香蕉<i>MaAQP1</i>启动子诱饵载体及干旱胁迫酵母单杂交cDNA文库的构建

许奕; 李羽佳; 魏卿; 王安邦; 王笑一; 宋顺; 李敬阳

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2020.10.005

香蕉MaAQP1启动子诱饵载体及干旱胁迫酵母单杂交cDNA文库的构建

许奕^{1, 2,},
李羽佳¹,
魏卿¹,
王安邦¹,
王笑一¹,
宋顺^{1, 2},
李敬阳^1, ,

1.
中国热带农业科学院海口实验站/海南省香蕉遗传改良重点实验室，海南　海口　571101
2.
海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室，海南　三亚　572000

基金项目: 中国热带农业科学院基本科研业务费专项项目（1630092020002）；国家自然科学基金项目（31501371）；中央级公益性科研院所基本科研业务专项项目（1630092020007）

详细信息

作者简介:
许奕（1985−），女，硕士，研究方向：作物遗传育种（E-mail：lukydog163@163.com）

通讯作者:
李敬阳（1976−），男，硕士，副研究员，研究方向：作物遗传育种（E-mail：jingyanglee@163.com）

中图分类号: S 668.1
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出版历程
- 收稿日期: 2020-06-14
- 修回日期: 2020-07-28
- 刊出日期: 2020-10-27

Constructions of Banana MaAQP1 Bait Vector and Drought-resistance cDNA Library

XU Yi^{1, 2,},
LI Yujia¹,
WEI Qing¹,
WANG Anbang¹,
WANG Xiaoyi¹,
SONG Shun^{1, 2},
LI Jingyang^1, ,

1.
Haikou Experimental Station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement, Haikou, Hainan　571101, China
2.
Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions, Sanya, Hainan　572000, China

摘要

摘要:
目的香蕉MaAQP1能够提高植物的耐旱性，研究香蕉MaAQP1的相关特性可为了解其干旱胁迫响应机制奠定基础。
方法通过克隆MaAQP1的启动子，将启动子构建到pHIS2诱饵质粒上，转化酵母菌构建诱饵表达载体，同时构建干旱胁迫的香蕉（Musa acuminat L. AAA group cv. Brazilian）cDNA文库。
结果克隆获得1 362 bp的启动子序列，通过分析其顺式作用元件，结果显示启动子序列中共有72个顺式作用元件，包括了TATA-box和CAAT-box核心元件，ABA响应元件、MYB元件、MYC元件、ERE元件、MeJA响应元件、光响应元件以及分生组织响应元件等；成功构建了MaAQP1诱饵载体和干旱胁迫条件下的cDNA文库，文库库容为1.25×10⁷ CFU，插入片段平均在1 200 bp左右。
结论本研究克隆获得了香蕉MaAQP1启动子并构建了干旱胁迫酵母单杂交cDNA文库，为下一步运用酵母单杂交筛选MaAQP1互作的转录因子、解析MaAQP1响应干旱胁迫的作用机制奠定了基础。
- 香蕉 /
- 干旱 /
- MaAQP1 /
- 诱饵载体 /
- cDNA文库
Abstract:
Objective To clone MaAQP1 from a drought stressed banana plant using a constructed bait vector, and establish a cDNA library of the transformed drought-resistance gene from single-hybrids yeast cells.
Method The promoter of MaAQP1 from a banana plant (Musa acuminat L. AAA group cv. Brazilian) under draught-stress was constructed on the pHIS2 plasmid as the bait to be transformed into yeast cells for the gene cloning. A cDNA library of MaAQP1 in the yeast was subsequently established for the study.
Result The MaAQP1 bait vector was successfully constructed. The sequence of the 1 362 bp promoter was cloned and analyzed to show 72 cis-acting TATA-box and CAAT-box core elements as well as elements of MYB, MYC, ERE, and MeJA as well as those of ABA, light, and meristem responses, etc. A drought-resistance cDNA library of 1.25×10⁷ CFU in capacity with an average insert size of about 1 200 bp was established.
Conclusion The results provided a basis for screening transcription factors of the cloned MaAQP1 in the yeast single-hybrids to decipher the mechanism of MaAQP1 in response to drought for improving the stress resistance of plants.
- Banana /
- drought /
- MaAQP1 /
- bait vector /
- cDNA library

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0. 引言

【研究意义】磺胺类药物（Sulfonamides, SAs）是一类用于细菌性疾病的预防与治疗的化学治疗药物^[1-2]。该药物因抑菌效果好、价格低廉而被广泛应用于治疗奶牛中频发的乳房炎，故而在牛奶中被检测出的概率很高。SAs在动物性食品中容易残留，长期摄入含SAs的奶制品，将危及人体健康^[3]。因此，包括中国在内的许多国家都制定了食品和饲料中SAs的最大允许残留限量和相应的检测方法^[4-5]。高效液相色谱-质谱联用是检测SAs在牛奶中残留量的标准方法^[6]，但由于SAs在牛奶中的浓度低，且牛奶中有如脂肪、蛋白质等干扰物的影响^[7]，选择性分离牛奶中痕量SAs的前处理显得尤为重要。【前人研究进展】对食品中SAs提取的传统方法为液液萃取，但需消耗大量有机溶剂，共萃取杂质较多，步骤繁杂^[8]。而新兴的方法，如超临界萃取^[9-10]，虽具有环保、快速、无副反应、选择性高等优点，但其需专门的仪器，运行和维护费用昂贵。固相微萃取^[11-12]相比于其他萃取方法，操作简便，有机溶剂用量极少，但检测结果相对标准偏差较大。磁性固相萃取^[13]（Magnetic solid phase extraction, MSPE）是以磁性或可磁化的材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术，具有萃取面积更大、简单便捷、可重复使用且能避免杂质干扰等诸多优点^[14-16]。王露等^[17]和Tolmacheva等^[18]用MSPE对牛乳中的4种SAs进行富集萃取后用HPLC检测其残留量，均取得较为理想的效果。MSPE的核心在于磁性吸附剂，设计并合成具有高效吸附性能的磁性吸附剂是MSPE的关键所在。【本研究切入点】共价有机骨架（Covalent organic frameworks, COFs）^[19-20]是一类由有机单体通过共价键形成有周期性网络结构的晶体聚合物。COFs具有比表面积高、密度轻、易修饰及结构稳定等优点。COFs广泛应用于样品前处理中，包含固相萃取、固相微萃取及磁性固相萃取等^[21-23]。SNW-1是由三聚氰胺和对苯二胺在一定条件下制备而成的一种席夫碱型COFs^[24]。相比其他COFs，SNW-1的合成原料便宜、易得，而且SNW-1具有较高的比表面积。目前，磁性SNW-1的制备及其在样品前处理中的应用还未见相关报道。【拟解决的关键问题】本文通过水热合成法制备磁性SNW-1（Fe₃O₄@SNW-1），将其作为磁性固相萃取的吸附剂，在萃取与洗脱效果的关键参数上进行优化，结合高效液相色谱，为牛奶中5种痕量磺胺类药物的残留检测提供便捷快速的分析方法。

1. 材料与方法

1.1 仪器与设备

透射电子显微镜（FEI Tecnai G20，美国FEI公司）；扫描电子显微镜（FEI Inspect F50，美国FEI公司）；冰箱（KG20V31T1，博西家电销售公司）；氮吹仪（MG-2200，上海虔钧科学仪器有限公司）；电子天平（ME204E/02，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超声波清洗器（KQ5200E，昆明市超声仪器有限公司）；循环水式真空泵（SHB-III，郑州紫拓仪器设备有限公司）；Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；高效液相色谱仪[LC-20A，岛津-GL（上海）商贸有限公司]；涡旋混合器（Vortex QL-902，上海之信仪器有限公司）；高速冷冻离心机（GL-21M，长沙湘智离心机仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂

六水三氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、醋酸钠、柠檬酸钠二水（Na₃Cit·2H₂O）、磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine, SMZ）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine, SMR）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole, SMX）标准品：上海源叶生物科技有限公司；磺胺嘧啶（Sulfadiazine, SDZ）、磺胺间甲基嘧啶（sulfamonomethoxine, SMM）标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈、醋酸铅：国药集团化学试剂有限公司；氨水、乙酸：西陇科技股份有限公司；伊利牛奶：内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Fe₃O₄的制备

将FeCl₃·6H₂O（6.8 g）、醋酸钠（12.0 g）和Na₃Cit·2H₂O（2.0 g）溶解在200 mL乙二醇中，将所得黄色的均相溶液放进高压反应釜中加热（200 ℃，10 h）。反应结束后，用磁铁将Fe₃O₄从产品中分离出来后用清水和乙醇反复清洗干净，真空环境下80 ℃干燥12 h。

1.3.2 磁性共价有机骨架材料的制备

将2.0 g三聚氰胺溶解于62 mL二甲基亚砜（DMSO）中，其次将0.3 g Fe₃O₄分散于上述溶液并超声分散10 min，最后加入1.26 g对苯二甲醛，在180 ℃条件下机械搅拌6 h。反应结束后，依次使用丙酮、二氯甲烷和三氟乙酸将磁性材料清洗干净，并在80 ℃的真空条件下过夜干燥，得到磁性复合物Fe₃O₄@SNW-1，其结构示意图如图1。

图 1 磁性固相萃取剂结构

Figure 1. Schematic diagram of MSPE

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1.3.3 磁性固相萃取（MSPE）条件的优化

（1）MSPE温度和时间的优化

保持其他磁性固相萃取条件不变，测定不同吸附剂用量（1.0～6.0 mg）和在不同水浴吸附时间（15、60、120和150 s）下SAs的回收率。

（2）溶液pH和离子强度的优化

保持其他磁性固相萃取条件不变，测定不同样品溶液pH值（2、4、6、7、8、10）以及NaCl剂量（0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol·L⁻¹）下SAs的回收率。

（3）洗脱剂种类的选择

保持其他磁性固相萃取条件不变，测定不同洗脱溶剂[v（氨水）∶v（甲醇）= 5∶95， v（乙酸）∶v（甲醇）=5∶95， v（氨水）∶ v（乙腈）= 5∶95， v（乙酸）∶v（乙腈）=5∶95，乙腈，甲醇]下SAs的回收率。

（4）洗脱剂用量和洗脱时间的优化

保持其他磁性固相萃取条件不变，考察洗脱剂用量变化（0.5、1、1.5、2、2.5、3 mol·L⁻¹）以及洗脱时间变化（15、30、45、60、75、90 s）下SAs的回收率。

1.3.4 高效液相色谱检测条件

配备有2个LC-20AT溶剂输送单元和SPD-M20A PDA检测器（Shimadzu, Kyoto, Japan）的LC-20A HPLC系统，检测器的检测波长：269 nm；C₁₈柱（Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；流动相：乙腈-乙酸水（含1%乙酸）（20∶80，v/v），等梯度洗脱；进样量：20 μL；流速：1.00 mL·min⁻¹；柱温：25 ℃。

1.3.5 SAs的MSPE操作流程

SAs吸附与富集整个MSPE技术操作流程详见图2。首先，将4.0 mg Fe₃O₄@SNW-1加入10 mL样品溶液，涡旋2 min，用磁铁将Fe₃O₄@SNW-1与溶液分离并倒掉溶液。其次，加入2 mL洗脱剂，涡旋1 min，磁铁将Fe₃O₄@SNW-1与洗脱液分离，将收集的洗脱液在40 ℃下氮吹至干。最后，用0.5 mL乙腈-乙酸水（含1%乙酸）（20∶80，v/v）的流动相定容待测样品，用针管移至进样瓶中，待上机检测。

图 2 磁性固相萃取流程

Figure 2. Flow diagram of MSPE

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1.3.6 空白牛奶和加标牛奶样品前处理

准确称取250 mL的牛奶（配置100 ng·mL⁻¹的磺胺类药物的牛奶250 mL），加入16%醋酸铅250 mL，搅拌，超声数分钟直至混匀，装入等量离心瓶中，放入高速冷冻离心机，转速为4 000 r·min⁻¹，离心15 min，取出，收集离心瓶中的上清液备用。

2. 结果与分析

2.1 合成材料的结构表征

2.1.1 透射电镜表征

由透射电镜表征结果见图3-A，可以看出Fe₃O₄磁粒子是规则的圆球，粒径为200～400 nm。从图3-B中可清晰发现，在Fe₃O₄磁粒子的表面包裹了一层致密的纳米级颗粒构成的核壳结构的复合材料即Fe₃O₄@SNW-1。透射电镜结果可证实SNW-1已成功负载在Fe₃O₄磁粒子上，制备成具有核壳结构的Fe₃O₄@SNW-1复合材料。

图 3 Fe₃O₄及Fe₃O₄@SNW-1透射电镜表征结果

注：a: Fe₃O₄; b: Fe₃O₄@SNW-1。

Figure 3. TEM images of Fe₃O₄ and Fe₃O₄@SNW-1

Note：a: Fe₃O₄; b: Fe₃O₄@SNW-1.

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2.1.2 X射线衍射（X-ray diffraction Analysis, XRD）表征

图4为Fe₃O₄和Fe₃O₄@SNW-1晶体结构的XRD衍射表征。从结果可以看出，Fe₃O₄@SNW-1的XRD衍射峰包含了Fe₃O₄所有的特征衍射峰。此外在25 °左右出现1个较宽的衍射峰，是SNW-1的特征衍射峰，说明SNW-1是一种无定型结构。XRD的结果充分说明了本试验成功制备了Fe₃O₄@SNW-1复合材料。

图 4 Fe₃O₄和Fe₃O₄@SNW-1的XRD衍射表征

Figure 4. XRD characterization on Fe₃O₄ and Fe₃O₄@SNW-1

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2.1.3 氮气吸附表征（Nitrogen adsorption-desorption）

Fe₃O₄和Fe₃O₄@SNW-1的多孔特性通过氮气吸附表征，氮气吸附-脱附结果，如图5所示。Fe₃O₄的BET（Brunner-Emmet-Teller）比表面积为69.0 m²·g⁻¹，孔体积为0.096 7 cm³·g⁻¹，孔径为5.6 nm。Fe₃O₄@SNW-1的BET比表面积为132.7 m²·g⁻¹，孔体积为0.44 cm³·g⁻¹，孔径为18.6 nm。Fe₃O₄@SNW-1复合材料的BET比表面积、孔体积相比Fe₃O₄有大幅增加，这主要是因为SNW-1的多孔特性，使其与Fe₃O₄结合成的复合材料具有更大的比表面积和孔体积。

图 5 Fe₃O₄和Fe₃O₄@SNW-1的氮气吸附表征

Figure 5. Nitrogen adsorption characterization on Fe₃O₄ and Fe₃O₄@SNW-1

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2.2 MSPE条件优化

2.2.1 吸附剂用量和吸附时间的影响

首先考察Fe₃O₄@SNW-1吸附剂用量在1.0～6.0 mg对样品回收率的影响。如图6所示，随着吸附剂用量从1.0 mg增加到4.0 mg，SAs的回收率增加，当吸附剂用量为4.0 mg时，SAs的回收率最高。在此之后，回收率虽有所波动，但基本趋于平稳。故选择吸附剂Fe₃O₄@SNW-1的用量4.0 mg用于进一步研究。

图 6 吸附剂用量的影响

Figure 6. Effect of adsorbent usage on testing

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考察范围为15～150 s的吸附时间对5种SAs回收率的影响。如图7所示，在所考察的范围内，SAs的回收率较为稳定，在120 s吸附达到平衡，之后回收率基本保持不变。固吸附时间控制在120 s。

图 7 吸附时间的影响

Figure 7. Effect of adsorption time on testing

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2.2.2 溶液pH和离子强度的影响

SAs为两性化合物^[17]，样品溶液的pH值在吸附过程中起着重要作用，因为它会影响吸附剂的表面电荷以及SAs的存在形式，从而影响SAs在MSPE上的吸附率进而影响其回收率。试验中研究了样品溶液的pH值在2.0～10.0对于回收率的影响。从图8可以看出，在pH为6.0时SAs回收率最高。pH为6.0时，大多数SAs将以中性形式存在，小部分以离子形式存在。因而，Fe₃O₄@SNW-1通过π-π作用力和疏水作用力吸附SAs。故选择样品溶液的pH为6.0。

图 8 不同pH的影响

Figure 8. Effect of pH on testing

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此外，离子强度对SAs回收率的影响见图9。从结果可以看出，离子强度对样品回收率的影响不大。结果说明静电作用力不是Fe₃O₄@SNW-1吸附SAs的主要吸附机制。相反，π-π相互作用和疏水作用才是Fe₃O₄@SNW-1吸附SAs的主要吸附机制。因此，在随后的实际样中没有向样品中加入NaCl。

图 9 不同离子强度的影响

Figure 9. Effect of ionic strength on testing

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2.2.3 洗脱剂种类的影响

为了从磁性固相萃取中获得SAs较高的回收率，试验使用了磺胺类药物较易溶解的氨水-甲醇（5∶95，v/v）、乙酸-甲醇（5∶95, v/v）、氨水-乙腈（5∶95，v/v）、乙酸-乙腈（5∶95，v/v）、乙腈、甲醇等极性溶剂作为洗脱溶剂，考察其对SAs回收率的影响。如图10所示，氨水-甲醇（5∶95，v/v）溶液在这6种洗脱溶剂中具有最佳洗脱能力。因此，选择氨水-甲醇（5∶95，v/v）作为洗脱溶剂。

图 10 不同洗脱溶剂的影响

注：1.v（氨水）: v（甲醇）= 5:95， 2.v（乙酸）: v（甲醇）=5:95， 3.v（氨水）: v（乙腈）= 5:95， 4.v（乙酸）: v（乙腈）=5:95，5.乙腈，6.甲醇。

Figure 10. Effect of eluent on testing

Note: 1. ammonia -methanol(5:95, v/v); 2. acetic acid - methanol(5:95, v/v); 3. ammonia - acetonitrile(5:95, v/v); 4. acetic acid - acetonitrile(5:95, v/v); 5. acetonitrile; 6. methanol.

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2.2.4 洗脱剂用量及洗脱时间的影响

研究氨水-甲醇（5∶95，v/v）从0.5～3.0 mL的剂量范围对SAs回收率的影响。结果如图11所示，随着洗脱剂的体积从0.5 mL增加到2.0 mL，SAs的回收率呈上升趋势，当洗脱量为2.0 mL时，SAs的回收率达到最高。随后SAs的回收率趋于平稳，说明洗脱基本达到平衡，因此将氨水-甲醇（5∶95，v/v）的体积定为2.0 mL。

图 11 洗脱剂体积的影响

Figure 11. Effect of eluent volume on testing

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考察了洗脱时间在15～90 s对5种SAs回收率的影响。如图12所示，随着洗脱时间的增加，回收率逐渐加强，当洗脱时间为60 s，回收率达到最高，之后的回收率不再发生明显变化，因此选择洗脱时间为60 s。

图 12 不同解吸时间的影响

Figure 12. Effect of elution duration on testing

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2.3 标准曲线、检出限以及精密度

MSPE/HPLC方法对5种SAs混合标准溶液进行测定，并绘制标准曲线。其分析数据见表1。该方法为SAs的10～100 ng·mL⁻¹具有良好的线性，相关系数较高（R²＞0.9948）。对于质量浓度为50 ng·mL⁻¹的工作样品的5次重复，所提出的方法的日间精密度（RSD %）为2.4%～3.4%，显示出测定SAs的高精度。

表 1 以磁性COF为吸附剂的MSPE/HPLC测定SAs的检出限及精密度

Table 1. Detecting limit and precision of MSPE/HPLC method using magnetic COF as adsorbent on SA determination

分析物 Analyte	线性范围 Linear range/（ng·mL⁻¹）	线性方程 Regression equation	相关系数 Correlation coefficient	检出限 Limit of detection/（ng·mL⁻¹）	相对标准偏差 RSD/%
SDZ	10～100	y=643798x−416.89	0.999 0	1.7	3.4
SMR	10～100	y=783 373x−543.79	0.998 1	1.7	2.8
SMZ	10～100	y=697 128x−256.47	0.999 6	2.0	2.4
SMM	10～100	y=754 506x−551	0.999 3	2.4	2.5
SMX	10～100	y=654 838x− 2 976.6	0.994 8	2.7	2.8

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2.4 实际样品分析

对牛奶样品进行实际分析，以证明该方法的实用性。在牛奶样品中分别加入20、50、100 ng·mL⁻¹的SAs，采用3次重复试验的平均值，进行了加标回收试验。如表2所示，5种SAs的回收率在72%～95%。图13显示了经前处理后空白牛奶样品、添加100 ng·mL⁻¹SAs的加标牛奶样品的色谱图以及用MSPE进行前处理的加标牛奶样品的色谱图，从图中可以看出，5种磺胺类组分峰与杂质能很好分离，且峰形好，在13 min内能完成样品的检测。以上结果表明，所建立的MSPE/HPLC方法对复杂的牛奶样品中痕量SAs的同时分离和测定是切实可行的。

表 2 牛奶样品中SAs的分析结果

Table 2. Analysis of SAs in milk samples

分析物 Analyte	添加量 Added/（ng·g⁻¹）	牛奶 Milk
分析物 Analyte	添加量 Added/（ng·g⁻¹）	测定值 Found/（ng·g⁻¹）	回收率 Recovery/%	相对标准偏差 RSD/%
SDZ	0	ND	–	–
	20	16.8	84	3.2
	50	38.5	77	2.8
	100	72	72	4.4
SMR	0	ND	–	–
	20	18.6	93	6.1
	50	41	82	4.6
	100	79	79	5.3
SMZ	0	nd	–	–
	20	19	95	2.3
	50	41.5	83	3.5
	100	81	81	5.8
SMM	0	ND	–	–
	20	16.6	83	4.9
	50	40	80	3.1
	100	81	81	5.9
SMX	0	ND	–	–
	20	17.6	88	5.7
	50	44	88	4.7
	100	86	86	3.4
注：ND: 未检出。 Note：ND means not detected.

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图 13 不同处理样品色谱图

注：A：空白牛奶样品的色谱图；B：加标牛奶样品的色谱图；C：采用MSPE处理的加标牛奶样品的色谱图。

Figure 13. Chromatograms of samples

Note: A: Chromatogram of milk samples; B: Chromatogram of spiked milk samples after extraction; C: Chromatogram of spiked milk samples with MSPE.

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2.5 方法比较

为了评估Fe₃O₄@SNW-1作为磁性固相萃取的吸附剂的性能，从吸附剂的量、样品量、洗脱量和LODs的角度，将其与前人采用MSPE对SAs前处理的效果的测定方法进行了比较^{[18, 25-27]}。结果表明（表3）：当前所提出的方法仅需要4 mg吸附剂，这比大多数已报道的方法要小，表明Fe₃O₄@SNW-1对SAs的吸附能力优异。另外，目前的方法消耗的样品和洗脱量很少，可以减少操作时间并满足实际应用，且与其他磁性固相萃取技相比，只需较短的萃取时间就能实现高效萃取。最后，与报道的方法相比，当前方法的灵敏度优于或与已报道的方法相当。因此，所提出的MSPE/HPLC方法可用于复杂基质中痕量SAs的灵敏测定。

表 3 所提方法与文献中其他方法的比较

Table 3. Comparison between MSPE/HPLC and other existing methods

吸附剂 Sorbent	方法 Method	样品 Sample	吸附剂量 Amount of Sorbent/mg	样品容量 Sample volume/ mL	萃取时间 Extraction time/ min	洗脱剂体积 Elution volume/ mL	检测限 LODs/（ng·mL⁻¹）	参考文献 Reference
Fe₃O₄-SiO₂-phenyl	MSPE/HPLC	牛奶 Milk	100	10	5	3	7～14	[25]
Fe₃O₄-graphene oxide	MSPE/HPLC	水 Water	5	1	20	1	50～100	[26]
HCP-Fe₃O₄	MSPE/HPLC	牛奶 Milk	20	25	5	2	2.0～2.5	[18]
CoFe₂O₄-graphene	MSPE/HPLC	牛奶 Milk	15	100	20	0.5	1.16～1.59	[27]
Fe₃O₄@SNW-1	MSPE/HPLC	牛奶 Milk	4	10	2	2.0	1.7～2.7	本研究 This work

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3. 讨论与结论

MSPE技术富集的样品可以广泛运用于农药残留、食品添加剂、抗生素、激素类及重金属离子，且通过该技术所得的回收率绝大部分在80%～120%，检出限基本都能达到ng·mL⁻¹（或ng·g⁻¹）数量级，加之涵盖了食品分析领域的大部分区域，因此有着极为理想的应用前景^[28]。

本研究通过水热法合成Fe₃O₄@SNW-1作为磁性吸附剂，通过透射电镜表征和X射线衍射，验证制备成具有核壳结构的Fe₃O₄@SNW-1复合材料，后通过氮气吸附表征，也证明复合材料的多孔性以及比表面积大的特点。该合成方法利用共价有机骨架来修饰磁性纳米颗粒，既保持共价有机骨架具有的由共轭和富含氮的、结构单元构成的微孔网络结构所表现出的吸附富集性能，又缩短萃取材料和溶液的分离时间^[25]，所用到的磁性吸附剂在目前MSPE当中鲜有报道。

在MSPE吸附过程中Fe₃O₄@SNW-1可通过π-π作用力和疏水作用力吸附SAs。通过MSPE与HPLC联用，在对吸附剂用量、吸附时间、溶液pH、洗脱剂种类、洗脱剂用量和洗脱时间等参数优化后，可高效检测出牛奶中5种痕量磺胺类药物。本研究所建立方法的检测限在1.7～2.7 ng·mL⁻¹，5种SAs（每种50 ng·mL⁻¹）的5次重复提取的日间RSDs为2.8%～4.7%，样品回收率在72%～95%，标准偏差小于6.1%。整个处理过程中，吸附剂用量为4 mg，吸附时间为120 s，洗脱时间为60 s，相比其他方法在吸附剂用量和前处理时间上明显下降，大幅提高了样品前处理效率。

本试验方法简便、经济，回收率较高、检出限低、精密度高，说明磁性纳米粒子Fe₃O₄@SNW-1复合物对磺胺类化合物具有较好的吸附能力，有望推广到除牛奶以外的其他SAs的分析检测方法当中。

图 1 MaAQP1启动子的PCR鉴定

注：泳道1–2分别为随机挑取的2个启动子的PCR扩增产物，M为DNA Marker。

Figure 1. PCR identification of MaAQP1 promoter

Note：Lanes 1–2 are the PCR amplification products of 2 promoters picked at random, M is DNA Marker.

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图 2 诱饵质粒pHIS2-MaAQP1菌落PCR鉴定

注：M为DNA Marker，泳道1～6分别为随机挑取的6个pHIS2-A启菌落的扩增产物。

Figure 2. PCR results of bait plasmid pHIS2-MaAQP1 colony

Note：M is DNA Marker, Lanes 1–6 are the amplification products of 6 randomLy selected pHIS2-A starter colonies.

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图 3 诱饵自激活检测结果

Figure 3. Detection by self-activation bait

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图 4 RNA提取结果

注：M为DNA Marker，泳道1～2分别为提取的RNA扩增产物。

Figure 4. Results of RNA extraction

Note: M is DNA Marker; Lanes 1-2 are the RNA amplification products.

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图 5 电泳检测mRNA条带

Figure 5. Electrophoretic detection of mRNA bands

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图 6 cDNA文库插入片段电泳图

Figure 6. Electrophoresis of insert fragment in cDNA library

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表 1 酵母转化反应

Table 1 Yeast transformation reaction

反应 Reaction	AD质粒 AD plasmid	BD质粒 BD plasmid	转化平板 Conversion plate	检测平板 Detection plate	检测内容 Test content
1	——	pHIS2-pMaAQP1	SD-T	SD-TH+3AT	自激活检测 Self-activation detection
2	pGAD53m	pHIS2	SD-TL	SD-TLH+3AT	阴性对照 Negative control
3	pGAD53m	pHIS2-p53	SD-TL	SD-TLH+3AT	阳性对照 Positive control

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表 2 MaAQP1启动子元件分析

Table 2 Element analysis on MaAQP1 promoter

序号 Number	结合位点 TFBs	元件功能 Function of the motif	器官 Organism	序列 Sequence	位置 Position
1	AAGAA-motif	LRE	燕麦 Avena sativa	GAAAGAA/gGTAAAGAAA	−1 172,−1 178
2	ABRE	脱落酸响应 Abscisic acid responsiveness	拟南芥 Arabidopsis thaliana	ACGTG	−55,−863
3	AT～TATA-box	LRE	拟南芥 Arabidopsis thaliana	TATATA	−319,−343,−331,−355,−327,−353,−339,−363, −323,−347,−335,−359,−329,−351,−341,−321, −345,−333,−325,−337,−357,−349,−361
4	Box II	光响应元件 light responsive element	马铃薯 Solanum tuberosum	TGGTAATAA	−32
5	CAAT-box	核心启动子 Core promoter	烟草/拟南芥/豌豆 Nicotiana glutinosa/Arabidopsis thaliana/Pisum sativum	CAAT	−43,−459,−315,−316,−125,−583,−1 197, −208,−725,−421,−471,−158
6	CAT-box	分生组织表达 meristem expression	拟南芥 Arabidopsis thaliana	GCCACT	−254
7	CCAAT-box	结合位点 MYBHv1 binding site MYBHv1	大麦 Hordeum vulgare	CAACGG	−935
8	CGTCA-motif	响应 MeJA-responsiveness MeJA	大麦 Hordeum vulgare	CGTCA	−1 088
9	ERE	烯响应元件 ethylene-responsive element	烟草 Nicotiana glutinos	ATTTTAAA	−377,−775
11	GT1-motif	乙烯响应元件 light responsive element	燕麦 Avena sativa	GGTTAAT	−65
12	I-box	光响应元件 light responsive element	小麦/棉花 Triticum aestivum/ Gossypium hirsutum	AAGATAAGGCT/AGATAAGG	−611,−612
13	MYB	SRE	拟南芥 Arabidopsis thaliana	CAACCA	−151
14	MYB recognition site	SRE	拟南芥 Arabidopsis thaliana	CCGTTG	−878
15	MYC	SRE	拟南芥 Arabidopsis thaliana	CATTTG/CATGTG	−111,−264
16	TATA-box	核心启动子元件 Core promoter element	甘蓝/拟南芥 Brassica napus/ Arabidopsis thaliana	ATATAT/TATATA/taTATAAAtc/ATTATA	−318,−326,−323,−320,−328,−324,−332,−319, −327,−322,−321,−325,−330,−329,−333,−334, −335,−336,−343,−344,−345,−346,−347,−348, −349,−350,−351,−352,−353,−354,−355, −356,−357,−358,−359,−363,−364,−365, −389,−391,−837,−838
17	TGACG-motif	MeJA响应 MeJA-responsiveness	大麦 Hordeum vulgare	TGACG	−58,−226
18	Unnamed__1	未知 unknown	玉米 Zea mays	CGTGG	−864,−1 274
19	Unnamed__4	未知 unknown	欧芹 Petroselinum hortense	CTCC	−28,−1 016,−1 009,−1 353,−913,−1 255, −1 013,−1 261,−922
20	as-1	LRE	拟南芥 Arabidopsis thaliana	TGACG	−58,−226

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表 3 自激活检测结果

Table 3 Results of self-activation test

反应 Reaction	转化平板 Conversion plate	检测平板 Detection plate	检测内容 Test content	3AT/（mmol·L⁻¹）
				0	25		50
				生长数目 Growth number	生长数目 Growth number	25/0 生长比例 25/0 Growth ratio	生长数目 Growth number	50/0 生长比例 50/0 Growth ratio
1	SD-T	SD-TH	自激活检测 Self-activation detection	3 424	408	11.9%	68	1.9%
2	SD-TL	SD-TLH	阴性对照 Negative control	3 968	1 376	34.6%	31	0.7%
3	SD-TL	SD-TLH	阳性对照 Positive control	5 024	5 136	102.2%	4 160	82.8%

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参考文献(27)

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[6]	WANG R, WANG M, CHEN K, et al. Exploring the roles of aquaporins in plant-microbe interactions [J]. Cells, 2018, 7(12): 267. DOI: 10.3390/cells7120267
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施引文献(2)

期刊类型引用(2)

1.	颜少宾，郭瑞，周平，周丹蓉，金光. 不同套袋处理对桃果实品质的影响. 食品安全质量检测学报. 2024(21): 115-123 . 百度学术
2.	颜少宾，周平，张妤艳，马瑞娟，俞明亮，金光，郭瑞. 光质对红肉桃果肉色泽、类胡萝卜素组分含量的影响. 江苏农业科学. 2021(20): 143-147 . 百度学术

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0. 引言
1. 材料与方法
1.1 仪器与设备
1.2 材料与试剂
1.3 试验方法
1.3.1 Fe3O4的制备
1.3.2 磁性共价有机骨架材料的制备
1.3.3 磁性固相萃取（MSPE）条件的优化
1.3.4 高效液相色谱检测条件
1.3.5 SAs的MSPE操作流程
1.3.6 空白牛奶和加标牛奶样品前处理
2. 结果与分析
2.1 合成材料的结构表征
2.1.1 透射电镜表征
2.1.2 X射线衍射（X-ray diffraction Analysis, XRD）表征
2.1.3 氮气吸附表征（Nitrogen adsorption-desorption）
2.2 MSPE条件优化
2.2.1 吸附剂用量和吸附时间的影响
2.2.2 溶液pH和离子强度的影响
2.2.3 洗脱剂种类的影响
2.2.4 洗脱剂用量及洗脱时间的影响
2.3 标准曲线、检出限以及精密度
2.4 实际样品分析
2.5 方法比较
3. 讨论与结论

0. 引言
1. 材料与方法
1.1 仪器与设备
1.2 材料与试剂
1.3 试验方法
1.3.1 Fe₃O₄的制备
1.3.2 磁性共价有机骨架材料的制备
1.3.3 磁性固相萃取（MSPE）条件的优化
1.3.4 高效液相色谱检测条件
1.3.5 SAs的MSPE操作流程
1.3.6 空白牛奶和加标牛奶样品前处理
2. 结果与分析
2.1 合成材料的结构表征
2.1.1 透射电镜表征
2.1.2 X射线衍射（X-ray diffraction Analysis, XRD）表征
2.1.3 氮气吸附表征（Nitrogen adsorption-desorption）
2.2 MSPE条件优化
2.2.1 吸附剂用量和吸附时间的影响
2.2.2 溶液pH和离子强度的影响
2.2.3 洗脱剂种类的影响
2.2.4 洗脱剂用量及洗脱时间的影响
2.3 标准曲线、检出限以及精密度
2.4 实际样品分析
2.5 方法比较
3. 讨论与结论

参考文献(27)

施引文献

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香蕉MaAQP1启动子诱饵载体及干旱胁迫酵母单杂交cDNA文库的构建

作者简介: 许奕（1985−），女，硕士，研究方向：作物遗传育种（E-mail：lukydog163@163.com）

通讯作者: 李敬阳（1976−），男，硕士，副研究员，研究方向：作物遗传育种（E-mail：jingyanglee@163.com）

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