Effects of Incorporating Chlorella Suspensions in Feed on Immunity of Broilers
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摘要:目的 研究小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫功能的影响。方法 选择1日龄健康良凤肉鸡（公雏）480只，随机分为4组，每组设10个重复，每个重复12只。以正大肉鸡料为基础饲粮，对照组正常饮水，试验组肉鸡每天分别在饮水中添加30 mL小球藻悬浮液、1 mL金藻液、30 mL小球藻悬浮液+1 mL金藻液（联用液），试验期为70 d。结果 结果表明：添加小球藻悬浮液、金藻液和联用液显著提高了肉鸡的胸腺指数（P＜0.05），对脾脏指数无显著影响（P＞0.05）；对脾脏和胸腺的组织结构均有不同程度的改善。试验组显著提高了肉鸡血清中IgG的含量（P＜0.05）。与对照组对比，试验组血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6等促炎性细胞因子含量显著降低（P＜0.05），抗炎性因子IL-4含量显著升高（P＜0.05）。结论 综上表明，添加小球藻悬浮液、金藻液及联用液均能促进肉鸡免疫器官的发育、提高血液中免疫球蛋白的含量、抑制促炎性细胞因子分泌、促进抗炎性细胞因子生成，从而增强肉鸡的免疫功能。Abstract:Objective Effects of feeding suspensions of chlorella culture with and/or without fermentation to broilers on the immunity of the birds were studied.Method A total of 480 healthy one-day-old male Liangfeng broilers were randomly divided into 4 groups of 10 replicates with 12 birds in each replicate. The broilers were all fed for 70 d with regular forage provided by Lanzhou Zhengda Co., Ltd. The drinking water provided for the 4 groups included water for control and 3 treatments by addition of 30 mL chlorella suspension (CS), 1 mL fermented chlorella suspension (FCS), or 30 mL combination of the two suspensions (CCS).Result The treatments significantly increased the thymus index in the broilers (P＜0.05) but no significant effect on the spleen index (P＞0.05). The improvements on the spleen and thymus tissue structures varied. The treatment broilers showed a significantly increased serum IgG (P＜0.05). Compared to control, the inflammation-promoting factors, such as TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, and IL-6 in serum of the broilers were significantly reduced by the treatments (P＜0.05). For the anti-inflammatory functions, CCS significantly increased IL-4 (P＜0.05). Whereas FCS significantly decreased IL-1β and IL-6 (P＜0.05) and significantly increased IL-4 (P＜0.05).Conclusion The addition of NCS, FCS or CCS in drinking water for the broilers promoted the development of the immunity-related organs of the birds. In addition, significant increases on serum immunoglobulin, inhibition on inflammatory cytokines secretion, and enhancement on anti-inflammatory cytokines production were also found. It appeared that by incorporating the chlorella culture material, with and/or without subsequent fermentation, in the diet feeding broilers the immunity of the flock could be significantly improved.
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Keywords:
- Chlorella suspension /
- fermented chlorella suspension /
- broilers /
- immune organs /
- immunity indices
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0. 引言
【研究意义】猪伪狂犬病（Porcine pseudorabies, PR）是危害我国养猪产业的重要急性传染性疫病之一。不同饲养阶段生猪在感染猪伪狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus, PRV）后的临床表现不同：仔猪出现中枢神经系统紊乱，死亡率高达100%；育肥猪出现呼吸道症状；妊娠母猪则表现为流产、产死胎和木乃伊胎[1]。该病宿主范围广泛，可以感染并导致多种哺乳动物发病，如猪（Sus scrofa）、牛（Bovine）[2]、羊（Ovis aries）[3]、猫（Felis catus）[3]、狗（Canis lupus familiaris）和兔子（Leporidae）[4]，同时对水貂（Neovison vison）也具有一定的致病性[5]，发病率和死亡率都很高[6]。虽然疫苗是该病防控的主要手段，但是科学检测与预警才是防控的第一要素。【前人研究进展】目前PRV的检测方法主要包括酶联免疫吸附试验、病毒分离鉴定、普通PCR和荧光定量PCR等。酶联免疫吸附试验是将抗原或抗体固定到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性反应进行定性或定量检测的方法[7]，易于批量自动化操作，但是对环境和温度以及专业仪器要求较高，检测试剂价格高[7]。病毒的分离鉴定操作复杂、耗时长，对成本和技术要求高，不利于猪伪狂犬病的快速诊断，也不适合在资源有限的环境、基层和现场即时检测，难以满足生产实践中快速诊断的要求[8]。普通PCR需要使用琼脂糖凝胶电泳观察结果，操作繁琐且费时[9]。荧光定量PCR虽然简化了检测流程并具有更优异的检测性能，但目前其相关试剂及仪器成本较高，操作复杂，难以推广[10]。可见传统检测方法对实验室条件及仪器要求高且耗费时间长，在临床快检应用中存在一定局限性[11]。RAA具有操作简单、扩增时间短、支持多样化数据读取等优点[12]，不需要特殊仪器和专业实验室，支持现场恒温快速检测，更容易在临床实践中应用，具有较强的推广性[13]。【本研究切入点】虽然已有学者建立了伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法[14]，但其检测灵敏度还有待提高。【拟解决的关键问题】本研究针对PRV的gE基因设计了特异性引物和探针，基于荧光 RAA 技术建立高灵敏度且快速检测PRV的方法，为现场PRV检测提供新的技术手段。
1. 材料与方法
1.1 试验样品
40份疑似PRV感染临床样品为2018–2023年采自福建省18个家庭农场（表1），由本实验室收集并保存。
表 1 疑似伪狂犬病料收集的来源信息Table 1. Tissue collection of suspected diseased pigs地区
Region样本数（份）/来源猪场（个）
Samples/Farms宁德 Ningde 4/2 泉州 Quanzhou 5/3 漳州 Zhangzhou 10/4 南平 Nanping 12/5 龙岩 Longyan 9/4 合计 Total 40/18 1.2 试验材料、试剂与仪器
病毒RNA/DNA核酸提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司，RAA核酸扩增试剂（荧光型）购自杭州众测生物科技有限公司，pUC57-gE质粒由本实验室构建并保存。LightCycler®96荧光PCR检测仪，北京君意东方电泳设备有限公司。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus, PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）、猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3, PCV3）核酸均由本实验室保存。
1.3 引物设计与合成
根据GenBank中PRV gE基因（NC_006151.1）参考序列，并用NCBI BLAST比对选取保守区域，利用Oligo 7和Primer 5设计RAA引物及nfo探针（表2）。引物和探针由尚亚生物技术有限公司（福州）合成。
表 2 PRV荧光RAA引物与探针Table 2. Primers and probes of PRV for fluorescent RAA引物/探针
Primer/Probe引物序列（5'-3'）
Sequence（5'-3'）用途
UsagePRV-F1 CGATCTACGTGGACGGCATCACGACGCCG 识别并结合到PRV-gE DNA片段的特定区域，启动扩增过程。 PRV-R1 TAGTAGTCCTCGTGCGTGGGCAGGCTGGTGTA PRV-F2 CGAGTACGTCACGGTCATCAAGGAGCTGAC PRV-R2 GCTGGTGTACACCGGAGAGAGCATGTGCGT PRV-Probe GCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCG[FAM-dT]
[THF]A[BHQ1-dT]GACGTGCGTCGTC-C3用于检测和量化扩增过程中产生的特定核酸序列 1.4 荧光RAA引物筛选
将上游与下游引物进行两两组合，获得4组反应引物对，按照荧光型RAA核酸扩增试剂盒说明书，建立50.0 μL扩增反应体系，向装有重组酶及聚合酶的RAA反应管加入缓冲液A Buffer 25.0 μL，上下游引物各2.0 μL，探针0.6 μL，ddH2O 12.9 μL，DNA模板5.0 μL。充分混匀溶解，最后向检测管中加入B Buffer 2.5 μL，充分混匀后低速离心5 s，将上述反应管放入荧光PCR检测仪（LightCycler®96）中反应，通过反应结果筛选出最佳引物对。
1.5 荧光RAA反应体系建立及优化
将筛选的最佳引物对进行稀释，设置终浓度为 1、2.5、5、7.5、10 μmol·L−1，使用上述50 μL RAA 反应体系，通过RAA扩增筛选出最佳引物浓度；将反应温度设定为37、38、39、40、41、42、43、44 ℃进行RAA反应，以筛选出最佳反应温度。
1.6 荧光RAA敏感性试验
通过NanoDrop 2000测定pUC57-gE质粒浓度，根据质粒浓度计算拷贝数，拷贝数/（copies·μL−1）=6.02×1023×浓度（ng·μL−1）×10−9/（碱基数×660）[14]，得出重组质粒pUC57-gE的拷贝数为 1.11×1011 copies·μL−1。将重组质粒pUC57-gE进行10倍倍比稀释，获得1.11×100～ 1.11×107 copies·μL−1 8个浓度。将这8个浓度的标准品分别作为模板，ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA反应，以评价该检测方法的敏感性。
1.7 荧光RAA特异性试验
以PRRSV、PEDV、PoRV、TGEV、PCV2和PCV3的DNA或cDNA为模板，ddH2O为阴性对照，进行荧光RAA反应，以评价该检测方法的特异性。
1.8 荧光RAA重复性试验
取重组质粒浓度为1.11×104、1.11×105、1.11×106 copies·μL−1分别进行3次组内和3次组间重复性试验，评价该检测方法的重复性。
1.9 临床样品检测
提取40份临床样品DNA，用本研究建立的荧光RAA方法检测，并与常规聚合酶链式反应（PCR）方法进行对比，比较分析两种检测方法的结果，计算两种检测方法的符合度，以评价建立的检测方法的实际应用效果。
2. 结果与分析
2.1 荧光RAA引物筛选
按照引物组合（PRV-F1/PRV-R1、PRV-F2/PRV-R2、PRV-F1/PRV-R2、PRV-F2/PRV-R1）的顺序分别进行RAA扩增反应，并设置ddH2O阴性对照。通过RAA扩增得到的引物筛选结果如图1，发现只有PRV-F1/PRV-R1引物对PRV质粒能有效扩增，可检测到荧光信号，因此根据扩增结果选择引物对（PRV-F1/PRV-R1）进行后续试验。
2.2 荧光RAA反应条件的优化
不同浓度的引物和探针浓度RAA反应结果（图2、图3）显示，引物浓度为10 μmol·L−1时最早检测到荧光信号，扩增效率最高，而探针浓度从10 μmol·L−1降低至2.5 μmol·L−1时扩增效率逐步提高，而从2.5 μmol·L−1降低至1 μmol·L−1时扩增效率明显下降，当探针浓度为2.5 μmol·L−1时最早检测到荧光信号，扩增效率最高，因此RAA最佳引物浓度为10 μmol·L−1，探针浓度为2.5 μmol·L−1。
不同温度下荧光RAA反应结果（图4）显示，37 ～ 44 ℃均能有效扩增，当温度从37 ℃增加至43 ℃时扩增效率逐步提高，而从43 ℃增加至44 ℃时扩增效率下降，在43 ℃时，最早检测到荧光信号，且荧光信号强，扩增效率最高，因此RAA最佳反应温度为43 ℃。
2.3 特异性试验
分别以提取的PRRSV、PEDV、PoRV、TGEV、PCV2和PCV3核酸为模板，利用优化后的反应体系进行RAA反应，结果（图5）显示除PRV表现出明显的扩增曲线外，其他病毒及阴性对照均未出现扩增曲线，说明本试验建立的荧光RAA检测方法特异性强，不受其他猪源病毒影响。
2.4 敏感性试验
不同浓度的重组质粒pUC57-gE的RAA反应结果（图6）显示，荧光RAA方法能鉴别检测到的最低质粒浓度为1.11×102 copies·μL−1，说明本次试验中所对应的最低检出拷贝数为111 copies·μL−1。
2.5 重复性试验
以1.11×104 、1.11×105、1.11×106 copies·μL−1 浓度的质粒标准品pUC57-gE为模板，分别进行组内、组间重复性试验。结果（表3）显示，该3个浓度均能有效扩增，起峰差异小，组内、组间变异系数都低于5%，说明该方法重复性好。
表 3 荧光重复性试验结果Table 3. Repeatability of fluorescent RAA质粒浓度
Plasmid
concentration/
（copies·μL−1）组内变异试验
Intra-assay variability组间变异试验
Inter-assay variability循环数
¯X+SD变异系数CV/% 循环数
¯X+SD变异系数CV/% 1.11×104 16.9±0.33 1.98 17.27±0.77 4.52 1.11×105 15.09±0.34 2.31 12.09±0.49 4.09 1.11×106 9.38±0.25 2.76 8.74±0.30 3.45 2.6 临床样品检测
对40份疑似PRV临床样品分别使用荧光RAA和常规聚合酶链式反应（PCR）方法检测，RAA检测设置了一个阳性对照和一个阴性对照，结果显示，RAA检测方法的检出阳性率为15%（6/40），临床样品6、临床样品14、临床样品21、临床样品27、临床样品31和临床样品34出现扩增曲线，其余34个临床样品及阴性对照均未出现扩增曲线。与常规聚合酶链式反应（PCR）方法的阳性检出率一致（6/40）（图7），说明本试验建立的荧光RAA检测方法可靠性强，可以在临床检测中运用。
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图 7 临床样品PRV的PCR和RAA检测A：临床样品RAA结果。B：临床样品PCR结果；M：DL 2000 Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3~42：临床样品。Figure 7. PRV detections by conventional PCR and fluorescent RAA on clinical samplesA: results on clinical samples by fluorescent RAA; B: results on clinical samples by conventional PCR; M: DL 2000 marker; 1: negative control ; 2: positive control ; 3–42: clinical samples.3. 讨论
猪伪狂犬病感染会导致新生仔猪死亡，母猪繁殖障碍，尽管大部分猪场进行了疫苗接种，但是由PRV引起的新生仔猪神经症状乃至死亡的案例仍有发生[15]。2011 以来，我国有29个省市出现了PRV变异株，伪狂犬病“老病新发”，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[16]。RAA是基于重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplification, RPA）发展起来的一项新技术，所用的Bsu聚合酶主要来源于细菌和真菌[17]，与RPA相比，RAA的重组酶来源范围更广，且RAA技术在我国具有产权优势，价格低廉，对检测环境和设备要求低，并且不需要复杂的热循环仪，因此可以在资源有限的现场使用。本研究根据PRV的gE基因序列设计引物与探针，建立了PRV实时荧光RAA检测方法，该方法只能扩增PRV核酸，对其他猪源病毒均无扩增，表明该方法特异性强；该方法检测到的最低拷贝数为111 copies·μL−1，灵敏度比已报道的PRV实时荧光检测重组酶聚合酶扩增方法（real-time RPA法）和侧向流试纸条法（RPA LFD法）高[18]；重复性试验显示，组内和组间试验的变异系数均小于5%，表明该方法可重复性强。
兰德松等[19]报道，辽宁省2017年的PRV阳性率为11.20%（82/732），2018年PRV阳性率为7.54%（42/557）。汪一平等[20]报道豫西地区2017年PRV阳性率为20.69%、2018年PRV阳性率为19.05%。Sun等[15]对2012–2017年收集的中国27个省份疑似PRV感染猪场的样本进行了PRV的核酸检测，平均阳性率为8.27%，2012–2017年PRV的阳性率分别为11.92%（153/
1284 ）、12.19%（225/1846）、6.70%（169/2523 ）、11.10%（269/2424 ）、5.57%（147/2640 ）和6.90%（382/5539 ）。PRV变异毒株的出现，导致传统Bartha-K61活疫苗无法产生完全的保护作用，使得PR在我国再次大规模流行。但疫苗免疫接种仍是防控PRV感染的有效手段，随着伪狂犬疫苗免疫次数的加强、生物安全体系的不断完善和净化工作的开展，总体上猪伪狂犬病毒感染阳性率呈逐年下降的趋势。本研究收集的2018–2023年疑似PRV的40份临床样品检测结果显示，PRV阳性率为15%（6/40），其阳性率高于先前的报道，这可能与病料的收集、采集的样本类型有关，本研究收集的样品是临床上疑似PRV感染的家庭农场，其防控技术较弱，存在免疫空白或免疫检测不到位等因素影响。综上，本研究建立了一种以PRV的gE基因为靶点的荧光RAA快速检测方法，可快速检测PRV的感染，并具有简便、稳定、特异性强、灵敏度高等优点，适用于临床猪伪狂犬病的监测和流行病学调查，为实现快速准确检测PRV提供依据，对猪伪狂犬病的防治具有重要意义。
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图 1 小球藻悬浮液与金藻液对肉鸡免疫器官组织结构的影响
注：A～D：脾脏（40×）；E～H：脾脏（200×）；I～L：胸腺（40×）；M～P：胸腺（100×）；A、E、I、M：对照组；B、F、J、N：小球藻组；C、G、K、O：金藻液组；D、H、L、P：联用组；★：脾脏动脉周围淋巴鞘；▲：脾小结
Figure 1. Effect of NCS and FCS on tissue structures of broiler immune organs
Note: A-D: spleen (40×); E-H: spleen (200×); I-L: thymus (40×); M-P: thymus (100×); A, E, I, and M: control; B, F, J, and N: under NCS treatment; C, G, K, and O: under FCS treatment; D, H, L, and P: under CCS treatment; ★: lymphatic sheath around splenic artery; ▲: splenic node.
表 1 小球藻和金藻液主要营养成分对比（DM基础）
Table 1 Major differences on nutrients in NCS and FCS (on DM basis) （单位：mg·g−1）
项目 Items 小球藻 Chlorella 金藻液 Fermented chlorella 粗蛋白 CP 213.13 128.78 多肽 peptides 62.52 227.68 总氨基酸 AA 10.19 23.65 必需氨基酸 EAA 5.04 10.88 
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表 2 试验动物处理与分组
Table 2 Treatments and groups of broilers for experimentation
处理
Treatment对照组
Control
group小球藻组
Chlorella
group金藻液组
Fermented
chlorella
group联用组
Combination
group用量 Dosage 正常饮水
Water for free30 mL 1 mL 30 mL+1 mL 数量 Number 120 120 120 120
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表 3 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡免疫器官指数的影响
Table 3 Effects of NCS and FCS on broiler immune organ indices
项目
Items对照组
Control group小球藻组
Chlorella group金藻液组
Fermented chlorella group联用组
Combination groupP值
P value胸腺指数 Thymus Index 3.55±0.52 c 4.59±0.12 b 5.57±0.60 a 5.17±0.78 a 0.007 脾脏指数 Spleen index 1.35±0.31 1.39±0.12 1.39±0.11 1.53±0.30 0.707 注：同行数据后不同小写子母表示差异显著（P＜0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。
Note: Different lowercase in peer data indicate significant differences (P＜0.05), and the same lowercase letters or no letters indicate insignificant differences (P＞0.05). The same as below.
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表 4 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清免疫球蛋白含量的影响
Table 4 Effects of NCS and FCS on serum immunoglobulin in broilers
项目
Items对照组
Control group/μg·mL−1小球藻组
Chlorella group/μg·mL−1金藻液组
Fermented chlorella group/μg·mL−1联用组
Combination group/μg·mL−1P值
P- valueIgG 150.11±27.10 b 173.09±27.44 ab 239.18±37.78 a 224.31±8.63 a 0.004 IgA 2.29±0.15 2.50±0.27 2.65±0.25 2.71±0.30 0.116 IgM 1.73±0.21 b 2.28±0.33 a 2.11±0.29 ab 2.08±0.31 ab 0.100
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表 5 小球藻悬浮液和金藻液对肉鸡血清细胞因子含量的影响
Table 5 Effects of NCS and FCS on serum cytokine in broilers
项目
Items对照组
Control group/pg·mL−1小球藻组
Chlorella group/pg·mL−1金藻液组
Fermented chlorella group/pg·mL−1联用组
Combination group/pg·mL−1P值
P valueTNF-α 55.96±9.63 a 44.18±15.87 a 41.33±17.06 ab 24.57±5.02 b 0.012 IFN-γ 35.97±6.81 a 29.25±10.20 a 25.02±9.33 ab 16.07±3.38 b 0.007 IL-1β 22.45±6.67 a 16.42±6.28 ab 14.54±3.31 b 11.17±0.96 b 0.019 IL-2 204.71±39.77 a 213.28±32.74 a 156.84±54.82 ab 102.29±3.84 b 0.028 IL-4 8.68±3.60 c 10.04±4.97 bc 14.30±3.87 ab 18.61±1.86 a 0.003 IL-6 143.63±19.46 a 118.31±8.45 ab 104.41±39.17 bc 77.66±16.15 c 0.002
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