Effects of Nitrogen and Phosphorus Additions on Growth and Chlorophyll Fluorescence Indices of Polygonum multiflorum
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摘要:目的 研究不同氮磷添加处理对何首乌植株生长和叶绿素荧光参数的影响，为促进何首乌生产提供科学施肥的理论指导。方法 以何首乌幼苗为试材，设置4个处理，分别为对照（CK）、施氮（N：株施尿素2.7 g）、施磷（P：株施过磷酸钙14.4 g）、氮磷共施（N+P：株施尿素2.7 g、过磷酸钙14.4 g），测定不同氮磷添加处理对何首乌生长和叶绿素荧光参数的影响。结果 氮磷添加处理可促进何首乌生长，对何首乌叶片数、单叶面积、叶柄长、株高的影响程度为：氮磷共施>施磷>施氮>对照；与对照相比，氮磷添加处理均可显著促进何首乌生物量积累，以氮磷共施处理增幅最大，并可显著提高地上生物量占比；氮磷添加处理促进了何首乌叶绿素含量增加，以及Fv/Fm、qP、ETR值升高，降低qN值，以氮磷共施处理的叶绿素含量增幅最大（较对照增加96.08%），qN值降幅最大（较对照降低29.16%）。结论 相较于对照及单一养分添加，氮磷共施处理能更显著提高何首乌光合效率，促进植株生长。Abstract:Objective Effects of N and P additions on the growth and chlorophyll fluorescence indices of Polygonum multiflorum were studied to provide a guideline for proper fertilization to promote the plant growth.Method N and P addition, i.e., (1) N application using 2.7g urea/plant, (2) P application using 14.4g superphosphate/plant, (3) N+P application using 2.7 g urea and 14.4 g superphosphate on each plant, or (4) control without added N or P, was incorporated in the potting soil to observe the resulting growth and chlorophyll fluorescence indices of the plants.Result The treatments increased the leaf count, single leaf area, petiole length, and height of the plants in the order of N+P application > P application > N application > control. The addition of N+P significantly increased the biomass accumulation, proportion of above-ground biomass, and chlorophyll content as well as the indices of Fv/Fm, qP and ETR, with a decreased qN. Compared to control, N+P treatment affected the most on chlorophyll with a 96.08% increase and on qN with a 29.16% reduction.Conclusion Addition of both N and P in the potting soil significantly promoted the growth and photosynthesis of P. multiflorum.
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0. 引言
【研究意义】植物根际微生物对于植物生长、营养与健康有着深远的影响。植物根际包含有巨大数量微生物与无脊椎动物，被认为是地球上动态性最强、最有活力的一种交界面[1-2]。根际微生物的结构和丰度的改变是植物健康的重要预警器。已有研究表明植物在受到病虫害攻击时，会特异招募有益微生物，形成微生态系统-植物根部的“生物屏障”，达到阻止病原菌入侵的目的[3]。在自然条件下，植物及多种生态因子复杂的多变性，使得不同植物或同一物种不同基因型的根际微生物群落结构不同[4]。因此，研究植物不同基因型根际土壤的微生物结构和多样性对其抗病机制具有重要意义。【前人研究进展】研究表明每克植物的根部约含1011个微生物细胞，可以提供巨大的潜在功能，被称为寄主植株的“额外”基因组[5]。一是土壤微生物在营养元素循环、肥力提高、生态环境改善、植物生长发育、作物病虫害防治等方面具有重要作用[6-7]。二是微生物影响植物生长健康，如根际微生物群落结构与土传病害的发生有一定内在联系，某些微生物代谢产物抑制植物的生长等[8]。根际微生物在特定生态环境和植物类型存在的群落结构差异可促使植物产生特定的根际效应，根际效应直接影响着根际微生物的营养选择和富集[9]。Kwak等研究结果表明抗青枯病番茄Hawaii 7996可以富集更多的黄杆菌基因组，抑制青枯菌的生长[5]。此外，小麦、水稻、西瓜、黄瓜等作物根际微生物与土传病害发生关系的研究也说明作物抗感品种间根际微生物群落结构存在差异[10-11]。因此，在农业生产中客观分析根际土壤微生物多样性以及微生物群落结构特征对研究和控制土传病害有很好的帮助。【本研究切入点】由青枯菌5号小种引起的桑树青枯病是最主要的桑树细菌性病害之一，已成为制约我国蚕桑产业发展的重要因素[12]。由于桑树青枯病很难防治，一旦爆发会造成严重的损失，当前疫区主要利用抗性品种进行防控[13]。海南目前主要栽培叶桑树品种有抗青283×抗青10、抗青10、桂桑优62及其他嫁接苗等[14]。前期调查发现，抗青10、抗青283×抗青10对青枯病抗性强，较少有发病，桂桑优62对青枯病抗性弱，在琼中地区多发病。这种差异与根际土壤微生物结构及多样性之间有何关系目前尚不清楚。【拟解决的关键问题】基于此，本研究对抗青枯病桑树种质抗青283×抗青10和敏感种质桂桑优62，采用16S rRNA高通量测序技术研究其根际细菌群落结构与多样性，拟找出抗、感桑树根际细菌群落的差异，为进一步研究桑树根际微生态特征、根际功能菌株的筛选和应用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
抗青283×抗青10杂交组合是湛江市蓖麻蚕科学研究所黄富等采用有性杂交、病地添菌、人工诱变等方法，于1994年3月17日通过广东省农作物品种审定委员会桑桑专业组的审定，对青枯病达到中抗水平[15]。桂桑优62是广西壮族自治区蚕业技术推广总站1995年选育出的优良组合，于2000年通过广西农作物品种审定委员会审定，耐高温，适于珠江流域等热带、亚热带种植[16]。桑树均为2016年种植，树龄为3年。
1.2 根际土壤样品的采集
样地位于海南省琼中县营根镇加钗农场品种示范基地（N19.02′29″，E109.47′22″；H: 306 m），样地的土壤pH为6.25，有机质39.63 g·kg−1，铵态氮54.60 g·kg−1，电导率605.00 us·cm−1，盐分330.00 mg·L−1，总溶解固体物300.00 mg·L−1，全钾为24.77 g·kg−1，全磷为1.37 g·kg−1。2019年7月采集根际土壤样品，在抗青283×抗青10和桂桑优62种植行中随机选取4行，每行选取5株植株混合为一个样品，去除地表土壤后，取根际土壤样品，抗青283×抗青10植株根际土壤样本编号为QZ2K1、QZ2K2、QZ2K3、QZ2K4，桂桑优62植株根际土壤样本编号为QZ2G1、QZ2G2、QZ2G3、QZ2G4。所有样品置入冰盒，–80 ℃冰箱保存、备用。
1.3 土壤微生物DNA提取
取充分混匀的土壤样品0.50 g，采用DNeasy Power Soil Kit（100）试剂盒提取根际土壤DNA。抽提DNA浓度和纯度利用Nano Drop 2000检测，要求A 260 /A 280值在1.8～2.0。
1.4 基因扩增与测序
Takara公司的Takara Ex Taq高保真酶进行PCR，利用16S V3-V4区域引物343F 5′- TACGGRAGGCAGCAG -3′和798R5′- AGGGTATCTAATCCT-3′扩增[17]。PCR扩增体系：25 μL 2x Premix Taq（Takara Biotechnology），引物各1 μL（10 mmol·L−1），DNA模板3 μL（20 ng·μL−1），加dd水溶解定容至50 μL。PCR反应程序：预变性：94℃ 5 min；变性：94℃ 30 s，退火：52℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，30个循环；延伸：72℃ 10 min。采样琼脂糖电泳检测，利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒精确定量回收产物并进行测序。
1.5 数据分析
使用Trimmomatic（Version 0.35）软件对原始数据（raw data）质量部分剪切，拼接得到完整双端序列（paired end tags）。使用QIIME中的Split Libraries（Version 1.8.0）软件得到高质量序列（clean tags）。去除高质量序列中的嵌合体，得到优质序列（valid tags）。对质控得到的优质序列使用Vsearch（Version 2.4.2）软件按照97%的相似度进行OTU分类，以每个OTU中丰度最大序列为该OTU的代表序列，采用RDP Naive Bayesian Classifier 分类算法进行注释。使用BioVenn在线软件进行Venn图绘制；使用Excel 2013和SPSS 19.0软件对相对丰度数据进行统计分析，绘制相对丰度柱状图；使用Qiime软件计算观测物种数、Chao1指数（Chao1）、香农、辛普森、谱系多样性指数（PD whole tree）和文库覆盖率（Goods-coverage）等多样性指数，稀释曲线和NMDS图用R软件绘制。通过LDA对根际细菌群落进行LEFSE分析（LDA Score 2.5）寻找抗、感青枯病桑树根际土壤细菌群落差异类群；使用PICRUSt软件，预测已知微生物基因功能的构成。
2. 结果与分析
2.1 根际细菌群落测序结果分析
细菌16S rRNA高通量测序共获得优化序列304 272条，平均长度431.48 bp（表1）。8个样本序列均超过32 000条reads，样品测序深度都超过94%，测序效果理想。
表 1 高通量测序数据概况Table 1. Overview of high-throughput sequencing data样品
Sample高质量序列
Clean tags优质序列
Valid tags平均长度 /bp
Valid mean length测序深度指数/%
Goods coverageQZ2K.1 33 883 28 948 429 94.81 QZ2K.2 38 786 32 371 430 94.69 QZ2K.3 32 328 26 941 432 94.57 QZ2K.4 41 499 34 267 432 94.56 平均值 average 36 624.0 30 631.8 430.8 94.658 QZ2G.1 38 747 32 496 432 94.53 QZ2G.2 37 626 31 688 432 94.43 QZ2G.3 40 749 34 814 432 94.78 QZ2G.4 40 656 34 090 432 95.22 平均值 average 3 944.5 33 272.0 432.0 94.740 2.2 细菌群落组成比较
抗青枯病桑树样品共鉴定出细菌28个门、76个纲、151个目、230个科、388个属；易感青枯病桑树样品共鉴定出细菌27个门、73个纲、147个目、225个科、363个属。根据Venn图可知，共有OTUs数为2089个，其中QZ2K特有的OTUs为1113个，QZ2G为898个（图1）。
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图 1 抗感青枯病桑树根际土壤细菌OTUs韦恩图Figure 1. Venn diagram of bacteria OTUs in rhizosphere soils at QZ2K and QZ2G桑树根际土壤样品中细菌群落门水平上组成结构和丰度结果如图2-A根际土壤细菌主要分布在以下15个门：变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、匿杆菌门（Latescibacteria）、Entotheonellaeota、Patescibacteria、河床菌门（Zixibacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、迷踪菌门（Elusimicrobia）、绿弯菌门（Chloroflexi）、罗克菌门（Rokubacteria），其中变形菌门最为丰富，QZ2K和QZ2G土样中相对丰度分别为44.54%，46.23%，其次为放线菌门，QZ2K和QZ2G土样中相对丰度分别为23.01%，28.86%。其中QZ2K根际土样中酸杆门、芽单胞菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门、Patescibacteria、河床菌门、蓝细菌门、罗克菌门的含量高于QZ2G根际土样的含量。
在属水平上如图2-B所示，前十五的属分别为MND1、Gaiella、硝化螺菌属（Nitrospira）、Haliangium、链霉菌属（Streptomyces）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）、芽胞杆菌属（Bacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、Subgroup 10、Acidibacter、分支杆菌属（Mycobacterium）、土微菌属（Pedomicrobium）、Ellin6067、mle1-7、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）。芽胞杆菌属在QZ2K土样中占1.76%，而在QZ2G土样中仅为0.41%。另外，土微菌属、拟杆菌属、mle1-7、鞘氨醇单胞菌属、类诺卡氏菌属、硝化螺菌属在QZ2K土样中的含量也高于其在QZ2G土样中的含量。
2.3 群落多样性分析
2.3.1 Alpha多样性
对抗、感桑树根际土壤细菌群落进行6种α 多样性指数计算（表2）。统计结果表明，抗感桑树根际细菌群落的各个多样性指数均无显著性差异。谱系多样性指数、Chao1指数和观测物种数在抗青枯病桑树QZ2K土样中高于感青枯病桑树QZ2G土样。
表 2 抗感青枯病桑树根际土壤细菌α多样性指数（平均值±标准误，n=4）Table 2. Alpha diversity indices of bacteria in rhizosphere soils at QZ2K and QZ2G（Mean±SE，n=4）样品
Samples谱系多样性指数
PD whole TreeChao1 文库覆盖率（%）
Goods coverage观测物种数
Observed Species香浓-威纳指数
Shannon-Wiener辛普森指数
SimpsonQZ2K 84.97±0.77 3 190.57±22.48 0.95±0.00 2 333.88±40.49 9.51±0.09 0.995±0.001 QZ2G 82.86±1.44 3 178.61±87.45 0.95±0.00 2 304.30±49.58 9.65±0.03 0.997±0.001 2.3.2 Beta多样性
Beta多样性利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离，反映样本（组）间是否具有显著的微生物群落差异。基于加权UniFrac距离的非度量多维标定法（Non - Metric Multi - Dimensional Scaling，NMDS）来研究不同基因型根际细菌群落之间的分离模式考虑了分类群丰度，对稀有的分类群更敏感。如图3所示，在UniFrac NMDS中，stress=0.005＜0.05，说明很好地将抗青枯病桑树根际土壤QZ2K与感青枯病桑树根际土壤QZ2G样本区分开来，表明桑树不同基因型根际细菌群落之间存在显著的差异。
2.4 抗感青枯病桑树根际优势细菌差异分析
使用LEfSe分析抗青283×抗青10与桂桑优62根际土壤细菌群落中主要差异物种（LDA Score预设值为2.5，小于2.5视为没有显著差异）（图4-A）。结果表明，酸杆菌纲（Acidobacteriia）、硝化螺旋菌门、硝化螺旋菌纲（Nitrospira）、硝化螺旋菌目（Nitrospirales）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、硝化螺旋菌科（Nitrospiraceae）、索利氏菌目、索利氏菌科（Subgroup 3）、酸杆菌目（Acidobacteriales）、Subgroup 2未培养科未培养属、酸杆菌目未培养科、Candidatus Solibacter、Subgroup 2未培养科这几类菌群在抗青283×抗青10根际的相对丰度均显著高于桂桑优62根际，抗青283×抗青10根际酸杆菌纲LDA值最大，桂桑优62根际MND1 LDA值最大，说明这两个类菌群的差异最大。从图4-B中可以看出抗青283×抗青10根际重要作用的细菌类群包括：硝化螺旋菌纲、酸杆菌纲、硝化螺旋菌目、索利氏菌目、酸杆菌目、硝化螺旋菌科、酸杆菌目未培养科、索利氏菌科（Subgroup 3）和Subgroup 2未培养科；而桂桑优62根际重要作用的细菌类群Ilumatobacteraceae和TRA3 20 Other两个科。
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图 4 抗感青枯病桑树根际土壤细菌LEfSe分析Figure 4. LEfSe analysis on bacteria in rhizosphere soils at QZ2K and QZ2G2.5 抗感青枯病桑树根际细菌群功能分析
基于16S rDNA序列的PICRUSt功能预测（图5），抗青283×抗青10和桑优62的根际细菌群落对应的COG类目排名前10的相同，分别为氨基酸运输与代谢（E）、转录（K）、信号转导机制（T）、能量产生与转化（C）、细胞壁/膜/包膜生物发生（M）、碳水化合物运输与代谢（G）、复制，重组和修复（Lr）、翻译，核糖体结构和生物源（J）、无机分子运输与代谢（P）、辅酶运输与代谢（H）（不包括未知功能和通用功能）；两组根据Wilcoxon算法差异COG类目为763，仅占所有COG类目的17.25%。
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图 5 抗感青枯病桑树根际细菌预测得到的COG相对丰度注：A: RNA加工与修饰; B: 染色体结构与动态；C: 能量产生与转化; D: 细胞周期控制，细胞分裂，染色体分裂; E: 氨基酸转运与代谢; F: 核酸转运与代谢;G:碳水化合物的运输与代谢; H: 酶运输与代谢; I: 脂质运输与代谢; J:翻译，核糖体结构和生物发生; K: 转录; L: 复制，重组和修复; M: 细胞壁/膜/包膜生物发生; N: 细胞运动; O: 翻译后修饰，蛋白质更新，伴侣; P: 无机离子的运输与代谢; Q:次生代谢产物的生物合成，转运和分解代谢; R:仅通用功能预测; S:未知功能; T:信号转导机制; U:细胞内运输，分泌和囊泡运输; V: 防御机制; W: 细胞外结构; Z: 细胞骨架。Figure 5. Relative abundance of COG at QZ2K and QZ2GNote: A: RNA processing and modification; B: Chromatin structure and dynamics; C: Energy production and conversion; D: Cell cycle control, cell division, and chromosome partitioning; E: Amino acid transport and metabolism; F: Nucleotide transport and metabolism; G: Carbohydrate transport and metabolism; H: Coenzyme transport and metabolism; I: Lipid transport and metabolism; J: Translation, ribosomal structure and biogenesis; K: Transcription; L: Replication, recombination, and repair; M: Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N: Cell motility; O: Posttranslational modification, protein turnover, and chaperones; P: Inorganic ion transport and metabolism; Q: Secondary metabolites biosynthesis, transport, and catabolism; R: General function prediction only; S: Function unknown; T: Signal transduction mechanisms; U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V: Defense mechanisms; W: Extracellular structures; Z: Cytoskeleton.3. 讨论与结论
植物对青枯病的抗性是由数量性状基因介导的，但植物对其表型是可变的，并受环境因素影响，其中植物根际微生物在抗青枯病上具有重要作用[5，7]。本研究发现抗青283×抗青10根际细菌在门、纲、目、科、属和OTU分类水平均略高于桂桑优62根际细菌群落，但对根际细菌物种多样性分析结果表明两种桑树根际细菌群落多样性差异不显著。这可能是因为两种基因型桑树种植在同一样地，管理方式一致，土壤在根系细菌组装过程中占主导地位。在门水平，变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等为根际土壤的优势菌门，分别占抗青283×抗青10和桂桑优62根际细菌总体的92.15%、94.27%。结果与邱洁等研究3个品种桑树（粤椹大10、嘉陵30号和红果1号）根际细菌结构基本一致[18]。在属水平，主要分布在MND1、Gaiella、硝化螺菌属、Haliangium等15个属，但抗、感桑树根际各属含量有差异，抗青283×抗青10根际细菌在放线菌的类诺卡氏菌属和芽胞杆菌属均高于桂桑优62根际细菌。邱洁等对3种桑树根际细菌研究也发现，随着分类的细化，不同的桑树品种对细菌群落组成和分布的影响越大，在科属水平上差异更明显[18]。
进一步基于加权UniFrac距离的非度量多维标定法Beta多样性分析，抗青283×抗青10和桂桑优62的根际细菌群落可以显著区分开来。说明抗感桑树根际分别富集了不同的优势细菌菌群，可能是基因型通过植物差异生长性能、凋落物和根系分泌物等影响植物根际微生物群组装。通过LDA Score进行LEfSe分析，发现抗、感青枯病桑树根际重要作用的微生物类群存在差异。类诺卡氏菌属、芽胞杆菌属、鞘氨醇单胞菌属在抗性品种根际丰度也更高。研究表明类诺卡氏菌属和芽胞杆菌属分别属于放线菌和芽胞杆菌，是生防菌，通常代表土壤的健康状况对植物病害具有防病作用[19-20]。研究表明鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）在具有抑病性的烟草根际土壤中具有普遍存在的特征[18, 21]，鞘脂单胞菌科的某些菌株也被报道与根部固氮作用密切相关[22]，因此，鞘氨醇单胞菌属也可能与植物对病原体攻击的抵抗力有关。抗青枯病桑树根际土壤富集了更多的类诺卡氏菌属、芽胞杆菌属、鞘氨醇单胞菌属，可能对其抵抗青桔病有关，这有待于研究证实。
本研究利用Illumina高通量测序技术对抗感青枯病桑树的根际土壤样品进行了测序分析，同一地点抗、感青枯病桑树根际细菌群落多样性差异不显著，但其重要的细菌类群存在差异，抗青枯病桑树根际土壤富集了更多的类诺卡氏菌属、芽胞杆菌属、鞘氨醇单胞菌属等生防菌，这为进一步研究桑树青枯病的防治奠定了基础。有研究发现品种抗性差异可能通过根系分泌物对病原菌的化感作用差异来体现[23]，根系分泌物通过刺激特定微生物的生长，富集特定微生物，在植物-微生物和微生物-微生物相互作用中发挥重要作用[24-26]。因此，为阐明抗感病桑树根际微生物差异的机制及原因，尚需进一步对抗、感青枯病桑树种质根系分泌物组分、含量差异及其对土壤微生物的影响作进一步测定分析。
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图 1 不同氮磷添加处理的何首乌叶绿素含量
注:柱形图间无相同大、小写字母者分别表示在0.01水平上和0.05水平上具有显著性差异，图 2同。
Figure 1. Chlorophyll content of P. multiflorum seedlings under N and P applications
Note:Different uppercase letters between columns indicate extremely significant differences at 0.01 level. Different lowercase letters between columns indicate significant differences at 0.05 level.The same as fig. 2.
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图 2 不同氮磷添加处理的何首乌叶绿素荧光参数
Figure 2. Chlorophyll fluorescence indices of P. multiflorum seedlings under N and P applications
表 1 不同氮磷添加处理何首乌幼苗的生长指标
Table 1 Growth indices of P. multiflorum seedlings under N and P applications (mean±standard error)
处理
Nutrient treatment叶片数Number of leaves 叶面积
Single leaf area/cm2叶柄长
Petiole length/cm根长
Root length/cm分枝数
Number of branches株高
Plant height/cmCK 36.67±4.98cB 9.16±0.58cB 2.1±0.13bA 18.10±1.47aA 7.0±1.53aA 77.7±5.37cC N 63.33±6.17bAB 13.76±0.47bB 2.5±0.25abA 20.77±3.75aA 6.0±1.0aA 106.3±16.95bcBC P 72.00±6.43bB 16.11±0.24bAB 3.1±0.27aA 17.10±1.15aA 6.7±0.67aA 141.7±7.26bB N+P 133.33±21.37aA 34.57±7.85aA 3.3±0.20aA 18.53±0.67aA 6.7±1.76aA 312.8±13.42aA 注:表中同列数据后无相同大、小写字母者分别表示在0.01水平上和0.05水平上具有显著性差异。表 2同。
Note:Different uppercase and lowercase letters on a same column indicate significant differences at 0.05 level and extremely significant differences at 0.01 level. The same as table 2.
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表 2 不同氮磷添加处理何首乌幼苗生物量积累及其分配
Table 2 Biomass accumulation and allocation on P. multiflorum seedlings under N and P applications (mean±standard error)
处理
Nutrient treatment叶生物量
Leaf biomass/g块根生物量
Root biomass/g须根生物量
Fine root biomass/g茎生物量
Stem biomass/g总生物量
Total biomass/g叶生物量占比
Leaf biomass ratio茎生物量占比
Stem biomass ratio根生物量占比
Root biomass ratioCK 1.2±0.19cB 1.1±0.09bB 0.12±0.02aA 0.9±0.14bB 2.9±0.57cC 0.2±0.1bA 0.3±0.02aA 0.4±0.05aA N 2.3±0.03bcB 2.1±0.25aA 0.38±0.03bB 1.1±0.42bB 5.8±0.68bBC 0.4±0.05abA 0.2±0.06bB 0.4±0.01aAB P 3.4±0.03bB 2.0±0.11aA 0.29±0.10bB 2.1±0.27bB 7.9±0.49bB 0.4±0.2abA 0.3±0.02abAB 0.3±0.0aAB N+P 7.4±1.11aA 2.0±0.09aA 0.47±0.23bB 5.4±0.48aA 15.3±1.23aA 0.5±0.05aA 0.4±0.04aA 0.2±0.01bA
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