Molecular Cloning and Functional Analysis of UDP N-acetylglucosamine Pyrophosphorylases Gene in Frankliniella occidentalis
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摘要:目的 阐明几丁质合成通路中的关键基因UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP N-acetylglucosamine pyrophosphorylases, UAP)对西花蓟马Frankliniella occidentalis生长发育的影响。方法 基于西花蓟马转录组数据，克隆验证了UAP基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)全长序列，命名为FoccUAP。利用RT-qPCR方法分析FoccUAP在各个组织和不同龄期的表达情况。最后通过向西花蓟马蜕皮24 h的2龄若虫显微注射dsUAP，检测沉默效率，观察其对西花蓟马生长发育的影响。结果 FoccUAP基因开放阅读框全长1 545 bp，编码514个氨基酸，预测蛋白分子量为56.738 kDa，具有Glyco - tranf - GTA - type Super family家族的保守结构域，与等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆虫的UAP基因亲缘关系较近。FoccUAP基因在西花蓟马各个组织都有表达，在头部和腹部相对表达量最高，触角、胸部和足相对表达量较低。该基因在虫体生长发育的各个阶段均有表达，其中2龄幼虫、蛹以及羽化后24、48、168、240 h的成虫表达量分别是1龄幼虫的1.30、2.50、1.56、2.0、2.43和2.56倍。RNAi结果表明，注射dsUAP的西花蓟马羽化率（36.3%）和注射后120 h的存活率（5.0%）均显著低于dsGFP对照组，且注射dsUAP的西花蓟马成虫出现翅膀发育不完整、胸腹部皱缩不规则等畸形现象。结论 FoccUAP基因对西花蓟马生长发育具有重要的作用。
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关键词:
- 西花蓟马 /
- UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶 /
- 几丁质合成 /
- RNAi
Abstract:Objective Effects of UDP N-acetylglucosamine pyrophosphorylases (UAP) on the growth and development of Frankliniella occidentalis were studied.Method Based on a transcriptome dataset, an open reading frame (ORF) of UAP gene of F. occidentalis (FoccUAP) was cloned. Expressions of the FoccUAP in different body tissues and growth stages of the insect were detected by RT-qPCR. Effects of UAP gene on the growth and development were examined by microinjecting dsRAN in the 2nd instars (eclosion about 24 h) of F. occidentalis.Result The full-length of FoccUAP ORF was 1 545 bp and encoded 514 amino acids with a predicted molecular mass of 56.738 kDa. FoccUAP contained the conserved domain of glyco-tranf-GTA-type super family, which had a close evolutionary relationship with the orthologues in Isoptera, Blattaria, Orthoptera, and Hemiptera. The RT-qPCR results showed that FoccUAP was highly expressed in the head and abdomen, detected in the antenna, thorax and leg, and found in all developmental stages of the insect. The relative transcript levels of FoccUAP in the 2nd instar, pupa, adult-24 h, adult-48 h, adult-168 h, and adult-240 h were 1.30-, 2.50-, 1.56-, 2.0-, 2.43-, and 2.56-fold, respectively, of those in the 1st instar. Further examination on the RNAi showed that the injection of dsUAP into the 2nd instar F. occidentalis significantly decreased the eclosion rate (36.3%) and the survival rate (5.0% in 120 h after microinjection) as compared to dsGFP controls. Moreover, the dsUAP treatment also induced abnormal phenotypes on wings and abdomen–thorax of the thrips.Conclusion UAP played a significant role in the growth and development of F. occidentalis. -
0. 引言
【研究意义】紫云英（Astragalus sinicus L.）是豆科黄芪属作物，是我国南方稻田主要的冬季绿肥作物[1-4]。紫云英作为绿肥翻压肥田，需要较高的产草量和养分累积量，而播种期、播种量是影响其出苗速度、生长状况、养分、产量和品质等的关键因素[5-7]。因此，适时播种、适宜的生长密度可保证紫云英对光热资源的需求，改善其生长状况从而获得较高的产量和养分累积量，以利于为后作作物提供有机肥源。【前人研究进展】前人研究表明，播期和播种量是影响紫云英群体密度的关键措施，选择合适的播种期和播种量能够改善紫云英的生长性状、产量及其养分累积量[8-10]。其中适宜时期播种可使鲜草产量增加45%～58.1%[11-12]，种子产量增加6.7%～34.9%[13]；养分累积量增加23.5%～25.6%[9]；适宜的播种量可使鲜草产量增加10.4%～30.3%[14]，种子产量增加14.4%～46.9%，养分累积量增加3.8%～75.6%[15]。而播种期的延长有利于农事操作，提高播期弹性，也有利于扩大种植区域范围。【本研究切入点】试验发现播种期延迟，可导致鲜草量下降[9-12]，但能否通过增加播种量来提高产量甚至实现高产尚未知。关于福建稻区紫云英最佳播期与播种量对其产量与养分含量的影响目前尚未见报道。本研究分析这两个因素对紫云英在福建稻区的生长性状、产量以及养分累积量的影响，以筛选出最佳的播期、播种量组合。【拟解决的关键问题】本研究在福建稻区通过设置不同的播期、播种量组合，在田间条件下研究紫云英生长状况、产草量、养分累积量，以期明确紫云英播期与播种量处理，探讨延迟播期下的紫云英产量提升途径，从而为福建稻区紫云英轻简化高效栽培提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验概况
试验设在农业农村部福建耕地保育观测实验站内试验田，位于闽侯县白沙镇溪头村（119°7′E、26°21′N），供试土壤为灰泥土，土壤肥力中等，土壤基础理化性质：pH 5.29，有机质22.0 g·kg−1，碱解氮118.0 mg·kg−1，速效磷14.6 mg·kg−1，速效钾57.9 mg·kg−1。前季作物为水稻。试验紫云英品系为84（8）7-1-1（暂定‘闽紫8号’），84（8）7-1-1表现为早发性好、中熟，植株较高大，茎秆粗壮[16]。种子净度≥97.0%，发芽率≥80%，符合国家标准《绿肥种子》（GB8080-2010）。
1.2 试验设计
试验采用双因素随机区组设计，播期设4个处理，分别为2018年9月30日（A1）、10月25日（A2）、11月20日（A3）、12月15日（A4）；播种量设3个处理，分别为15 .0 kg·hm−2（B1）、22.5 kg·hm−2（B2）、30.0 kg·hm−2（B3），二者组合共12个处理，每个处理3个重复，随机区组排列，每小区面积12 m2（3 m×4 m）。各小区将稻草移出后进行播种，除紫云英播种量、播种期不一致外，土壤含水量等其他农业措施保持一致。施磷肥（P2O5）22.5 kg·hm−2作拌种肥，钾肥（K2O）15 kg·hm−2，在苗期施用。
于盛花期在每个小区随机选取5株调查紫云英株高、分枝数、茎粗。其中株高为从地面量至植株最高叶片尖端；分枝数为一级分枝；茎粗在幼茎最粗处测量。植株鲜草重为地上部鲜草的重量。取盛花期植株地上部的样品烘至恒重，经粉碎后过筛进行氮、磷、钾养分测定。植物全氮测定采用H2SO4-混合加速剂-蒸馏法，植物全磷测定采用钒钼黄比色法，植物全钾测定采用H2SO4-H2O2消煮-火焰光度计法，具体参照鲁如坤[17]的方法。
1.3 数据处理
采用DPS软件双因素随机区组设计和Excel 2007进行数据处理。
2. 结果与分析
2.1 播期与播种量不同组合对紫云英产量及其构成因素的影响
由表1可知，播期与播种量组合对紫云英产量及农艺性状有明显的影响。其中株高最高的为A2B3组合，A3B3组合茎粗最粗，分枝数最多的为A1B2组合，总分枝数A3B2组合最多，均与A4组合差异显著；A4B2组合株数显著高于A1、A2组合（A2B2除外）。A1B2组合干、鲜草产量均为最高，且显著高于其他处理；A1、A2、A3组合干、鲜产量均显著高于A4组合，说明播期推迟不利紫云英生长，不同播期组合中均以B2播种量产量最高。由此可知，9月底至11月下旬播种有利于紫云英获得较高的草产量，均以22.5 kg·hm−2播种量最适宜，播种期9月30日结合播种量22.5 kg·hm−2组合为最优。
表 1 播期与播种量不同组合下紫云英的生长性状Table 1. Growth of Chinese milk vetch under varied sowing treatments处理
Treatment株高
Plant height/
cm茎粗
Stem diameter/
cm分枝数
Branches number/
（个·株−1）总分枝数
Total branches number/
（万枝·hm−2）株数
Strains number/
（万株·hm−2）鲜产
Fresh yield/
（t·hm−2）干产
Dry yield/
（t·hm−2）A1B1 78.24±12.09 a 0.38±0.07 ab 3.20±1.00 ab 616.72±112.73 ab 208.33±87.80 de 44.45±8.05 b 5.34±1.09 b A1B2 84.35±7.82 a 0.38±0.08 ab 3.42±1.91 a 650.00±180.28 a 216.72±87.80 cde 54.69±3.60 a 6.94±0.25 a A1B3 80.19±14.97 a 0.38±0.09 ab 2.11±0.42 abc 574.91±43.19 abc 291.70±94.65 bcde 42.24±2.27 b 4.79±0.59 bc A2B1 70.35±7.67 a 0.36±0.04 abc 3.36±0.58 a 516.73±76.38 abcd 158.39±38.19 e 39.53±4.54 b 4.92±0.77 bc A2B2 68.64±28.50 a 0.34±0.10 bcd 2.25±1.48 abc 583.48±80.27 abc 333.30±142.16 abcd 40.94±8.29 b 5.01±0.34 bc A2B3 92.39±21.28 a 0.41±0.09 ab 1.84±0.26 bc 525.10±109.03 abcd 291.71±14.43 bcde 37.08±4.79 b 4.69±0.60 bc A3B1 74.87±15.94 a 0.39±0.05 ab 1.50±0.67 c 533.33±137.64 abc 366.73±62.92 abc 38.44±1.96 b 4.30±0.23 c A3B2 75.79±15.07 a 0.39±0.02 ab 2.41±1.12 abc 675.07±195.26 a 308.37±80.36 abcde 40.26±8.53 b 4.31±0.46 c A3B3 78.19±9.47 a 0.45±0.05 a 1.52±0.35 c 550.02±139.35 abc 366.70±101.04 abc 36.67±3.87 b 4.26±0.45 c A4B1 30.87±3.20 b 0.27±0.01 cde 1.10±0.23 c 341.70±62.92 d 316.70±104.08 abcd 11.95±3.15 c 1.65±0.40 d A4B2 33.31±3.50 b 0.25±0.01 de 1.02±0.00 c 458.35±62.92 bcd 458.36±62.92 a 14.06±2.71 c 1.78±0.44 d A4B3 34.67±4.46 b 0.23±0.01 e 1.00±0.00 c 408.33±128.29 cd 408.38±128.29 ab 12.14±3.61 c 1.55±0.41 d 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。表2、4、5同。
Note: Data with different lowercase letters mean significant difference (P＜0.05). Same for Tables 2, 4, and 5.2.2 播期与播种量单因素对紫云英产量及其构成因素的影响
对播期与播种量单因素因子分析可知，随着播期的推迟，盛花期紫云英株高、茎粗、分枝数、总分枝数、产量均呈下降趋势（表2），尤其是12月15日播种处理，产量急剧下降，而株数则呈增长的趋势。鲜产量和干产量均为A1处理显著高于其他处理，说明早播种有助于提升产量。对不同播种量而言，随着播种量的增加，产量呈先升高后降低的趋势，但各播种量的产量及构成均无显著性差异。方差分析结果进一步表明了播期对紫云英产量及其构成因素有显著影响，播种量则无显著影响（表3）。综上，9月底至11月下旬结合22.5 kg·hm−2播种量有利于紫云英获得较好的农艺性状；9月30日结合22.5 kg·hm−2播种量可获得最高草产量。从方差分析结果可知，播期对产量影响明显，播期与播种量两因子对干草产量具有明显交互效应。
表 2 播期与播种量单因素下紫云英的生长性状Table 2. Growth of Chinese milkvetch sowed on various dates or using different seeding rates因素
Factor处理
Treatment株高
Plant height/
cm茎粗
Stem diameter/
cm分枝数
Branches number/
（个·株−1）总分枝数
Total branches number/
（×104·hm−2）株数
Strains number/
（×104·hm−2）鲜产
Fresh yield/
（t·hm−2）干产
Dry yield/
（t·hm−2）播期
DateA1 80.93±10.73 a 0.38±0.07 a 2.91±1.27 a 613.87±113.27 a 238.89±87.60 c 47.13±7.33 a 5.69±1.16 a A2 77.13±21.51 a 0.37±0.08 a 2.44±1.06 ab 541.69±83.87 a 261.11±108.33 bc 39.18±5.56 b 4.87±0.54 b A3 76.28±12.04 a 0.41±0.05 a 1.81±0.79 bc 586.12±153.68 a 347.22±77.50 ab 38.45±5.03 b 4.29±0.34 b A4 32.95±3.66 b 0.30±0.08 b 1.04±0.13 c 402.78±93.08 b 394.44±108.90 a 12.72±2.93 c 1.66±0.37 c 播种量
RateB1 63.58±21.98 a 0.36±0.06 a 2.31±1.18 a 502.08±135.86 a 262.50±108.97 a 33.5±13.92 a 4.07±1.60 a B2 65.52±24.77 a 0.35±0.07 a 2.25±1.45 a 591.69±149.74 a 329.17±122.86 a 37.0±17.07 a 4.43±2.06 a B3 71.36±25.78 a 0.38±0.10 a 1.60±0.49 a 514.57±116.05 a 339.58±96.21 a 32.5±11.76 a 3.88±1.36 a 表 3 紫云英产量及其构成因素方差分析（F值）Table 3. Analysis of variance on yield and yield traits of Chinese milk vetch （F value）因素
Factor株高
Plant height茎粗
Stem diameter分枝数
Branches number株数
Strains number总分枝数
Total branches number鲜产
Fresh yield干产
Dry yield播期 Date 23.14** 13.41** 8.04** 6.01** 6.63** 70.30** 90.58** 播种量 Rate 0.98 0.70 2.53 2.63 2.37 2.30 3.09 播期×播种量 Date×Rate 0.63 0.71 1.09 1.23 0.23 1.06 3.25* 注：*和**分别表示显著性和极显著。表6同。
Note: * significant difference; ** extremely significant difference. Same for Table 6.2.3 播期与播种量不同组合对紫云英养分含量及累积量的影响
由表4可知，播期与播种量组合的紫云英地上部氮含量A1B2最低，A3B1最高，不同处理间无显著性差异；氮累积量以A1B2组合最高，显著高于A3和A4组合（A3B1处理除外）。磷含量A4B1组合最低，A3B1组合最高，二者差异显著；磷累积量A1B2组合显著高于其他组合。钾含量A2B1组合最低，A3B1组合最高，二者差异显著；钾累积量同样以A1B2组合最高，且显著高于其他组合。另外，A4组合氮、磷、钾养分累积量均显著低于其他组合。综上，9月底至11月下旬播种有利于获得较高的氮、磷、钾累积量，11月30日播种与15 kg·hm−2播种量组合氮磷钾养分含量最高，9月30日与22.5 kg·hm−2播种量组合养分累积量最高。
表 4 播期与播种量不同组合下紫云英养分含量及累积量Table 4. Nutrients content and accumulation of Chinese milk vetch sowed at different time and seeding rates处理
Treatment养分含量 Nutrient content/（g·kg−1） 养分累积量 Nutrient accumulation/（kg·hm−2） N P K N P K A1B1 24.44±2.12 a 2.22±0.38 ab 18.80±0.38 bcd 131.74±37.58 ab 11.80±2.72 b 99.81±17.02 ab A1B2 20.66±3.77 a 2.08±0.14 ab 16.68±0.14 d 144.01±30.96 a 14.45±0.83 a 116.01±17.56 a A1B3 23.12±3.99 a 2.29±0.49 ab 20.47±0.49 abc 109.48±10.54 ab 10.87±2.09 bc 98.58±20.76 ab A2B1 23.11±3.92 a 2.13±0.23 ab 16.31±0.23 d 116.25±25.88 ab 10.66±1.33 bc 81.88±11.07 b A2B2 22.65±0.89 a 2.05±0.05 b 18.09±0.05 cd 111.82±21.68 ab 10.12±1.80 bc 88.83±12.78 b A2B3 23.00±0.84 a 1.93±0.14 b 17.87±0.14 cd 108.07±16.63 ab 9.02±1.14 c 83.93±13.03 b A3B1 25.46±1.71 a 2.49±0.28 a 23.41±0.28 a 109.23±3.23 ab 10.67±0.58 bc 100.46±5.07 ab A3B2 20.82±10.15 a 2.26±0.29 ab 21.09±0.29 ab 91.77±50.28 b 9.78±1.93 bc 90.84±9.66 b A3B3 23.14±2.09 a 2.07±0.26 ab 19.28±0.26 bcd 97.97±5.73 b 8.76±1.08 c 82.10±9.13 b A4B1 20.86±4.40 a 1.90±0.14 b 18.69±0.14 bcd 35.16±14.53 c 3.14±0.76 d 30.55±5.23 c A4B2 22.06±4.18 a 2.04±0.08 b 22.73±0.08 a 34.59±14.06 c 3.17±0.93 d 34.62±6.71 c A4B3 22.76±4.78 a 1.98±0.22 b 21.45±0.22 ab 40.81±13.44 c 3.47±0.43 d 36.99±3.30 c 2.4 播期与播种量单因素对紫云英养分含量及累积量的影响
由表5可知，紫云英盛花期氮、磷、钾养分含量随着播期的推迟呈先升高后降低趋势，不同处理均以A3处理最高，其中钾含量显著高于A1、A2处理。对养分累积量而言，随着播期的推迟紫云英养分累积量均呈下降趋势，其中以A1处理最高，显著高于其他处理，A2、A3处理也显著高于A4处理。对不同播种量而言，各处理间无显著性差异。方差分析结果进一步表明，播期对紫云英养分累积量有显著影响，播种量则无影响，播期与播种量对养分含量与累积量无明显交互效应（表6）。综上，9月底至11月下旬播种有利于获得较高的养分累积量，以9月30日播种为最高。
表 5 播期与播种量单因素下紫云英养分含量及累积量Table 5. Nutrients content and accumulation of Chinese milk vetch sowed on various dates or using different seeding rates因素
Factor处理
Treatment养分含量 Nutrient content/（g·kg−1） 养分累积量 Nutrient accumulation/（kg·hm−2） N P K N P K 播期 Date A1 22.74±3.37 a 2.20±0.33 ab 18.65±2.33 b 128.41±29.16 a 12.37±2.39 a 104.80±18.11 a A2 22.92±2.07 a 2.04±0.16 ab 17.42±1.15 b 112.05±19.15 ab 9.93±1.45 b 84.88±11.11 b A3 23.14±5.62 a 2.27±0.30 a 21.26±2.08 a 99.66±26.49 b 9.73±1.41 b 91.13±10.67 b A4 21.90±3.95 a 1.98±0.15 b 20.95±3.23 a 36.85±12.50 c 3.26±0.66 c 34.06±5.37 c 播种量 Rate B1 23.47±3.30 a 2.19±0.32 a 19.30±2.91 a 98.10±43.95 a 9.07±3.85 a 78.18±31.14 a B2 21.55±5.04 a 2.11±0.17 a 19.65±2.85 a 95.55±49.85 a 9.38±4.39 a 82.59±32.75 a B3 23.00±2.83 a 2.07±0.30 a 19.77±2.71 a 89.08±31.28 a 8.03±3.09 a 75.40±26.60 a 表 6 紫云英养分含量及其累积量方差分析（F值）Table 6. Analysis of variance on nutrients content and accumulation of Chinese milk vetch （F value）因素
Factor养分含量 Nutrient content 养分累积量 Nutrient accumulation N P K N P K 播期 Date 0.15 2.63 9.80** 24.56** 65.59** 53.55** 播种量 Rate 0.68 0.67 0.22 0.44 2.73 0.98 播期×播种量 Date×Rate 0.34 0.88 4.12** 0.56 1.42 0.93 3. 讨论与结论
前人研究结果表明，播期显著影响紫云英的生长状况和养分含量[18-19]。本研究中，紫云英的株高、茎粗、分枝数、养分积累量均随播期的推迟而下降，播期推迟至12月中旬，即使增加播种量仍然无法提高产量。由此可知，播期推迟导致紫云英生育期延迟，草产量同样也随播期的推迟而显著降低。这与潘福霞[11]、周影[20]等结果相似，即适时早播可改善植株经济性状和获得较高的草产量。这可能是因为早播紫云英出苗快，能够延长营养生长期，积累更多的养分，同时利用冬前的有利积温和光照，进行生长发育。但不同地域间或不同播种方式紫云英最适宜的播期不一致，例如河南最佳的播种期为9月9日[9]，湖北则为9月25日[11]。究其原因，紫云英属于秋播绿肥，适宜温度为15~25℃。进入9月份后，随着太阳直射点的南移，处于高纬度的省份太阳高度较小，地面上单位面积所获得的太阳热量较低纬度省份少，播种期相对较早。另外，一般紫云英前季作物为水稻，采用稻底套播的方式，可为提前播种提供荫蔽、湿润条件，可在9月份进行播种。若将水稻收割后采用直播方式则需在10月份[21]。此外，在本研究中，紫云英草产量与播种量呈抛物线关系，产量随播种量增加先升高后降低，在播种量22.5 kg·hm−2时最大。这与潘福霞[14]、秦自果等[15]结果一致，分析其原因，在低密度播种下由于种群个体少，作物总体产量较低；而在高密度播种下，种群个体间竞争变大，基本苗数增多，幼苗间因遮荫度的增加而死亡率提高，最终因为个体发育不良而造成减产[22-25]。因此适宜的群体构成才能获得较高产量。本研究中增加播种量可提高株茎数，产量随之升高，但进一步增加播种量时，由于密度过大，抑制了紫云英分枝生长，导致产量下降，这可由株数与总分枝数的关系得到佐证（表2）。另外，也有相关试验表明播种量与草产量呈正相关[8, 14, 26]，究其原因，超过适宜的播种量，造成植株间的密度过大，叶片相互遮盖，使叶片不能充分地接受光照，不利于提高光合作用的效率，最终降低了产量。此外，不同地域间紫云英最适宜的播种量也不一致，例如：江苏省最佳播种量为30 kg·hm−2[27]，湖北省最佳播种量为15.0~22.5 kg·hm−2[14]。究其原因，首先，不同区域间土壤理化性质不同，而紫云英是喜磷、喜钾作物，土壤中磷和钾的含量较高时所需播种量较少。其次，不同区域的气候类型不一致，紫云英性喜湿润，不耐干旱，又怕渍水。纬度较低的地区进入秋冬后降水较多，播种后易出现烂种烂芽的现象，故需加大播种量。因此，根据区域光温水与地力条件确定紫云英播期与播量是保证高产的前提。从中也可看出，福建稻区紫云英播期弹性较小，通过提高播种量弥补延期播种不能实现高产。
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图 1 FoccUAP基因的核苷酸及预测的氨基酸序列
注：下划线部分为信号肽氨基酸序列；双下划线为蛋白保守结构域氨基酸序列；*为终止密码子。
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequence of FoccUAP
Note: The signal peptide sequence (MEHQYENLRN) is marked with underline. The conserved amino acid sequences of Glyco-tranf-GTA-type superfamily are marked with double underline. The TAA stop codon is marked with *.
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图 3 FoccUAP基因在西花蓟马不同发育时期（A）和不同组织（B）的mRNA表达分析
注：数据上不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）
Figure 3. Relative expression levels of FoccUAP mRNA in different developmental stages (A) and tissues (B) of F. occidentalis
Note: Different lowercase letters means significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).
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图 4 注射dsUAP对西花蓟马死亡率及生长发育的影响
注：*或者不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）
Figure 4. Effects of dsUAP on growth and mortality rate of F. occidentalis
Note：* or different lowercase letters means significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).
表 1 引物信息
Table 1 Primers used
引物名称
Primer name序列
SequenceFoccUAP-ORF-F ATGGAGCACCAGTACGAAAACCTC FoccUAP-ORF-R TTAGTGAACACCATTTGATATCCCA dsFoccUAP-F TAATACGACTCACTATAGGGTACAAATGCTACCTGCACTGAAAGTAAGCT dsFoccUAP-R TAATACGACTCACTATAGGGTGGCAACATCATCCTGGATTCTCC qFoccUAP-F TCCGTTTACTGATAGTCTTGTTGTCTGGG qFoccUAP-R GCTGTGCGTGGGCAATCCTTTT qβ-actin-F CACCACCGCTGAGCGTGAAATCG qβ-actin-R GTGATGACCTGACCGTCGGGAAGC dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGG 
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