Transcriptome Analysis on Cryotherapy-treated Virus-free Plantlets of Red Bud Taro at Yanshan, Jiangxi Province
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摘要:目的 探究江西铅山红芽芋对超低温疗法脱毒的转录组响应机制，为江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒苗的规模化应用奠定理论依据。方法 以江西铅山红芽芋超低温疗法脱毒苗（VF组）和江西铅山红芽芋超低温疗法带毒苗（V组）试验材料进行转录组比较分析。结果 VF组Clean reads为42 406 188，GC含量为54.09%；V组Clean reads为46 818 060，GC含量为50.36%。VF组和V组表达量FPKM的对数值在0～2，表达量密度在0～0.8。VF组和V组表达的共有基因数为23 820，V组单独表达的基因数为10 298，VF组单独表达的基因数为4 477。VF组和V组表达量的相关系数为0.287，样本间相关性较差。VF组和V组共产生差异表达基因5 282 个，与V组比较，VF组上调基因3 011，下调基因2 271。GO 富集分析显示，差异基因主要注释到过氧化氢分解过程、过氧化氢代谢过程、一元羧酸生物合成过程、多糖分解代谢过程、金属离子输运、细胞外区、细胞壁、外部封装结构、膜的固有成分、质膜固有成分、核酸结合转录因子活性、序列特异性DNA结合转录因子活性、单加氧酶活性、铁离子结合、血红素结合等功能。KEGG 富集分析显示，差异基因主要注释到苯丙酸生物合成、类黄酮生物合成、二苯乙烯类和二芳基庚烷类以及姜辣素的生物合成、MAPK信号通路-植物、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、植物激素信号转导、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、过氧化物酶体、α-亚麻酸代谢、苯丙氨酸代谢、氰胺酸代谢、类胡萝卜素生物合成、异喹啉生物碱的生物合成、泛醌和其他萜类醌的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、植物昼夜节律、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等途径。结论 F-box家族蛋白、脱落酸受体PYR1、乙烯受体2、生长素响应因子1、BZIP转录因子家族蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶1、超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、植物抗病反应蛋白、抗病蛋白、抗病蛋白RPS2、抗病蛋白RPS5、抗病蛋白RGA2、抗病反应蛋白、转座子TNT的逆转录病毒相关Pol多蛋白、逆转录病毒相关Pol多聚蛋白系1、类烟草病毒增殖蛋白3、烟草病毒增殖蛋白1、转座子RE1的逆转录病毒相关Pol多蛋白、蔗糖合成酶等基因是江西铅山红芽芋的超低温疗法脱毒的主要响应基因。Abstract:Objective Mechanism of red bud taro in response to cryotherapy was studied by transcriptome analysis for extended application of the virus-free seedlings at Yanshan, Jiangxi.Method Transcriptomes of virus-free (VF) and virus-carrying (V) red bud taro plantlets that had been cryo-therapeutically treated were analyzed and compared.Result In the VF plantlets, the clean reads were 42 406 188 with a GC content of 54.09%; while, in the V plantlets, the clean reads were 46 818 060 with a GC content of 50.36%. For either group, the FPKM was between 0-2, and the expression density between 0-0.8. There were 23 820 genes commonly expressed in both VF and V, while 4 477 independently expressed in VF, and 10 298 in V. There was a low correlation between VF and V with a coefficient of 0.287, and were 5 282 differentially expressed genes (DEG) in them. Compared to V, VF had 3 011 genes were up-regulated and 2 271 down-regulated. The Go enrichment analysis showed that the differential genes were annotated mainly in the processes of hydrogen peroxide catabolism, hydrogen peroxide metabolism, monocarboxylic acid biosynthesis, and polysaccharide catabolism, metal ion transport, extracellular region, cell wall, external encapsulating structure, intrinsic components of membrane and plasma membrane as well as the activities of nucleic acid binding transcription factor, transcription factor, sequence-specific DNA binding, monooxygenase, iron ion binding, heme binding, etc. The KEGG enrichment analysis indicated that the differential genes were annotated largely to the biosynthesis of phenylpropanoid, flavonoid, stilbenoid, diarylheptanoid, gingerol, carotenoid, isoquinoline alkaloid, ubiquinone, and other terpenoid-quinones, the metabolisms of starch, sucrose, tyrosine, alpha-Linolenic acid, phenylalanine, cyanoamino acid, glycine, serine, threonine, fructose, mannose, galactose, amino sugar, and nucleotide sugar, and the pathways of MAPK signaling-plant, plant hormone signal transduction, pentose and glucuronate interconversions, peroxisome, circadian rhythm-plant, and others,Conclusion The genes of F-box family protein, abscisic acid receptor PYR1, ethylene receptor 2, auxin response factor 1, BZIP transcription factor family protein, peroxidase, catalase 1, superoxide dismutase [Cu-Zn], plant disease resistance response protein, disease resistance protein, disease resistance protein RPS2, disease resistance protein RPS5, disease resistance protein RGA2, disease resistance response protein, retrovirus-related Pol polyprotein from transposon TNT, retrovirus-related Pol polyprotein LINE-1, tobamovirus multiplication protein 3-like, tobamovirus multiplication protein 1, retrovirus-related Pol polyprotein from transposon RE1, sucrose synthase, etc. were the predominant genes in the virus-free red bud taro plantlets that responded to the cryotherapy.
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0. 引言
【研究意义】磺胺类药物（Sulfonamides, SAs）是一类用于细菌性疾病的预防与治疗的化学治疗药物[1-2]。该药物因抑菌效果好、价格低廉而被广泛应用于治疗奶牛中频发的乳房炎，故而在牛奶中被检测出的概率很高。SAs在动物性食品中容易残留，长期摄入含SAs的奶制品，将危及人体健康[3]。因此，包括中国在内的许多国家都制定了食品和饲料中SAs的最大允许残留限量和相应的检测方法[4-5]。高效液相色谱-质谱联用是检测SAs在牛奶中残留量的标准方法[6]，但由于SAs在牛奶中的浓度低，且牛奶中有如脂肪、蛋白质等干扰物的影响[7]，选择性分离牛奶中痕量SAs的前处理显得尤为重要。【前人研究进展】对食品中SAs提取的传统方法为液液萃取，但需消耗大量有机溶剂，共萃取杂质较多，步骤繁杂[8]。而新兴的方法，如超临界萃取[9-10]，虽具有环保、快速、无副反应、选择性高等优点，但其需专门的仪器，运行和维护费用昂贵。固相微萃取[11-12]相比于其他萃取方法，操作简便，有机溶剂用量极少，但检测结果相对标准偏差较大。磁性固相萃取[13]（Magnetic solid phase extraction, MSPE）是以磁性或可磁化的材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术，具有萃取面积更大、简单便捷、可重复使用且能避免杂质干扰等诸多优点[14-16]。王露等[17]和Tolmacheva等[18]用MSPE对牛乳中的4种SAs进行富集萃取后用HPLC检测其残留量，均取得较为理想的效果。MSPE的核心在于磁性吸附剂，设计并合成具有高效吸附性能的磁性吸附剂是MSPE的关键所在。【本研究切入点】共价有机骨架（Covalent organic frameworks, COFs）[19-20]是一类由有机单体通过共价键形成有周期性网络结构的晶体聚合物。COFs具有比表面积高、密度轻、易修饰及结构稳定等优点。COFs广泛应用于样品前处理中，包含固相萃取、固相微萃取及磁性固相萃取等[21-23]。SNW-1是由三聚氰胺和对苯二胺在一定条件下制备而成的一种席夫碱型COFs[24]。相比其他COFs，SNW-1的合成原料便宜、易得，而且SNW-1具有较高的比表面积。目前，磁性SNW-1的制备及其在样品前处理中的应用还未见相关报道。【拟解决的关键问题】本文通过水热合成法制备磁性SNW-1（Fe3O4@SNW-1），将其作为磁性固相萃取的吸附剂，在萃取与洗脱效果的关键参数上进行优化，结合高效液相色谱，为牛奶中5种痕量磺胺类药物的残留检测提供便捷快速的分析方法。
1. 材料与方法
1.1 仪器与设备
透射电子显微镜（FEI Tecnai G20，美国FEI公司）；扫描电子显微镜（FEI Inspect F50，美国FEI公司）；冰箱（KG20V31T1，博西家电销售公司）；氮吹仪（MG-2200，上海虔钧科学仪器有限公司） ；电子天平（ME204E/02，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超声波清洗器（KQ5200E，昆明市超声仪器有限公司）；循环水式真空泵（SHB-III，郑州紫拓仪器设备有限公司）；Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；高效液相色谱仪[LC-20A，岛津-GL（上海）商贸有限公司]；涡旋混合器（Vortex QL-902，上海之信仪器有限公司） ；高速冷冻离心机（GL-21M，长沙湘智离心机仪器有限公司）。
1.2 材料与试剂
六水三氯化铁（FeCl3·6H2O）、醋酸钠、柠檬酸钠二水（Na3Cit·2H2O）、磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine, SMZ）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine, SMR）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole, SMX）标准品：上海源叶生物科技有限公司；磺胺嘧啶（Sulfadiazine, SDZ）、磺胺间甲基嘧啶（sulfamonomethoxine, SMM）标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈、醋酸铅：国药集团化学试剂有限公司；氨水、乙酸：西陇科技股份有限公司；伊利牛奶：内蒙古伊利实业集团股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 Fe3O4的制备
将FeCl3·6H2O（6.8 g）、醋酸钠（12.0 g）和Na3Cit·2H2O（2.0 g）溶解在200 mL乙二醇中，将所得黄色的均相溶液放进高压反应釜中加热（200 ℃，10 h）。反应结束后，用磁铁将Fe3O4从产品中分离出来后用清水和乙醇反复清洗干净，真空环境下80 ℃干燥12 h。
1.3.2 磁性共价有机骨架材料的制备
将2.0 g三聚氰胺溶解于62 mL二甲基亚砜（DMSO）中，其次将0.3 g Fe3O4分散于上述溶液并超声分散10 min，最后加入1.26 g对苯二甲醛，在180 ℃条件下机械搅拌6 h。反应结束后，依次使用丙酮、二氯甲烷和三氟乙酸将磁性材料清洗干净，并在80 ℃的真空条件下过夜干燥，得到磁性复合物Fe3O4@SNW-1，其结构示意图如图1。
1.3.3 磁性固相萃取（MSPE）条件的优化
（1）MSPE温度和时间的优化
保持其他磁性固相萃取条件不变，测定不同吸附剂用量（1.0～6.0 mg）和在不同水浴吸附时间（15、60、120和150 s）下SAs的回收率。
（2）溶液pH和离子强度的优化
保持其他磁性固相萃取条件不变，测定不同样品溶液pH值（2、4、6、7、8、10）以及NaCl剂量（0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol·L−1）下SAs的回收率。
（3）洗脱剂种类的选择
保持其他磁性固相萃取条件不变，测定不同洗脱溶剂[v（氨水）∶v（甲醇）= 5∶95， v（乙酸）∶v（甲醇）=5∶95， v（氨水）∶ v（乙腈）= 5∶95， v（乙酸）∶v（乙腈）=5∶95，乙腈，甲醇]下SAs的回收率。
（4）洗脱剂用量和洗脱时间的优化
保持其他磁性固相萃取条件不变，考察洗脱剂用量变化（0.5、1、1.5、2、2.5、3 mol·L−1）以及洗脱时间变化（15、30、45、60、75、90 s）下SAs的回收率。
1.3.4 高效液相色谱检测条件
配备有2个LC-20AT溶剂输送单元和SPD-M20A PDA检测器（Shimadzu, Kyoto, Japan）的LC-20A HPLC系统，检测器的检测波长：269 nm；C18柱（Eclipse XDB-C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）；流动相：乙腈-乙酸水（含1%乙酸）（20∶80，v/v），等梯度洗脱；进样量：20 μL；流速：1.00 mL·min−1；柱温：25 ℃。
1.3.5 SAs的MSPE操作流程
SAs吸附与富集整个MSPE技术操作流程详见图2。首先，将4.0 mg Fe3O4@SNW-1加入10 mL样品溶液，涡旋2 min，用磁铁将Fe3O4@SNW-1与溶液分离并倒掉溶液。其次，加入2 mL洗脱剂，涡旋1 min，磁铁将Fe3O4@SNW-1与洗脱液分离，将收集的洗脱液在40 ℃下氮吹至干。最后，用0.5 mL乙腈-乙酸水（含1%乙酸）（20∶80，v/v）的流动相定容待测样品，用针管移至进样瓶中，待上机检测。
1.3.6 空白牛奶和加标牛奶样品前处理
准确称取250 mL的牛奶（配置100 ng·mL−1的磺胺类药物的牛奶250 mL），加入16%醋酸铅250 mL，搅拌，超声数分钟直至混匀，装入等量离心瓶中，放入高速冷冻离心机，转速为4 000 r·min−1，离心15 min，取出，收集离心瓶中的上清液备用。
2. 结果与分析
2.1 合成材料的结构表征
2.1.1 透射电镜表征
由透射电镜表征结果见图3-A，可以看出Fe3O4磁粒子是规则的圆球，粒径为200～400 nm。从图3-B中可清晰发现，在Fe3O4磁粒子的表面包裹了一层致密的纳米级颗粒构成的核壳结构的复合材料即Fe3O4@SNW-1。透射电镜结果可证实SNW-1已成功负载在Fe3O4磁粒子上，制备成具有核壳结构的Fe3O4@SNW-1复合材料。
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图 3 Fe3O4及Fe3O4@SNW-1透射电镜表征结果注：a: Fe3O4; b: Fe3O4@SNW-1。Figure 3. TEM images of Fe3O4 and Fe3O4@SNW-1Note：a: Fe3O4; b: Fe3O4@SNW-1.2.1.2 X射线衍射（X-ray diffraction Analysis, XRD）表征
图4为Fe3O4和Fe3O4@SNW-1晶体结构的XRD衍射表征。从结果可以看出，Fe3O4@SNW-1的XRD衍射峰包含了Fe3O4所有的特征衍射峰。此外在25 °左右出现1个较宽的衍射峰，是SNW-1的特征衍射峰，说明SNW-1是一种无定型结构。XRD的结果充分说明了本试验成功制备了Fe3O4@SNW-1复合材料。
2.1.3 氮气吸附表征（Nitrogen adsorption-desorption）
Fe3O4和Fe3O4@SNW-1的多孔特性通过氮气吸附表征，氮气吸附-脱附结果，如图5所示。Fe3O4的BET（Brunner-Emmet-Teller）比表面积为69.0 m2·g−1，孔体积为0.096 7 cm3·g−1，孔径为5.6 nm。Fe3O4@SNW-1的BET比表面积为132.7 m2·g−1，孔体积为0.44 cm3·g−1，孔径为18.6 nm。Fe3O4@SNW-1复合材料的BET比表面积、孔体积相比Fe3O4有大幅增加，这主要是因为SNW-1的多孔特性，使其与Fe3O4结合成的复合材料具有更大的比表面积和孔体积。
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图 5 Fe3O4和Fe3O4@SNW-1的氮气吸附表征Figure 5. Nitrogen adsorption characterization on Fe3O4 and Fe3O4@SNW-12.2 MSPE条件优化
2.2.1 吸附剂用量和吸附时间的影响
首先考察Fe3O4@SNW-1吸附剂用量在1.0～6.0 mg对样品回收率的影响。如图6所示，随着吸附剂用量从1.0 mg增加到4.0 mg，SAs的回收率增加，当吸附剂用量为4.0 mg时，SAs的回收率最高。在此之后，回收率虽有所波动，但基本趋于平稳。故选择吸附剂Fe3O4@SNW-1的用量4.0 mg用于进一步研究。
考察范围为15～150 s的吸附时间对5种SAs回收率的影响。如图7所示，在所考察的范围内，SAs的回收率较为稳定，在120 s吸附达到平衡，之后回收率基本保持不变。固吸附时间控制在120 s。
2.2.2 溶液pH和离子强度的影响
SAs为两性化合物[17]，样品溶液的pH值在吸附过程中起着重要作用，因为它会影响吸附剂的表面电荷以及SAs的存在形式，从而影响SAs在MSPE上的吸附率进而影响其回收率。试验中研究了样品溶液的pH值在2.0～10.0对于回收率的影响。从图8可以看出，在pH为6.0时SAs回收率最高。pH为6.0时，大多数SAs将以中性形式存在，小部分以离子形式存在。因而，Fe3O4@SNW-1通过π-π作用力和疏水作用力吸附SAs。故选择样品溶液的pH为6.0。
此外，离子强度对SAs回收率的影响见图9。从结果可以看出，离子强度对样品回收率的影响不大。结果说明静电作用力不是Fe3O4@SNW-1吸附SAs的主要吸附机制。相反，π-π相互作用和疏水作用才是Fe3O4@SNW-1吸附SAs的主要吸附机制。因此，在随后的实际样中没有向样品中加入NaCl。
2.2.3 洗脱剂种类的影响
为了从磁性固相萃取中获得SAs较高的回收率，试验使用了磺胺类药物较易溶解的氨水-甲醇（5∶95，v/v）、乙酸-甲醇（5∶95, v/v）、氨水-乙腈（5∶95，v/v）、乙酸-乙腈（5∶95，v/v）、乙腈、甲醇等极性溶剂作为洗脱溶剂，考察其对SAs回收率的影响。如图10所示，氨水-甲醇（5∶95，v/v）溶液在这6种洗脱溶剂中具有最佳洗脱能力。因此，选择氨水-甲醇（5∶95，v/v）作为洗脱溶剂。
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图 10 不同洗脱溶剂的影响注：1.v（氨水）: v（甲醇）= 5:95， 2.v（乙酸）: v（甲醇）=5:95， 3.v（氨水）: v（乙腈）= 5:95， 4.v（乙酸）: v（乙腈）=5:95，5.乙腈，6.甲醇。Figure 10. Effect of eluent on testingNote: 1. ammonia -methanol(5:95, v/v); 2. acetic acid - methanol(5:95, v/v); 3. ammonia - acetonitrile(5:95, v/v); 4. acetic acid - acetonitrile(5:95, v/v); 5. acetonitrile; 6. methanol.2.2.4 洗脱剂用量及洗脱时间的影响
研究氨水-甲醇（5∶95，v/v）从0.5～3.0 mL的剂量范围对SAs回收率的影响。结果如图11所示，随着洗脱剂的体积从0.5 mL增加到2.0 mL，SAs的回收率呈上升趋势，当洗脱量为2.0 mL时，SAs的回收率达到最高。随后SAs的回收率趋于平稳，说明洗脱基本达到平衡，因此将氨水-甲醇（5∶95，v/v）的体积定为2.0 mL。
考察了洗脱时间在15～90 s对5种SAs回收率的影响。如图12所示，随着洗脱时间的增加，回收率逐渐加强，当洗脱时间为60 s，回收率达到最高，之后的回收率不再发生明显变化，因此选择洗脱时间为60 s。
2.3 标准曲线、检出限以及精密度
MSPE/HPLC方法对5种SAs混合标准溶液进行测定，并绘制标准曲线。其分析数据见表1。该方法为SAs的10～100 ng·mL−1具有良好的线性，相关系数较高（R2＞0.9948）。对于质量浓度为50 ng·mL−1的工作样品的5次重复，所提出的方法的日间精密度（RSD %）为2.4%～3.4%，显示出测定SAs的高精度。
表 1 以磁性COF为吸附剂的MSPE/HPLC测定SAs的检出限及精密度Table 1. Detecting limit and precision of MSPE/HPLC method using magnetic COF as adsorbent on SA determination分析物
Analyte线性范围
Linear range/（ng·mL−1）线性方程
Regression equation相关系数
Correlation coefficient检出限
Limit of detection/（ng·mL−1）相对标准偏差
RSD/%SDZ 10～100 y=643798x−416.89 0.999 0 1.7 3.4 SMR 10～100 y=783 373x−543.79 0.998 1 1.7 2.8 SMZ 10～100 y=697 128x−256.47 0.999 6 2.0 2.4 SMM 10～100 y=754 506x−551 0.999 3 2.4 2.5 SMX 10～100 y=654 838x− 2 976.6 0.994 8 2.7 2.8 2.4 实际样品分析
对牛奶样品进行实际分析，以证明该方法的实用性。在牛奶样品中分别加入20、50、100 ng·mL−1的SAs，采用3次重复试验的平均值，进行了加标回收试验。如表2所示，5种SAs的回收率在72%～95%。图13显示了经前处理后空白牛奶样品、添加100 ng·mL−1SAs的加标牛奶样品的色谱图以及用MSPE进行前处理的加标牛奶样品的色谱图，从图中可以看出，5种磺胺类组分峰与杂质能很好分离，且峰形好，在13 min内能完成样品的检测。以上结果表明，所建立的MSPE/HPLC方法对复杂的牛奶样品中痕量SAs的同时分离和测定是切实可行的。
表 2 牛奶样品中SAs的分析结果Table 2. Analysis of SAs in milk samples分析物
Analyte添加量
Added/（ng·g−1）牛奶 Milk 测定值
Found/（ng·g−1）回收率
Recovery/%相对标准偏差
RSD/%SDZ 0 ND – – 20 16.8 84 3.2 50 38.5 77 2.8 100 72 72 4.4 SMR 0 ND – – 20 18.6 93 6.1 50 41 82 4.6 100 79 79 5.3 SMZ 0 nd – – 20 19 95 2.3 50 41.5 83 3.5 100 81 81 5.8 SMM 0 ND – – 20 16.6 83 4.9 50 40 80 3.1 100 81 81 5.9 SMX 0 ND – – 20 17.6 88 5.7 50 44 88 4.7 100 86 86 3.4 注：ND: 未检出。
Note：ND means not detected.![]()
图 13 不同处理样品色谱图注：A：空白牛奶样品的色谱图；B：加标牛奶样品的色谱图；C：采用MSPE处理的加标牛奶样品的色谱图。Figure 13. Chromatograms of samplesNote: A: Chromatogram of milk samples; B: Chromatogram of spiked milk samples after extraction; C: Chromatogram of spiked milk samples with MSPE.2.5 方法比较
为了评估Fe3O4@SNW-1作为磁性固相萃取的吸附剂的性能，从吸附剂的量、样品量、洗脱量和LODs的角度，将其与前人采用MSPE对SAs前处理的效果的测定方法进行了比较[18, 25-27]。结果表明（表3） ：当前所提出的方法仅需要4 mg吸附剂，这比大多数已报道的方法要小，表明Fe3O4@SNW-1对SAs的吸附能力优异。另外，目前的方法消耗的样品和洗脱量很少，可以减少操作时间并满足实际应用，且与其他磁性固相萃取技相比，只需较短的萃取时间就能实现高效萃取。最后，与报道的方法相比，当前方法的灵敏度优于或与已报道的方法相当。因此，所提出的MSPE/HPLC方法可用于复杂基质中痕量SAs的灵敏测定。
表 3 所提方法与文献中其他方法的比较Table 3. Comparison between MSPE/HPLC and other existing methods吸附剂
Sorbent方法
Method样品
Sample吸附剂量
Amount of
Sorbent/mg样品容量
Sample volume/
mL萃取时间
Extraction time/
min洗脱剂体积
Elution volume/
mL检测限
LODs/（ng·mL−1）参考文献
ReferenceFe3O4-SiO2-phenyl MSPE/HPLC 牛奶 Milk 100 10 5 3 7～14 [25] Fe3O4-graphene oxide MSPE/HPLC 水 Water 5 1 20 1 50～100 [26] HCP-Fe3O4 MSPE/HPLC 牛奶 Milk 20 25 5 2 2.0～2.5 [18] CoFe2O4-graphene MSPE/HPLC 牛奶 Milk 15 100 20 0.5 1.16～1.59 [27] Fe3O4@SNW-1 MSPE/HPLC 牛奶 Milk 4 10 2 2.0 1.7～2.7 本研究 This work 3. 讨论与结论
MSPE技术富集的样品可以广泛运用于农药残留、食品添加剂、抗生素、激素类及重金属离子，且通过该技术所得的回收率绝大部分在80%～120%，检出限基本都能达到ng·mL−1（或ng·g−1）数量级，加之涵盖了食品分析领域的大部分区域，因此有着极为理想的应用前景[28]。
本研究通过水热法合成Fe3O4@SNW-1作为磁性吸附剂，通过透射电镜表征和X射线衍射，验证制备成具有核壳结构的Fe3O4@SNW-1复合材料，后通过氮气吸附表征，也证明复合材料的多孔性以及比表面积大的特点。该合成方法利用共价有机骨架来修饰磁性纳米颗粒，既保持共价有机骨架具有的由共轭和富含氮的、结构单元构成的微孔网络结构所表现出的吸附富集性能，又缩短萃取材料和溶液的分离时间[25]，所用到的磁性吸附剂在目前MSPE当中鲜有报道。
在MSPE吸附过程中Fe3O4@SNW-1可通过π-π作用力和疏水作用力吸附SAs。通过MSPE与HPLC联用，在对吸附剂用量、吸附时间、溶液pH、洗脱剂种类、洗脱剂用量和洗脱时间等参数优化后，可高效检测出牛奶中5种痕量磺胺类药物。本研究所建立方法的检测限在1.7～2.7 ng·mL−1，5种SAs（每种50 ng·mL−1）的5次重复提取的日间RSDs为2.8%～4.7%，样品回收率在72%～95%，标准偏差小于6.1%。整个处理过程中，吸附剂用量为4 mg，吸附时间为120 s，洗脱时间为60 s，相比其他方法在吸附剂用量和前处理时间上明显下降，大幅提高了样品前处理效率。
本试验方法简便、经济，回收率较高、检出限低、精密度高，说明磁性纳米粒子Fe3O4@SNW-1复合物对磺胺类化合物具有较好的吸附能力，有望推广到除牛奶以外的其他SAs的分析检测方法当中。
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图 1 VF组和V组表达量分布盒形图（A）和密度图（B）
Figure 1. Box diagram (A) and density diagram (B) on gene expression distributions of VF and V plantlets
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图 4 VF组和V组表达量差异火山图（A）和表达量差异散点图（B）
Figure 4. Volcano map (left) and scatter map (right) on gene expression difference between VF and V plantlets
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图 5 VF组和V组差异表达基因GO富集分析柱形图（A）和气泡图（B）
Figure 5. Column map (A) and bubble map (B) of Go enrichment analysis on differentially expressed genes of VF and V plantlets
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图 6 差异表达基因KEGG富集分析柱形图（A）和气泡图（B）
Figure 6. Column chart (A) and bubble chart (B) of KEGG enrichment analysis on differentially expressed genes
表 1 qRT-PCR引物序列
Table 1 Primers designed for qRT-PCR
基因
Gene方向
Direction引物序列
Primer sequence（5′-3′）大小
Size/bpTM值
TM value抗病反应蛋白 Disease resistance response protein F TTCGCGACGAAAGGTAAAACGA 105 55 R CACCCACAGGATGGACCAGAGG 抗病蛋白RGA2 Disease resistance protein RGA2 F CGGTTCAGAAGGGAGCCTATTGT 199 53.3 R AAACTCTTATACCTTTGGGGGGC 乙烯受体2 Ethylene receptor 2 F TCCCTTTTGACCTTGTTCTTTTG 137 52 R TACATTCTCCCGTGTACTTGCAG 过氧化氢酶1 Catalase 1 F CAGTGTCAAGACACGGTCGCATG 198 53.8 R CTAGTAACCGCTAGGGCCGTTGG 蔗糖合成酶 Sucrose synthase F GCCCCGTCTTATTCATACCCTCG 173 54.6 R CATGCTTTTCCCATTTTGTCCTCA 抗病蛋白RPS5 Disease resistance protein RPS5 F GTCCCAACTTATCCGTCATTTCT 168 51.4 R TAAAGGAGCTGCCACTCACAGTC 抗病蛋白 Disease resistance protein F TGTGTCTCCCTCCAGTGCTCA 145 53.6 R TTTCTCGCCCCCCCTGTTCA 类烟草病毒增殖蛋白3 Tobamovirus multiplication protein 3-like F GGTGTCTCGTTGTTTGCTGCTC 103 52.1 R GTTTCTTGCGTCGCCCTTTC 植物抗病反应蛋白 Plant disease resistance response protein F TGCCCTGAGCGTTCCCTAC 178 58.3 R ACCCGCCTCCACTTCTTCC F-box家族蛋白 F-box family protein F CGCCAAGAGGGAAATGAAACC 195 58.5 R CGGGAACATGGAGCAGTGGTA 超氧化物歧化酶[Cu-Zn] Superoxide dismutase [Cu-Zn] F CTGAGGCAACGATTGTGGATA 130 53.2 R CCCGTGCTAAGGCTAAGTTCAT 逆转录病毒相关Pol多聚蛋白系-1
Retrovirus-related Pol polyprotein line-1F CCCTTCTTTGTTAATGCCCACCA 156 49.9 R CGTCCTTAATGCACGGAAGCA 转座子RE1的逆转录病毒相关Pol多蛋白
Retrovirus-related Pol polyprotein from transposon RE1F GTCCAGATTGAAGTCGCTCCC 117 53.5 R CCTTGTACTGTGACAACAATGCC 转座子TNT逆转录病毒相关Pol多蛋白
Retrovirus-related Pol polyprotein from transposon TNTF GATAGACCATCAGGCACTTTAGG 151 48.5 R CTAAGTCATTCTTGGGACACTGTAA BZIP转录因子家族蛋白 BZIP transcription factor family protein F CATCGCCGAGCACTTGCACCGTCTC 95 55.6 R GCTTCTGGCATCTTTACCACTTTC 过氧化物酶 Peroxidase F CCAACTCCCAGGACTTCTTCTTCC 136 57.9 R CTGGCTGGCTAGTGGTGCTTGTT 脱落酸受体PYR1 Abscisic acid receptor PYR1 F CTCCATTTCGCCCTGATTCCATT 139 54.6 R TCAAACATCCCTTTCACCATTCCTAT 抗病蛋白RPS2 Disease resistance protein RPS2 F ATCCATTCCTTGCCAGATGAC 115 53.4 R ACCTTATTAACCGCAGCACCA 生长素反应因子1 Auxin response factor 1 F CTTTCACGCCCAATCGACCAC 169 57.6 R TCGGCTTCTTGCTTTCTGCTGTC 烟草病毒增殖蛋白1 Tobamovirus multiplication protein 1 F CTGTGGGAAGACTTCTTGCCTGAT 108 50.9 R TCGCTTTGGTATTATTGGACCTG 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH （内参 Reference gene） F ATCAAGCCCTCAACAATGCCAAA 179 54.8 R GCCAAGAAGGTCGTCATCTCAGC 
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表 2 V组和VF组测序数据统计
Table 2 Statistical sequencing data on V and VF plantlets
样本 Sample 带毒苗 V 脱毒苗 VF 原始序列
Raw reads47 418 842 43 025 444 原始总碱基数
Raw bases7 160 245 142 6 496 842 044 过滤后序列
Clean reads46 818 060 42 406 188 质控后总碱基数
Clean bases6 964 653 736 6 305 931 529 测序错误率
Error rate/%0.023 1 0.024 6 大于20的碱基数占总碱基的百分比
Q20/%98.83 98.26 大于30的碱基数占总碱基的百分比
Q30/%96.08 94.50 G、C碱基的总数量占总碱基数量的百分比
GC content/%50.36 54.09
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表 3 测序数据与组装结果比对统计
Table 3 Comparison on sequencing data and assembly results
样本
Sample过滤后测序
数据的条数
Clean reads能比对到组装
转录本上的
Clean reads数
Mapped reads能定位到组装转
录本上的Clean
reads所占百分比
Mapped ratio/%脱毒苗VF 42 406 188 34 683 956 81.79 带毒苗V 46 818 060 38 036 872 81.24
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表 4 VF组和V组表达量差异统计（前10）
Table 4 Top 10 statistical expression differences between VF and V plantlets
基因编号
Gene_ID差异表达倍数
FC（VF/V）差异表达倍数
以2为底的
对数值
log2FC
（VF/V）P值
P value矫正后 P值
P adjust显著性
Significance调节
Regulate带毒苗
表达量
Expression
in V脱毒苗
表达量
Expression
in VFNR描述
NR
descriptionTRINITY_DN56_c0_g1 5.15×10−6 −17.57 5.30×10−41 1.65×10−36 是 Yes 下调
Down33445.52 0.12 假设蛋白质
Hypothetical proteinTRINITY_DN56_c1_g1 5.39×10−6 −17.50 8.29×10−41 1.65×10−36 是 Yes 下调
Down2710.44 0.01 假设蛋白质
MIMGU_mgv1a026582mg,
hypothetical protein
MIMGU_mgv1a026582mgTRINITY_DN388_c0_g1 1.36×10−5 −16.16 4.43×10−40 5.88×10−36 是 Yes 下调
Down37524.60 0.40 假设蛋白质
Hypothetical proteinTRINITY_DN56_c0_g2 2.62×10−5 −15.22 7.54×10−40 7.52×10−36 是Yes 下调
Down24571.29 0.53 假设蛋白质
Hypothetical proteinTRINITY_DN1368_c0_g1 2.82×10−5 −15.11 8.27×10−39 6.59×10−35 是 Yes 下调
Down16978.15 0.39 未注释 No TRINITY_DN863_c0_g2 2.14×10−5 −15.51 4.02×10−38 2.67×10−34 是 Yes 下调
Down2861.27 0.05 假设蛋白质
MIMGU_mgv1a026582mg hypothetical protein MIMGU_mgv1a026582mgTRINITY_DN1333_c0_g1 2.42×10−5 −15.33 1.41×10−37 8.01×10−34 是 Yes 下调
Down8296.82 0.16 未注释 No TRINITY_DN893_c0_g2 2.93×10−6 −18.38 3.72×10−35 1.86×10−31 是 Yes 下调
Down11335.30 0.00 假设蛋白质
Hypothetical proteinTRINITY_DN4426_c0_g1 8.51×10−5 −13.52 7.01×10−35 3.11×10−31 是 Yes 下调
Down31665.60 4.91 假设蛋白质
Hypothetical proteinTRINITY_DN6139_c0_g1 6.48×10−5 −13.91 4.83×10−34 1.93×10−30 是 Yes 下调
Down17471.00 0.87 外壳蛋白
Coat protein
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表 5 部分差异表达基因GO富集结果
Table 5 GO enrichment results of some differentially expressed genes
富集到该GO term的基因
转录本数目
Number of genes enriched to the GO termGO Term对应
的编号
ID Corresponding
to Go termGO三大分类
Three categories
of GOGO功能描述
Go function description该GO在目
标基因集中
占有的比例
The proportion of the GO in the target gene set/%该GO在背景基因转录本中占有的比例
The proportion of the GO in the background gene/%未经校正
的P值
P value
uncorrected校正后
的P值
P value
corrected37 GO:0042744 生物过程 BP 过氧化氢分解过程
Hydrogen peroxide catabolic process0.62 0.35 0.00 0.00 37 GO:0042743 生物过程 BP 过氧化氢代谢过程
Hydrogen peroxide metabolic process0.62 0.35 0.00 0.00 65 GO:0072330 生物过程 BP 一元羧酸生物合成工艺
Monocarboxylic acid biosynthetic process1.09 0.75 0.00 0.02 48 GO:0000272 生物过程 BP 多糖分解代谢过程
Polysaccharide catabolic process0.80 0.54 0.00 0.04 54 GO:0030001 生物过程 BP 金属离子输运
Metal ion transport0.91 0.62 0.00 0.04 128 GO:0005576 细胞组分 CC 细胞外区
Extracellular region2.15 1.45 0.00 0.00 73 GO:0005618 细胞组分 CC 细胞壁 Cell wall 1.23 0.82 0.00 0.00 73 GO:0030312 细胞组分 CC 外部封装结构
External encapsulating structure1.23 0.82 0.00 0.00 2136 GO:0031224 细胞组分 CC 膜的固有成分
Intrinsic component of membrane35.88 34.47 0.00 0.15 37 GO:0031226 细胞组分 CC 质膜固有成分
Intrinsic component of plasma membrane0.62 0.43 0.00 0.18 209 GO:0001071 分子功能 MF 核酸结合转录因子活性
Nucleic acid binding transcription factor activity3.51 2.48 0.00 0.00 209 GO:0003700 分子功能 MF 序列特异性DNA结合转录因子活性
Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding3.51 0.48 0.00 0.00 118 GO:0004497 分子功能 MF 单加氧酶活性
Monooxygenase activity1.98 1.27 0.00 0.00 137 GO:0005506 分子功能 MF 铁离子结合
Iron ion binding2.30 1.54 0.00 0.00 147 GO:0020037 分子功能 MF 血红素结合
Heme binding2.47 1.69 0.00 0.00
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表 6 差异表达基因KEGG富集部分分析
Table 6 Partial results of analysis on KEGG enrichment of differentially expressed genes
基因数目
Gene number通路编号
Pathway ID描述
Description该KEGG在目标基因
集中占有的比例
The proportionof KEGG in
target gene concentration/%该KEGG在背景中
占有的比例
The proportion of the
KEGG in the background/%未经校正的P值
P value uncorrected校正后的P值
P value corrected78 map00940 苯丙酸生物合成
Phenylpropanoid biosynthesis2.71 1.36 0.00 0.00 26 map00941 类黄酮生物合成
Flavonoid biosynthesis0.90 0.38 0.00 0.00 17 map00945 二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素的生物合成
Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis0.59 0.26 0.00 0.00 71 map04016 MAPK信号通路-植物
MAPK signaling pathway-plant2.47 1.67 0.00 0.00 63 map00500 淀粉和蔗糖代谢
Starch and sucrose metabolism2.19 1.52 0.00 0.01 26 map00350 酪氨酸代谢
Tyrosine metabolism0.90 0.52 0.00 0.01 92 map04075 植物激素信号转导
Plant hormone signal transduction3.20 2.42 0.00 0.01 26 map00040 戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化
Pentose and glucuronate interconversions0.90 0.53 0.00 0.01 39 map04146 过氧化物酶体
Peroxisome1.36 0.88 0.00 0.01 28 map00592 α-亚麻酸代谢
alpha-Linolenic acid metabolism0.97 0.60 0.00 0.02 20 map00360 苯丙氨酸代谢
Phenylalanine metabolism0.69 0.40 0.00 0.03 24 map00460 氰胺酸代谢
Cyanoamino acid metabolism0.83 0.50 0.00 0.03 16 map00906 类胡萝卜素生物合成
Carotenoid biosynthesis0.56 0.31 0.00 0.05 16 map00950 异喹啉生物碱的生物合成
Isoquinoline alkaloid biosynthesis0.56 0.31 0.00 0.04 23 map00130 泛醌和其他萜类醌的生物合
Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis0.80 0.50 0.00 0.05 32 map00260 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢
Glycine, serine and threonine metabolism1.11 0.78 0.00 0.06 23 map04712 植物昼夜节律
Circadian rhythm-plant0.80 0.52 0.00 0.06 28 map00051 果糖和甘露糖代谢
Fructose and mannose metabolism0.97 0.65 0.00 0.07 22 map00052 半乳糖代谢
Galactose metabolism0.76 0.50 0.01 0.10 50 map00520 氨基糖和核苷酸糖代谢
Amino sugar and nucleotide sugar metabolism1.74 1.34 0.01 0.10
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表 7 20个差异表达基因qRT-PCR的RQ值
Table 7 RQ values of qRT-PCR for 20 differentially expressed genes
基因
Gene正常种
RQ值
RQ value in CK平原种植
退化种 RQ值
RQ value in BZ调节
RegulationRNA-seq调节
Regulation in
RNA-seq抗病反应蛋白 Disease resistance response protein 1.00 b 216.68 a 上调 Up 上调 Up 抗病蛋白 RGA2 Disease resistance protein RGA2 1.00 b 6.29 a 上调 Up 上调 Up 乙烯受体2 Ethylene receptor 2 1.00 a 0.48 b 下调 Down 下调 Down 过氧化氢酶1 Catalase 1 1.00 b 8.23 a 上调 Up 上调 Up 蔗糖合成酶 Sucrose synthase 1.00 b 10.50 a 上调 Up 上调 Up 抗病蛋白 RPS5 Disease resistance protein RPS5 1.00 b 10.02 a 上调 Up 上调 Up 抗病蛋白 Disease resistance protein 1.00 b 10.04 a 上调 Up 上调 Up 类烟草病毒增殖蛋白3 Tobamovirus multiplication protein 3-like 1.00 a 0.78 b 下调 Down 下调 Down 植物抗病反应蛋白 Plant disease resistance response protein 1.00 b 10.01 a 上调 Up 上调 Up F-box家族蛋白 F-box family protein 1.00 b 7.815577 a 上调 Up 上调 Up 超氧化物歧化酶 [Cu-Zn] Superoxide dismutase [Cu-Zn] 1.00 b 9.217215 a 上调 Up 上调 Up 逆转录病毒相关 Pol多聚蛋白系-1 Retrovirus-related Pol polyprotein LINE-1 1.00 a 0.13 b 下调 Down 下调 Down 转座子 RE1的逆转录病毒相关 Pol多蛋白 Retrovirus-related Pol polyprotein from transposon RE1 1.00 a 0.01 b 下调 Down 下调 Down 转座子 TNT逆转录病毒相关 Pol多蛋白 Retrovirus-related Pol polyprotein from transposon TNT 1.00 a 0.06 b 下调 Down 下调 Down BZIP转录因子家族蛋白 BZIP transcription factor family protein 1.00 a 0.46 b 下调 Down 下调 Down 过氧化物酶 Peroxidase 1.00 b 16.00 a 上调 Up 上调 Up 脱落酸受体 PYR1 Abscisic acid receptor PYR1 1.00 a 0.25 b 下调 Down 下调 Down 抗病蛋白 RPS2 Disease resistance protein RPS2 1.00 b 5.40 a 上调 Up 上调 Up 生长素反应因子1 Auxin response factor 1 1.00 a 0.50 b 下调 Down 下调 Down 烟草病毒增殖蛋白1 Tobamovirus multiplication protein 1 1.00 a 0.49 b 下调 Down 下调 Down 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH 1.00 a 1.00 a - - 注：同行数据后不同小写字母表示显著性差异（P<0.05）。
Note: Different lowercase letters in each line indicate significant difference at 0.05 level.
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