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摘要:目的 杉木赤枯病是杉木的重要病害之一,严重威胁杉木苗木生产及幼树成林。为了更好保护杉木,防治杉木赤枯病,从杉木叶片分离到内生细菌SM-1,探讨其对杉木赤枯病菌(Pestalotiopsis apiculatus)的拮抗作用。方法 经形态观察、生理生化特性观察、16S rRNA及Biolog系统鉴定其种类;含毒平板及牛津杯法检测SM-1无菌发酵液对赤枯病菌的抑制率,并观察SM-1对赤枯病菌菌丝形态的影响;离体枝条的叶片接种试验检测SM-1无菌发酵液的防病效果。结果 SM-1为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus),其无菌发酵液对赤枯病菌的抑制率可达58.80%;显微观察显示SM-1能够使赤枯病菌菌丝生长受到抑制,细胞膨大成球形;离体枝条的叶片接种试验揭示SM-1无菌发酵液对杉木赤枯病的抑制效率达95%,能够极显著减轻叶片发病程度(P<0.01)。结论 杉木内生芽孢杆菌SM-1对杉木赤枯病具有良好的生物防治潜力。Abstract:Objective Endophytic bacteria that could effectively control the copper blight, one of the most significant diseases that seriously infects the seedlings and saplings, of Chinese fir (Cunninghamia lanceolate) were investigated.Methods Candidate endophytic bacteria were cultured and isolated from leaves of Chinese fir followed by morphological, physiological, and biochemical analyses as well as 16S rRNA sequencing for identification. Pathogen inhibition against Pestalotiopsis apiculatus by the sterile fermentation filtrate of potential specimens was tested on toxic plate and Oxford cup and observed under a microscope. Effectiveness of the disease control by the selected bacteria was further verified in vitro on fir leaves.Results The endophytic bacterium coded SM-1 showed a significant antagonistic effect against P. apiculatus. It was isolated and identified as Bacillus atrophaeus. On the toxic plate and Oxford cup tests, the SM-1 fermentation filtrate yielded a P. apiculatus inhibition rate of 58.80%. Morphologically, the bacterium inhibited the mycelial growth and caused cellular swelling that changed the cells spherical in appearance of the pathogen. The efficacy of the SM-1 filtrate on copper blight on the fir leaves was 95% with significantly reduced disease severity (P<0.01).Conclusion The SM-1, identified as B. atrophaeus, appeared to be a potential biocontrol agent to deter copper blight on Chinese fir.
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0. 引言
【研究意义】杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国特有的用材树种,因其具有生长快,产量高,材质好,用途广的特点而被大量种植,是我国南方最重要的商品用材树种之一,在我国林业生产中占十分重要的地位[1]。杉木生长过程中受到多种真菌病害的为害,杉木赤枯病(Copper blight)是为害杉木苗期和幼林的重要病害,病原菌从针叶侵入,针叶渐变为红褐色,后扩展到顶梢,顶部枯死或整株枯死,严重威胁杉木种苗生产和幼林的成长,安全有效地防治该病是目前杉木种植业亟待解决的问题[2]。【前人研究进展】现有杉木赤枯病的防治主要依赖化学农药[2],农药滥用引发的病原菌抗药性、环境污染等问题越发引起人们对生态安全的担心[3]。生物防治被认为是极具潜力的环境友好型植物病害防治措施,相对于化学农药,具有无污染、无残留、不杀伤天敌、不易产生抗药性、利于人畜安全、兼防兼治、增产增收等优点[4-5]。【本研究切入点】众多生物防治因子容易受环境因素影响,防病效果不稳定,植物内生菌因其受寄主内环境的保护及其可以直接面对侵入植物的病原菌等优点,近年来越来越受到人们的关注,已经成为生物防治因子的重要来源[6]。内生真菌普遍存在于目前所有已知的植物中[7-9],杉木内生菌亦被证实存在种类丰富性,并且在促进杉木生长及其在低磷胁迫下生长、抵抗病原菌等方面具有潜在的应用价值[10-11]。【拟解决的关键问题】本研究的供试菌株为福建农林大学森林保护研究所保存的杉木内生细菌SM-1,前期试验发现该菌株能够显著抑制杉木赤枯病菌(Pesalotiopsis apiculatus)的生长。本研究旨在通过形态学结合16S rDNA序列分析和Biolog系统鉴定SM-1的种类;采用含毒平板和牛津杯法探究SM-1无菌发酵液对杉木赤枯病菌的拮抗性;并对SM-1无菌发酵液在离体枝条的杉木叶片上的防效进行评估,研究结果将为杉木赤枯病的生物防治提供资源,为从杉木内生菌中筛选赤枯病生物防治因子奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 供试菌株
杉木赤枯病病原菌Pesalotiopsis apiculatus及供试生防菌SM-1由福建农林大学森林保护研究所分离并保存在−80 ℃的甘油(25%, V/V)中。杉木赤枯病病原菌在PDA培养基上25 ℃活化培养3 d,SM-1是杉木叶片内生细菌,在LA培养基上28 ℃活化培养3 d。
1.2 培养基
LB培养基:胰蛋白胨10 g·L−1;酵母提取物5 g·L−1;NaCl 10 g·L−1;pH 7.0~7.2。
PDA培养基:去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂18 g,蒸馏水1000 mL。
以上培养基经121 ℃灭菌30 min备用。
1.3 细菌SM-1的鉴定
1.3.1 形态学鉴定
将SM-1在LA培养基上三区划线法划线[12],培养3 d后,观察菌落的形态,挑取培养的SM-1单菌落于100 mL LB培养基中,150 r·min−1,28 ℃摇培1 d,获得菌悬液,参照文献[13]的方法进行革兰氏染色,以已知的革兰氏阴性菌假单胞菌(Pseudomonas)作为参考菌株,然后显微镜下观察其颜色和细胞形态。
1.3.2 生理生化鉴定
对该菌株进行氧化酶活性及碳源利用等几方面的测定, 按文献[13]的方法进行。
1.3.3 16S rDNA序列分析
采用试剂盒提取菌株SM-1的总DNA。采用细菌通用引物27F和1492R扩增16S rDNA基因序列[14]。凝胶电泳检测PCR产物并回收,回收的PCR产物连接pMD18-T载体后转化大肠杆菌E. coli DH5α,挑选阳性克隆送至上海生工公司进行双向测序,获得的序列用DNAMAN软件进行拼接后去除残留的载体序列并提交至Ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net/)数据库进行比对,下载最为相似的且是模式菌株的序列,使用MEGA7.0利用Neighbor-joining方法构建菌株SM-1的系统发育进化树。
1.3.4 Biolog鉴定
菌株SM-1在28 ℃的BUG培养基上生长48 h,挑取少量菌落制备菌悬液。与标准菌悬液进行浊度对比,菌悬液含量调节至90%~98% T后加入GEN III微孔板,每孔加样100 μL。准备好的GEN III微孔板放入培养箱28 ℃培养。在培养24 h时读取数据,并通过与数据库比较获得鉴定结果。
1.4 SM-1对杉木赤枯病菌的抑制
采用平板对峙方法检测SM-1对赤枯病菌的拮抗作用[15]。在培养基一侧划线3 cm长的细菌生长区,在间隔SM-1培养0、24、48、72 h后接种杉木赤枯病菌,赤枯病菌菌饼5 mm,距离细菌生长区5 cm,25 ℃共培养5 d后,测量病原真菌生长直径 ,计算抑菌率。每个处理设置3个重复,试验重复2次。
挑取生长3 d的SM-1单菌落至离心管中,加入适量无菌水制备菌悬液,调节菌悬液OD600=0.6。分别吸取200 μL菌悬液接种至7个100 mL PDB培养基中,置于28 ℃的恒温摇床中150 r·min−1培养。分别在培养1、2、3、4、5、6、7 d时取出。将发酵液12 000 r·min−1,离心10 min弃掉菌体获得上清液,上清液通过0.22 μm的无菌滤膜抽滤,收集滤液,获得SM-1无菌发酵液,4 ℃保存备用。
采用牛津杯法进行发酵液抗菌能力的测定[16]。向牛津杯中加入200 μLSM-1无菌发酵液,在距离牛津杯5 cm的位置接种直径5 mm的赤枯病菌菌饼,25 ℃恒温培养,测量菌丝的生长直径和抑菌圈直径,对照组牛津杯加入200 μL无菌水代替SM-1无菌发酵液。每个处理组重复3次,试验重复2次。
使用发酵3 d的无菌发酵液与PDA培养基做成含毒平板,检测不同含量发酵液对杉木赤枯病菌的抑制作用。制成含无菌发酵液1%、5%、10%、15%、20%(V/V)的毒性平板,以加10%无菌水的PDA平板作为对照。在平板中央接种直径5 mm的杉木赤枯病菌菌饼,25 ℃培养箱培养。培养7 d后,用十字交叉法测量对照组和处理组致病菌生长直径(mm),计算抑菌率。每个处理组重复3次,试验重复2次。
1.5 SM-1无菌发酵液防治杉木赤枯病
采用新鲜的杉木枝条,用培养3 d的无菌发酵液涂抹在健康的杉木叶片上,自然风干后每个叶片接种一个直径5 mm的赤枯病菌菌饼,共接种20个叶片,放置在25 ℃的光照培养箱中保湿培养,每天观察,记录发病叶片的个数,测量病斑的长度。试验重复2次。
1.6 数据统计分析
对试验中获得的数据使用SPSS软件进行方差分析。SM-1发酵液对杉木赤枯病菌抑菌率,不同含量发酵液对核赤枯病菌的抑菌率,不同处理油菜叶片发病率和病斑直径,均采用邓肯多重比较法(Duncan’s Multiple Range Test),在a=0.01水平检测不同处理的差异性。
2. 结果与分析
2.1 细菌SM-1的种类
SM-1在LA培养基上菌落呈现灰白色,中间凹陷,边缘不完整,菌落表面有褶皱(图1)。经革兰氏染色,菌株SM-1细胞呈紫色,为革兰氏阳性菌(G+),菌体细胞呈杆状,细胞大小约2 μm(图1)。
对菌株SM-1利用氧化酶活性、乳糖等其他生理生化特性进行测试,结果均为阴性(表1)。这些特性也与萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)的特征相一致。
表 1 生理生化鉴定结果Table 1. Physiological and biochemical characteristics of SM-1项目 Items 1 2 3 4 5 6 7 氧化酶活性 Oxidase activity − + − + − + + 糖原 Glycogen − Nd − − + + − 乳糖 Lactose − + − − + − − 蜜二糖 Melibiose − + − − − − + 甲基葡萄糖苷 Methyl α-d-glucoside − + − − + + + 杜-杜拉诺糖 d-Turanose − + − − − − + 注:① “+”表示阳性,“−”表示阴性; ②1. SM-1, 2. 解淀粉芽孢杆菌, 3.萎缩芽孢杆菌, 4.摩加夫芽孢杆菌, 5.暹罗芽胞杆菌, 6.贝莱斯芽孢杆菌, 7. B. subtilis subsp. Stercoris。
Note: ① ‘+’ means positive; ‘−’ means negative; ②1. SM-1, 2. B. amyloliquefaciens, 3. B. atrophaeus, 4. B. mojavensis, 5. B. siamensis, 6. B. velezensis, 7. B. subtilis subsp. Stercoris.纯化的PCR产物经测序、拼接、去除载体序列后得到长度为1 455 bp的序列,序列提交到NCBI数据库,获得登记编号MN592638。通过Ezbiocloud比对,与菌株SM-1相似性高于97%的细菌种类有17种,均属于芽孢杆菌属(Bacillus),其中与贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)和B. subtilis subsp. stercoris相似性高达99%以上,与暹罗芽胞杆菌(B. siamensis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)等11个种类相似性超过98%(表2)。根据16S rDNA构建的SM-1进化树发现,SM-1与贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌进化关系较近(图2)。
表 2 与菌株SM-1最为相似的细菌种类Table 2. Bacterial species with closest similarity to SM-1种类 Species 菌株编号 Strain 16S 序列注册号 Accession number 相似性 Similarity/% 贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis CR-502 AY603658 99.29 B. subtilis subsp. Stercoris D7XPN1 JHCA01000027 99.21 暹罗芽孢杆菌 B. siamensis KCTC 13613 AJVF01000043 98.97 枯草芽孢杆菌枯草亚种 B. subtilis subsp. Subtilis NCIB 3610 ABQL01000001 98.69 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens DSM 7 FN597644 98.69 B. nakamurai NRRL B-41091 LSAZ01000028 98.69 B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 AMXN01000021 98.49 耐盐短杆菌 B. halotolerans ATCC 25096 LPVF01000003 98.49 特基拉芽孢杆菌 B. tequilensis KCTC 13622 AYTO01000043 98.49 萎缩芽孢杆菌 B. atrophaeus JCM 9070 AB021181 98.49 莫海威芽孢杆菌 B. mojavensis RO-H-1 JH600280 98.42 死亡谷芽孢杆菌 B. vallismortis DV1-F-3 JH600273 98.42 枯草芽孢杆菌斯氏亚种 B. subtilis subsp. Spizizenii NRRL B-23049 CP002905 98.35 B. glycinifermentans GO-13 LECW01000063 97.45 副地衣芽孢杆菌 B. paralicheniformis KJ-16 KY694465 97.38 B. licheniformis 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 AE017333 97.18 B. haynesii NRRL B-41327 MRBL01000076 97.11 Biolog鉴定系统输出的鉴定结果显示,SM-1与萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)相似性值为0.631>0.50,虽位距值稍大于5,但比另外3个种类,解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、摩加夫芽孢杆菌(B. mojavensis)、简单芽胞杆菌(B. simplex)的位距小(表3),Biolog鉴定结果为萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)。综合形态鉴定、16S rDNA分析和Biolog鉴定结果,鉴定SM-1为萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)。
表 3 Biolog系统对细菌菌株SM-1的鉴定Table 3. Identification of bacterial strain SM-1 by Biolog system排序 Rank 相似性 Similarity 位距 Distance 种类 Species 1 0.631 5.311 萎缩芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus 2 0.163 5.752 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens 3 0.062 6.336 摩加夫芽孢杆菌 B. mojavensis 4 0.046 6.511 简单芽胞杆菌 B. simplex 2.2 细菌SM-1对杉木赤枯病菌的抑制
对峙试验结果显示,在间隔菌株SM-1培养时间越长,SM-1对赤枯病菌的抑菌率越高,培养72 h的SM-1对赤枯病菌的抑制效果最强,抑制带宽度25.05 mm,抑菌率为46.83%,显著高于其他测试的抑菌率(图3)。说明SM-1向培养基中分泌抗菌物质。菌株SM-1的无菌发酵液对杉木赤枯病菌有显著的抑制作用,培养前3 d,随着发酵时间延长,抑菌效果增强;3 d后,随着时间延长,抑菌效果再无提升(图4)。
含毒平板抑菌试验表明PDA平板中含有1%菌株SM-1的发酵液,对杉木赤枯病菌生长几乎没有抑制作用,抑制率仅有0.7%,无明显抑制作用(P=0.75>0.05);当发酵液含量达到5%时,发酵液抑菌率达到21.90%,杉木赤枯病菌的生长受到极显著抑制(P<0.01),而且随着发酵液含量增加,抑菌效果更加显著,当含毒平板SM-1发酵液含量为20%时,抑菌率为58.80%(图5)。
2.3 SM-1对赤枯病菌菌丝的影响
显微镜观察发现,对照组赤枯病的菌丝生长形态正常,原生质菌液,菌丝分枝正常。而经SM-1处理的赤枯病菌菌丝分枝明显减少而且分枝的菌丝生长受到抑制,菌丝细胞大量膨大,呈圆球状(图6)。
2.4 发酵液生物防治效果评估
接种后3 d,对照组的20个杉木叶片全发病,发病率为100%,平均病斑长度21.53 mm,而用SM-1发酵液处理的杉木叶片,只有1个叶片发病,发病率为5%,防治效率为95%;对照组病斑长度平均为21.53 mm,处理组病斑长度平均为0.25 mm,SM-1无菌发酵液处理的杉木叶片赤枯病发病率和严重程度极显著低于对照组(P<0.01)(图7)。这表明菌株SM-1的发酵液对杉木赤枯病具有良好的防治效果。
3. 讨论
杉木是我国重要经济林,其在生长过程中受多种病虫害的影响,由顶枯拟多毛孢(P. apiculatus)引起的杉木赤枯病是杉木的主要叶部病害之一,多发生于苗期和幼树期,目前主要靠化学农药手段来防治杉木赤枯病[2]。而且现在受环境友好型与可持续发展理念的影响,生物防治越来越受到人们的关注,而植物内生菌与宿主之间互生惠利的奇特关系,使内生菌成为筛选生防因子的天然候选者[17],因此,挖掘一株能够有效防治杉木赤枯病的生物药剂,具有巨大的生态效益和经济效益。本研究发现杉木内生细菌菌株SM-1对杉木焦枯病菌表现出的抑菌率虽然仅有58.8%,但是其离体枝条防病效果达到95%,是杉木赤枯病生物防治的优良菌种资源。虽然SM-1对杉木赤枯病的离体防病试验效果良好,但是自然环境下的防病试验还需进一步研究,以检测受不同环境因素影响下SM-1发酵产物的防病能力。
经过多相鉴定,确定菌株SM-1是萎缩假单胞菌(B. atrophaeus)。芽孢杆菌属细菌广泛分布于土壤、植物体内、空气等多种自然环境中,加之芽孢杆菌产生多种活性代谢产物,具有耐热性,对环境营养要求简单,繁殖定殖能力强,对环境的抗逆性强,易生产与加工等特点,使得芽孢杆菌制剂在植物病害防治中得到了广泛应用[18]。现已发现有23个种的芽孢杆菌具有生物防治的功能,其作用机制主要包括诱导竞争作用、分泌抗菌物质和诱导抗性等几个方面[19-20]。萎缩芽孢杆菌(B. atrophaeus)是重要的植物病害生防菌,从土壤中分离到的萎缩芽孢杆菌已经证实对棉花黄萎病、枸杞叶枯病等植物病害有防治潜力[21, 22]。萎缩芽孢杆菌能够产生蛋白质类、肽类等不同类型的抗菌物质。平板抑菌试验证实SM-1产生抗菌类代谢物质,其代谢物质的种类目前还在鉴定当中。平板抑菌试验显示20%(V/V)的SM-1无菌发酵液抑菌率仅为58.8%,但其防病效果能达到95%,推断SM-1次级代谢物质不仅能够影响病原菌的致病能力,或许还能够诱导杉木对病原菌的抵抗力,对SM-1无菌滤液处理后杉木叶片的生理生化及基因转录水平的差异研究可为SM-1防病作用机制奠定理论基础。
本研究供试菌株SM-1,是从杉木叶片内生细菌中筛选出的,其无菌发酵液对杉木赤枯病良好的防治效果说明该菌是具潜力的杉木赤枯病生物防治资源。抑菌成分的鉴定及抑菌机理的研究将为该菌的开发和利用奠定基础。
4. 结论
经形态观察、16S rRNA测序及Biolog系统检测,鉴定SM-1为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus);含毒平板及牛津杯法检测到SM-1无菌发酵液对赤枯病菌的抑制率可达58.80%,显微观察显示SM-1能够使赤枯病菌菌丝生长受到抑制,细胞膨大成球形;离体枝条的叶片接种试验揭示SM-1的无菌发酵液对杉木赤枯病的发病率的抑制效率达95%,并且极显著减轻叶片发病程度(P<0.01)。
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表 1 生理生化鉴定结果
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of SM-1
项目 Items 1 2 3 4 5 6 7 氧化酶活性 Oxidase activity − + − + − + + 糖原 Glycogen − Nd − − + + − 乳糖 Lactose − + − − + − − 蜜二糖 Melibiose − + − − − − + 甲基葡萄糖苷 Methyl α-d-glucoside − + − − + + + 杜-杜拉诺糖 d-Turanose − + − − − − + 注:① “+”表示阳性,“−”表示阴性; ②1. SM-1, 2. 解淀粉芽孢杆菌, 3.萎缩芽孢杆菌, 4.摩加夫芽孢杆菌, 5.暹罗芽胞杆菌, 6.贝莱斯芽孢杆菌, 7. B. subtilis subsp. Stercoris。
Note: ① ‘+’ means positive; ‘−’ means negative; ②1. SM-1, 2. B. amyloliquefaciens, 3. B. atrophaeus, 4. B. mojavensis, 5. B. siamensis, 6. B. velezensis, 7. B. subtilis subsp. Stercoris.表 2 与菌株SM-1最为相似的细菌种类
Table 2 Bacterial species with closest similarity to SM-1
种类 Species 菌株编号 Strain 16S 序列注册号 Accession number 相似性 Similarity/% 贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis CR-502 AY603658 99.29 B. subtilis subsp. Stercoris D7XPN1 JHCA01000027 99.21 暹罗芽孢杆菌 B. siamensis KCTC 13613 AJVF01000043 98.97 枯草芽孢杆菌枯草亚种 B. subtilis subsp. Subtilis NCIB 3610 ABQL01000001 98.69 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens DSM 7 FN597644 98.69 B. nakamurai NRRL B-41091 LSAZ01000028 98.69 B. subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 AMXN01000021 98.49 耐盐短杆菌 B. halotolerans ATCC 25096 LPVF01000003 98.49 特基拉芽孢杆菌 B. tequilensis KCTC 13622 AYTO01000043 98.49 萎缩芽孢杆菌 B. atrophaeus JCM 9070 AB021181 98.49 莫海威芽孢杆菌 B. mojavensis RO-H-1 JH600280 98.42 死亡谷芽孢杆菌 B. vallismortis DV1-F-3 JH600273 98.42 枯草芽孢杆菌斯氏亚种 B. subtilis subsp. Spizizenii NRRL B-23049 CP002905 98.35 B. glycinifermentans GO-13 LECW01000063 97.45 副地衣芽孢杆菌 B. paralicheniformis KJ-16 KY694465 97.38 B. licheniformis 地衣芽孢杆菌 ATCC 14580 AE017333 97.18 B. haynesii NRRL B-41327 MRBL01000076 97.11 表 3 Biolog系统对细菌菌株SM-1的鉴定
Table 3 Identification of bacterial strain SM-1 by Biolog system
排序 Rank 相似性 Similarity 位距 Distance 种类 Species 1 0.631 5.311 萎缩芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus 2 0.163 5.752 解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens 3 0.062 6.336 摩加夫芽孢杆菌 B. mojavensis 4 0.046 6.511 简单芽胞杆菌 B. simplex -
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