    1∶500 2.968 +
    1∶2000 2.907 +
    1∶8000 2.889 +
    1∶32000 2.885 +
    1∶128000 2.547 +
    1∶512000 1.201 +
    1∶2048000 0.36
    注:NC,阴性对照,“+”表示阳性,“−”表示阴性,S/N≥2.1为阳性。
    Note:“NC”indicates negative control, “+” indicates positive,“−” indicates negative, S/N≥2.1 represent for positive.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    经方阵滴定法确定,抗原最适包被含量为1×107 CFU·mL−1,在加盖恒温箱中37 ℃包被过夜,用1%BSA封闭液封闭1.5 h;多克隆抗体最适含量为1∶8×103(0.5 μg·mL−1),37 ℃作用1 h;羊抗兔IgG-HRP最佳含量为1∶104,37 ℃加盖恒温箱中反应,时间45 min。

    兔多克隆抗体检测抗原RsB1151018NA灵敏度分析结果见表3,结果表明,所制备的兔多克隆抗体对抗原RsB1151018NA的检测灵敏度是1×104 CFU·mL−1

    表  3  兔多抗检测灵敏度分析
    Table  3.  Sensitivity of indirect ELISA assay in detecting RsB1151018NA
    包被含量
    Coating concentration/CFU·mL−1
    P/N结果判定
    Result
    阴性对照1
    1×10842.1+
    1×10718.2+
    1×1067.58+
    1×1055.06+
    1×1043.38+
    1×1031.66
    注:“+”表示阳性,“−”表示阴性。
    Note: +: positive; −: negative.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    抗体纯化效果见图12,纯化后的抗体仅出现50 kD和25 kD的条带,与IgG蛋白电泳图谱相符,表明抗体得到了有效纯化。

    图  1  兔抗血清亲和层析纯化图谱
    Figure  1.  Chromatography of polyclonal antibody purified by protein A affinity method
    图  2  兔抗血清纯化效果分析
    注:1:蛋白marker 2:纯化抗体。
    Figure  2.  SDS-PAGE analysis on purified polyclonal antibody
    Note: Lane l: protein marker; Lane 2: purified polyclonal antibodies.

    抗体纯化后抗体的效价分析结果见表4,结果表明,经纯化的多克隆抗体效价为1∶1.6×104

    表  4  纯化后抗体效价分析测定
    Table  4.  Titer of purified polyclonal antibody against Em
    样品 Samples  OD450结果判定 Result
    1︰500 2.779 +
    1︰1 000 2.284 +
    1︰2 000 1.963 +
    1︰4 000 1.482 +
    1︰8 000 1.067 +
    1︰16 000 0.643 +
    1︰32 000 0.415
    空白血清 0.268 NC
    注:NC,阴性对照,“+”表示阳性,“−”表示阴性,S/N≥2.1为阳性。
    Note: NC: negative control; +: positive; −: negative; S/N≥2.1 indicates positive.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    间接ELISA法分析兔多克隆抗体的检测特异性结果见表5,结果表明,兔多克隆抗体与脑膜脓毒性伊丽莎白菌RsB1151018NA及LCCiL90625NA-C的检测结果为阳性,与其他细菌的检测结果为阴性,因此,制备的兔多克隆抗体可特异性检测脑膜脓毒性伊丽莎白菌。

    表  5  多克隆抗体检测特异性分析
    Table  5.  Specificity of polyclonal antibody against RsB1151018NA
    菌株
    Strain
    细菌种类
    Bacterial species
    OD450 nm判定结果
    Result
    RsB11518018NA 脑膜脓毒性伊丽莎白菌
    E.meningosepticum
    0.362 +
    LCCiL90625NA-C 脑膜脓毒性伊丽莎白菌
    E. meningosepticum
    0.335 +
    ATCC13525 荧光假单胞菌
    Pesudomonas fluorescens
    0.197
    ATCC9027 铜绿假单胞菌
    P. aeruginosa
    0.192
    ML316 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 0.186
    Ah0081 嗜水气单胞菌
    A. hydrophila
    0.185
    Ac60324 豚鼠气单胞菌
    A. caviae
    0.187
    96-5 温和气单胞菌
    A. sobria
    0.190
    Fp60325NA 温和气单胞菌
    A. sobria
    0.193
    LCCiL90625NA 类志贺邻单胞菌
    Plesiomonas shigelloides
    0.187
    ATCC17802 副溶血弧菌
    Vibrio parahaemolyticus
    0.194
    FJ04-L1 创伤弧菌
    V. vulnificus
    0.189
    Js60517NA1 溶藻弧菌
    V. alginolyticus
    0.195
    AL60306NA1 迟缓爱德华氏菌
    Edwardsiella tarda
    0.208
    阴性对照 5% 脱脂奶粉
    5%dried separated milk
    0.106 NC
    注:“+”表示阳性,“−”表示阴性
    Note: +: positive; −: negative.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    标记后抗体纯化图谱见图3,纯化后抗体效价测定见表6,结果表明:抗体经过标记且纯化后的效价可达到1∶1.6×103

    图  3  Sephadex G-25脱盐柱纯化FITC标记抗体
    Figure  3.  Purification of IgG-FITC-marked antibodies with desalting column Sephadex G-25
    表  6  FITC标记抗体效价测定
    Table  6.  Titer of purified IgG-FITC antibodies against Em
    样品 Samples   OD450结果判定 Result
    1∶50 2.287 +
    1∶100 1.906 +
    1∶200 1.617 +
    1∶400 1.225 +
    1∶800 0.781 +
    1∶1600 0.567 +
    1∶3200 0.342
    空白血清 Blank serum 0.191 NC
    注:NC,阴性对照,“+”表示阳性,“−”表示阴性,S/N≥2.1为阳性。
    Note: NC: negative control; +: positive; −: negative; S/N≥2.1 indicates positive.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    试验菌株RsB1151018NA不同时间段在蛙体不同组织器官的分布详见表7图45。试验结果显示:(1)前12 h内,RsB1151018NA在肌肉中含量最高,24 h后,在肾脏中含量最高,48 h后则是脑部含量最高,一直维持至72 h试验结束;(2)肌肉、心脏中的菌体含量随试验时间推移逐渐减少,肌肉至60 h后、心脏至72 h后即无法观测到菌体存在;血液在试验期间菌数含量无明显变化;肝脏、肾脏、脾脏则表现出先增加后逐步减少的趋势;肠道自24 h开始观察到菌体后,一直到试验结束,菌数均维持在相对稳定的水平;眼、脑则自12 h观测到菌体后,一直到试验结束,菌数呈现出随时间推移逐渐增多的趋势;(3)试验期间,部分脏器菌数的达峰时间分别为:肌肉、心脏6 h,肝脏48 h,肾脏、脾脏和肠道36 h。

    表  7  RsB1151018NA体内示踪结果
    Table  7.  In vivo tracing of RsB1151018NA in frog
    时间
    Time/h
    菌数对数(lgN
    肌肉
    Muscle
    血液
    Blood
    肝脏
    Liver
    肾脏
    Kidney
    脾脏
    Spleen
    心脏
    Heart
    肠道
    Intestinal

    Eye

    Brain
    61.180.890.410.620.000.660.000.000.00
    121.080.850.510.930.260.640.000.000.00
    240.920.830.681.200.410.560.560.410.56
    360.830.910.751.230.530.450.640.580.83
    480.410.880.811.160.510.300.510.680.92
    600.000.830.530.820.450.480.480.720.89
    720.000.810.300.380.000.000.480.780.90
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  4  RsB1151018NA体内示踪
    Figure  4.  In vivo tracing of RsB1151018NA in frog
    图  5  感染24 h肝切片
    Figure  5.  Fluorescence microscopic detection on liver infection in 24 h

    试验结果说明:RsB1151018NA在棘胸蛙体内随血液循环而分布至全身,可侵袭肌肉、肝脏、肾脏、脾脏、肠道、心脏、眼和脑等组织器官,肾脏、眼和脑感染程度最严重,推测这三个组织器官是其靶器官。

    制备病原体的抗体,进行免疫学检测已成为水产动物病原检测的一个重要手段,间接ELISA技术应用于其他水产病害方面的报道很多,国内外学者已对嗜水气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌等水产养殖重要致病菌建立了行之有效的快速检测手段[19-28],但是用于检测棘胸蛙脑膜脓毒性伊丽莎白菌的有效方法尚待深入探讨。

    水产养殖动物细菌性病害的发生往往具有暴发性,快速检测病原、诊断病害将实现病害及时防治、降低损失,但传统的生理生化鉴定往往费时费力,影响病害的诊断及防治。酶联免疫吸附实验是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其操作方法很多,对于检测抗原而言,主要有双抗体夹心法和间接法两种。由于EILSA敏感性高,操作简便,现已广泛用于多种病原体的抗原或抗体的检测。多抗血清因其检测制备周期短使用比较简单方便,检测的灵敏度较高,在水产类的细菌性疾病的诊断和流行病学调查中都发挥了重要作用。本研究制备兔抗棘胸蛙脑膜脓毒性伊丽莎白菌多克隆抗体,效价为1∶5.12×105,适用于后续研究;建立了间接ELISA检测方法,检测灵敏度为1.0×104 CFU·mL−1,由于该菌为条件致病菌,需达到一定浓度方可引起蛙发病,因此,本研究制备的抗体及检测方法能够满足条件致病菌在生产实际的检测、防治和预警的需要。该方法能检测到的病原菌,与弧菌科常见水产动物病原菌无交叉反应,在实际生产中对脑膜脓毒性伊丽莎白菌的检测具有较强的实际意义,并为脑膜脓毒性伊丽莎白菌商品化检测试剂盒的研制提供了理论依据和物质基础。

    细菌对生物体的致病机理研究历来是病原菌研究的重点,对防治药物的研发和防治方法的确定具有重要的意义。对于脑膜脓毒性伊丽莎白菌的致病机理,目前主要集中于人类[35-36],至于该菌对蛙类的致病机理,国内外则鲜见研究与报道。本文尝试通过对脑膜脓毒性伊丽莎白菌在棘胸蛙体内的示踪研究,掌握其在蛙体内各脏器间的迁移规律,试验结果提示,脑膜脓毒性伊丽莎白菌在棘胸蛙体内随血液循环而分布至全身各脏器组织,其靶器官为棘胸蛙的肾脏、眼和脑部,这与感染脑膜脓毒性伊丽莎白菌后病蛙主要症状表现为歪头、白内障、活动失衡等相符合。

  • 图  1   兔抗血清亲和层析纯化图谱

    Figure  1.   Chromatography of polyclonal antibody purified by protein A affinity method

    图  2   兔抗血清纯化效果分析

    注:1:蛋白marker 2:纯化抗体。

    Figure  2.   SDS-PAGE analysis on purified polyclonal antibody

    Note: Lane l: protein marker; Lane 2: purified polyclonal antibodies.

    图  3   Sephadex G-25脱盐柱纯化FITC标记抗体

    Figure  3.   Purification of IgG-FITC-marked antibodies with desalting column Sephadex G-25

    图  4   RsB1151018NA体内示踪

    Figure  4.   In vivo tracing of RsB1151018NA in frog

    图  5   感染24 h肝切片

    Figure  5.   Fluorescence microscopic detection on liver infection in 24 h

    表  1   用于抗体特异性测定的菌株

    Table  1   Bacterium used for ELISA detection

    菌株
    Strain
    细菌种类
    Bacterial species
    LCCiL90625NA-C 脑膜脓毒性伊丽莎白菌 E. meningosepticum
    ATCC13525 荧光假单胞菌 Pesudomonas fluorescens
    ATCC9027 铜绿假单胞菌 P. aeruginosa
    ML316 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila
    Ah0081 嗜水气单胞菌 A. hydrophila
    Ac60324 豚鼠气单胞菌 A. caviae
    96-5 温和气单胞菌 A. sobria
    Fp60325NA 温和气单胞菌 A. sobria
    LCCiL90625NA 类志贺邻单胞菌 Plesiomonas shigelloides
    ATCC17802 副溶血弧菌 Vibrio parahaemolyticus
    FJ04-L1 创伤弧菌 V. vulnificus
    Js60517NA1 溶藻弧菌 V. alginolyticus
    AL60306NA1 迟缓爱德华氏菌 Edwardsiella tarda
    下载: 导出CSV

    表  2   兔抗多克隆抗体血清效价分析

    Table  2   Titer of polyclonal antibody against Em

    样品 SamplesOD450结果判定 Result
    空白血清 0.1919 NC
    1∶500 2.968 +
    1∶2000 2.907 +
    1∶8000 2.889 +
    1∶32000 2.885 +
    1∶128000 2.547 +
    1∶512000 1.201 +
    1∶2048000 0.36
    注:NC,阴性对照,“+”表示阳性,“−”表示阴性,S/N≥2.1为阳性。
    Note:“NC”indicates negative control, “+” indicates positive,“−” indicates negative, S/N≥2.1 represent for positive.
    下载: 导出CSV

    表  3   兔多抗检测灵敏度分析

    Table  3   Sensitivity of indirect ELISA assay in detecting RsB1151018NA

    包被含量
    Coating concentration/CFU·mL−1
    P/N结果判定
    Result
    阴性对照1
    1×10842.1+
    1×10718.2+
    1×1067.58+
    1×1055.06+
    1×1043.38+
    1×1031.66
    注:“+”表示阳性,“−”表示阴性。
    Note: +: positive; −: negative.
    下载: 导出CSV

    表  4   纯化后抗体效价分析测定

    Table  4   Titer of purified polyclonal antibody against Em

    样品 Samples  OD450结果判定 Result
    1︰500 2.779 +
    1︰1 000 2.284 +
    1︰2 000 1.963 +
    1︰4 000 1.482 +
    1︰8 000 1.067 +
    1︰16 000 0.643 +
    1︰32 000 0.415
    空白血清 0.268 NC
    注:NC,阴性对照,“+”表示阳性,“−”表示阴性,S/N≥2.1为阳性。
    Note: NC: negative control; +: positive; −: negative; S/N≥2.1 indicates positive.
    下载: 导出CSV

    表  5   多克隆抗体检测特异性分析

    Table  5   Specificity of polyclonal antibody against RsB1151018NA

    菌株
    Strain
    细菌种类
    Bacterial species
    OD450 nm判定结果
    Result
    RsB11518018NA 脑膜脓毒性伊丽莎白菌
    E.meningosepticum
    0.362 +
    LCCiL90625NA-C 脑膜脓毒性伊丽莎白菌
    E. meningosepticum
    0.335 +
    ATCC13525 荧光假单胞菌
    Pesudomonas fluorescens
    0.197
    ATCC9027 铜绿假单胞菌
    P. aeruginosa
    0.192
    ML316 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 0.186
    Ah0081 嗜水气单胞菌
    A. hydrophila
    0.185
    Ac60324 豚鼠气单胞菌
    A. caviae
    0.187
    96-5 温和气单胞菌
    A. sobria
    0.190
    Fp60325NA 温和气单胞菌
    A. sobria
    0.193
    LCCiL90625NA 类志贺邻单胞菌
    Plesiomonas shigelloides
    0.187
    ATCC17802 副溶血弧菌
    Vibrio parahaemolyticus
    0.194
    FJ04-L1 创伤弧菌
    V. vulnificus
    0.189
    Js60517NA1 溶藻弧菌
    V. alginolyticus
    0.195
    AL60306NA1 迟缓爱德华氏菌
    Edwardsiella tarda
    0.208
    阴性对照 5% 脱脂奶粉
    5%dried separated milk
    0.106 NC
    注:“+”表示阳性,“−”表示阴性
    Note: +: positive; −: negative.
    下载: 导出CSV

    表  6   FITC标记抗体效价测定

    Table  6   Titer of purified IgG-FITC antibodies against Em

    样品 Samples   OD450结果判定 Result
    1∶50 2.287 +
    1∶100 1.906 +
    1∶200 1.617 +
    1∶400 1.225 +
    1∶800 0.781 +
    1∶1600 0.567 +
    1∶3200 0.342
    空白血清 Blank serum 0.191 NC
    注:NC,阴性对照,“+”表示阳性,“−”表示阴性,S/N≥2.1为阳性。
    Note: NC: negative control; +: positive; −: negative; S/N≥2.1 indicates positive.
    下载: 导出CSV

    表  7   RsB1151018NA体内示踪结果

    Table  7   In vivo tracing of RsB1151018NA in frog

    时间
    Time/h
    菌数对数(lgN
    肌肉
    Muscle
    血液
    Blood
    肝脏
    Liver
    肾脏
    Kidney
    脾脏
    Spleen
    心脏
    Heart
    肠道
    Intestinal

    Eye

    Brain
    61.180.890.410.620.000.660.000.000.00
    121.080.850.510.930.260.640.000.000.00
    240.920.830.681.200.410.560.560.410.56
    360.830.910.751.230.530.450.640.580.83
    480.410.880.811.160.510.300.510.680.92
    600.000.830.530.820.450.480.480.720.89
    720.000.810.300.380.000.000.480.780.90
    下载: 导出CSV
  • [1]

    KING E O. Studies on a group of previously unclassified bacteria associated with meningitis in infants [J]. American Journal of Clinical Pathology, 1959, 31(3): 241−247. DOI: 10.1093/ajcp/31.3.241

    [2]

    LIN P Y, CHU C, SU L H, et al. Microbiological analysis of bloodstream infections caused by Chrysobacterium meningosepticum in non-neonatal patients [J]. J Clin Microbiol, 2004, 42: 353−355.

    [3]

    WASHINGTON C W, STEPHEN D A, WILLIAM J M, et al. Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. [M]. 6th Edition. Philadephia: Lipincott Williams and Wilkins, 2006.

    [4]

    CEYHAN M, CELIK M. Elizabethkingia meningosepticum (Chryseobacterium meningosepticum) Infections in Children [J]. International Journal of Pediatrics, 2011: 215−237.

    [5]

    RATNAMANI M S, RAO R. Elizabethkingia meningoseptica: Emerging nosocomial pathogen in bedside hemodialysis patients [J]. Indian Journal of Critical Care Medicine, 2013, 17(5): 304−307. DOI: 10.4103/0972-5229.120323

    [6]

    UPASANA BHUMBLA, ADITI MEHTA, ANAMIKA VYAS, et al. Elizabethkingia meningoseptica, an emerging pathogen: a case report [J]. Int J Med Re, 2017, 4(3): 35−37.

    [7] 张奇亚, 李正秋, 吴玉琛. 美国青蛙 “旋游症” 病原菌的分离鉴定及其组织病理学观察 [J]. 中国兽医学报, 1999, 19(2):152−155. DOI: 10.3969/j.issn.1005-4545.1999.02.015

    ZHANG Q Y, LI Z Q, WU Y C. Isolation and characterization on the bacterial pathogen Flavobacterium meningosepticum from the diseased frog (Rana grylio) with “spining swim symptom” [J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 1999, 19(2): 152−155.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1005-4545.1999.02.015

    [8] 周永灿, 朱传华, 陈国华, 等. 虎纹蛙白内障病病原的分离鉴定及其免疫防治 [J]. 上海水产大学学报, 2001, 10(1):16−21.

    ZHOU Y C, ZHU C H, CHEN G H, et al. Isolation and identification of pathogen of the cataract disease and its immunological control in Rana tigrina rugulosa [J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 2001, 10(1): 16−21.(in Chinese)

    [9] 陈爱平, 江育林, 钱冬, 等. 蛙脑膜炎败血金黄杆菌病 [J]. 中国水产, 2012(5):51−52.

    CHEN A P. JIANG Y L, QIAN D, et al Chryseobacterium Meningosepticum of Frog (Rana spp.) [J]. China Fisheries, 2012(5): 51−52.(in Chinese)

    [10] 汪建国. 两栖爬行类疾病及其防治技术(1) [J]. 渔业致富指南, 2016(21):61−66.

    WANG J G. Disease and control techniques of amphibian reptiles(1) [J]. Fishery Guide to be Rich, 2016(21): 61−66.(in Chinese)

    [11] 李明, 宋婷婷, 郑荣泉, 等. 棘胸蛙歪头病病原分离、鉴定与药敏实验 [J]. 安徽农业科学, 2016, 44(3):64−66, 98. DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2016.03.025

    LI M, SONG T T, ZHENG R Q, et al. Isolation, identification and drug sensitivity test of the pathogen of Quasipaa spinosa [J]. Journal of Anhui Agri Sci, 2016, 44(3): 64−66, 98.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2016.03.025

    [12] 秦振阳. 黑斑蛙“歪头病”病原菌的分离鉴定及全基因组测序分析[D]. 雅安: 四川农业大学, 2018.

    QIN Z Y. Isolation, identification and whole-genome sequencing analysis of Pelophylsa nigromaculatus roricollis disease[D]. Ya’an: Sicuan ariculture university, 2018.

    [13] 刘晓琳, 梅寒, 卜令飞, 等. 乌鳢伊丽莎白菌的分离鉴定及致病性研究 [J]. 宁波大学学报(理工版), 2018, 31(2):1−7.

    LIU X L, MEI H, BU L F, et al. Isolation and pathogenicity study of Elizabethkingia sp. from Channa argus [J]. Journal of Ningbo University(Natural Science and Engineering Edition), 2018, 31(2): 1−7.(in Chinese)

    [14] 蔡完其, 孙佩芳, 朱泽闻, 等. 中华鳖脑膜炎败血性黄杆菌病的研究 [J]. 水产科技情报, 1997, 24(4):156−161.

    CAI W Q, SUN P F, ZHU Z W, et al. Study on Flavobacterium memingoseptium disease in the softshelled turtle (Trionys sinensis) [J]. Fisheries Science & Technology Information, 1997, 24(4): 156−161.(in Chinese)

    [15] 周煜华, 何成伟. 黄鳝鱼脑膜炎脓毒性黄杆菌的分离与鉴定 [J]. 广西畜牧兽医, 1998, 14(3):5−7.

    ZHOU Y H, HE C W. Isolation and identification of Flavobacterium meningoseptium [J]. Guangxi journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 1998, 14(3): 5−7.(in Chinese)

    [16] 黄志坚, 何建国, 翁少萍, 等. 鳜鱼细菌性病原的分离、鉴定及致病性初步研究 [J]. 微生物学通报, 1999, 26(4):241−246.

    HUANG Z J, HE J G, WENG S P, et al. The isolation and preliminary identification of pathogenic bacteria from the diseased manderin fish [J]. Microbiology, 1999, 26(4): 241−246.(in Chinese)

    [17] 邸军, 张书环, 黄君, 等. 中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌的分离鉴定及药敏特性 [J]. 水产学报, 2018, 42(1):120−130.

    DI J, ZHANG S H, HUANG J, et al. Isolation, identification and antibiotic sensitivity of Elizabethkingia meningoseptica from Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) [J]. Journal of Fisheries of China, 2018, 42(1): 120−130.(in Chinese)

    [18]

    BERNARDET J F, VANCANNEYT M, MATTE-TAILLIEZ O, et al. Polyphasic study of Chryseobacterium strains isolated from diseased aquatic animals [J]. Sys App Mic, 2005, 28(7): 640−660. DOI: 10.1016/j.syapm.2005.03.016

    [19] 钱冬, 陈月英, 沈锦玉, 等. 应用酶联免疫吸附法检测爆发病病原—嗜水气单胞菌的研究 [J]. 水产 养殖, 1993(4):14−l7.

    QIAN D, CHEN Y Y, SHEN J Y, et al. Study on detection of Aeromonas hydrophila by ELISA [J]. Journal of Aquaculture, 1993(4): 14−l7.(in Chinese)

    [20]

    HOLT J G, KRIEG N R, SNEATH P H A, et al. Bergeys manual of determinative bacteriology[M]. 9th edition. Williams and Wilkins Publishers, Baltimore, MD, 1994.

    [21] 王军, 鄢庆枇, 苏永全, 等. 养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究 [J]. 台湾海峡, 2001, 20(3):346−350.

    WANG J, YAN Q P, SU Y Q, et al. Study on indirect ELISA method for detecting Vibrio parahaemolytious in cultured Pseudosciaena crocea [J]. Journal of Oceanography In Taiwan Strait, 2001, 20(3): 346−350.(in Chinese)

    [22] 鄢庆枇, 苏永全, 王军, 等. 用LPS抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测 [J]. 青岛海洋大学学报, 2002, 32:267−271.

    YAN Q P, SU Y Q, WANG J, et al. Indirect ELISA for detection of Vibrio alginolyticus with LPS antiserum [J]. Journal of Ocean University of Qingdao, 2002, 32: 267−271.(in Chinese)

    [23] 吴斌. 豚鼠气单胞菌快速检测间接ELISA法的建立 [J]. 福建水产, 2006, 4(4):48−51. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5601.2006.04.012

    WU B. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for rapid detection of Aeromonas caviae [J]. Journal of Fujian Fisheries, 2006, 4(4): 48−51.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1006-5601.2006.04.012

    [24] 樊景凤, 梁玉波, 宋立超, 等. 凡纳滨对虾红体病病原菌间接ELISA快速检测方法的研究 [J]. 水产学 报, 2006, 30(1):113−l17.

    FAN J F, LIANG L B, SONG L C, et al. Indirect ELISA method for detecting the pathogenic bacteria of Litopenaeus vannamei red body disease [J]. Journal of Fisheries of China, 2006, 30(1): 113−l17.(in Chinese)

    [25] 邹玉霞, 莫照兰, 高光, 等. 间接ELISA技术在病原性鳗弧菌SMPI快速检测中的应用 [J]. 海洋科学, 2007, 31(6):75−78. DOI: 10.3969/j.issn.1000-3096.2007.06.015

    ZOU Y X, MO Z L, GAO G, et al. Use of indirect ELISA to detect pathogenic bacterium Vibrio anguillarum SMP [J]. Marine Sciences, 2007, 31(6): 75−78.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1000-3096.2007.06.015

    [26] 白方方, 兰建新, 王燕, 等. 迟缓爱德华氏菌间接ELISA快速检测法 [J]. 中国水产科学, 2009, 16(4):619−625. DOI: 10.3321/j.issn:1005-8737.2009.04.019

    BAI F F, LAN J X, WANG Y, et al. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for rapid detection of Edwardsiella tarda [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2009, 16(4): 619−625.(in Chinese) DOI: 10.3321/j.issn:1005-8737.2009.04.019

    [27] 夏君, 吴志新, 张鹏, 等. 柱状黄杆菌间接ELISA快速检测方法的研究 [J]. 淡水渔业, 2009, 39(2):065−70.

    XIA J, WU Z X, ZHANG P, et al. Indirect ELISA method for detecting Flavobacterium columnaris [J]. Freshwater Fisheries, 2009, 39(2): 065−70.(in Chinese)

    [28] 朱岩松, 王秀华, 韩雯, 等. 5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用 [J]. 渔业科学进展, 2013, 34(3):68−74. DOI: 10.3969/j.issn.1000-7075.2013.03.009

    ZHU Y S, WANG X H, HAN W, et al. Preparation and application of pathogenic bacteria polyclonal antibodies against five isolated from flounder [J]. Progress in Fishery Sciences, 2013, 34(3): 68−74.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1000-7075.2013.03.009

    [29] 刘小平, 樊尚荣, 陈晓明, 等. 荧光标记MOMP抗体检测沙眼衣原体方法及性能评价 [J]. 标记免疫分析与临床, 2019, 26(5):858−862.

    LIU X P, FAN S R, CHEN X M, et al. The detection of Chlamydia Trachomatis by fluorescein isothiocyanate labeled MOMP antibody and its performance evaluation [J]. Labeled Immunoassays and Clinical Medicine, 2019, 26(5): 858−862.(in Chinese)

    [30] 张雪梅, 胡志宇. 异硫氰酸荧光素在荧光标记领域的应用 [J]. 昆明学院学报, 2015, 37(6):56−59.

    ZHANG X M, HU Z Y. Application of flourescein isothiocyanate in the field of fluorescent labeling [J]. Journal of Kunming University, 2015, 37(6): 56−59.(in Chinese)

    [31] 方珍, 鞠文, 秦亚楠, 等. 大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价 [J]. 吉林大学学报(医学版), 2019, 39(1):165−169.

    FANG Z, JU W, QIN Y N, et al. Preparation and evaluation of FITC labeled Escherichia coli O157∶H7 polyclonal antibody [J]. Journal of Jilin University: Medicine Edition, 2019, 39(1): 165−169.(in Chinese)

    [32] 朱明华, 朱瑞良, 王慧, 等. 鸡奇异变形杆菌外膜蛋白的抗血清制备及其荧光标记抗体检测方法的建立 [J]. 中国预防兽医学报, 2010, 32(8):603−606. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.06

    ZHU M H, ZHU R L, WANG H, et al. Establishment of direct immunofluorescent assay for detection of Proteus mirabilis in chicken [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2010, 32(8): 603−606.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.06

    [33] 于新和, 陶海静, 杜桂欣, 等. 用链球菌自制荧光抗体检测猪链球菌的研究 [J]. 中国预防兽医学报, 2004, 26(6):462−464. DOI: 10.3969/j.issn.1008-0589.2004.06.016

    YU X H, TAO H J, DU G X, et al. Study on diagnosis S. Suis infection with self-preparation immuno- fluorescence antibody [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2004, 26(6): 462−464.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1008-0589.2004.06.016

    [34] 权中会, 王小平, 惠临风, 等. 猪瘟荧光抗体的制备及应用 [J]. 中国兽医科技, 2004, 34(3):39−41. DOI: 10.3969/j.issn.1673-4696.2004.03.009

    QUAN Z H, WANG X P, HUI L F, et al. Preparation and application of fluorescent antibody against classical swine fever [J]. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology, 2004, 34(3): 39−41.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1673-4696.2004.03.009

    [35] 尹秀云, 陈建魁, 张鹏, 等. 脑膜脓毒性金黄杆菌所致舌黏膜感染1例报道 [J]. 中华医院感染学 杂志, 2004(11):118−119.

    YIN X Y, CHEN J K, ZHANG P, et al. A case report of tongue mucosa infection caused by chrysobacterium meningosepticum [J]. Chinese Journal of Nosoconmiolog, 2004(11): 118−119.(in Chinese)

    [36] 申桂娟, 祝进, 王李华, 等. 脑膜脓毒性金黄杆菌医院感染危险因素及耐药性分析 [J]. 中华医院感染 学杂志, 2003(2):85−87.

    SHEN G J, ZHU J, WANG L H, et al. Nosocomial infection by Chryseobacterium meningosepticum: risk factors and drug-resistance [J]. Chinese Journal of Nosoconmiology, 2003(2): 85−87.(in Chinese)

  • 期刊类型引用(1)

    1. 王玉柱,蒋巍巍,刘文舒,路晶晶,唐艳强,肖海红,郭小泽,李思明. 中华鳖源按蚊伊丽莎白菌的分离鉴定及药敏特性研究. 水生生物学报. 2024(04): 683-693 . 百度学术

    其他类型引用(0)

图(5)  /  表(7)
计量
  • 文章访问数:  557
  • HTML全文浏览量:  284
  • PDF下载量:  17
  • 被引次数: 1
出版历程
  • 收稿日期:  2021-04-14
  • 修回日期:  2021-05-30
  • 网络出版日期:  2021-07-12
  • 刊出日期:  2021-07-27

目录

/

返回文章
返回