Rapid Propagation of Double Delight Chinese Rose Using Tissue Culture
-
摘要:目的 筛选出红双喜月季各阶段最佳培养条件，并建立组培快繁技术体系，为工厂化生产提供科学依据及技术指导。方法 以红双喜月季茎段为试验材料，采用正交设计和随机区组设计等试验方法，开展红双喜月季初代培养、继代增殖、生根培养以及炼苗移栽的研究。结果 茎段最佳灭菌处理为75% C2H5OH 30 s+0.1% HgCl2 6 min；最适初代诱导培养基为MS+3.00 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA，诱导率高达95.56%；最适增殖培养基为MS+1.00 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 IBA，增殖系数高达6.61；最适生根培养基为1/4MS+0.05 mg·L-1IBA+2.50 g/L活性炭，生根率高达95.56%；最适移栽基质为V细沙:V蛭石:V珍珠岩:V椰糠=1:2:3:1，移栽成活率高达98.33%。结论 通过茎段直接诱导丛生芽，可以建立红双喜月季高效快繁技术体系。Abstract:Objective To optimize the tissue culture conditions for an efficient, rapid propagation of Double Delight Chinese roses for large scale operations.Method Stems cut from the rose plants were used for the tissue culture optimization with an orthogonal experiment and completely randomized block design method. The initial generation culture, subsequent generations enrichment, rooting enhancement, and transplant augmentation for the plant propagation were evaluated.Result The optimal method to disinfect the stems for propagation was to dip them in 75% C2H5OH for 30 s followed by soaking in a 0.1% HgCl2 solution for 6 min. The most efficient 1st generation culture was obtained in a medium containing MS+3.00 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA with an induction rate of up to 95.56%. The selected enrichment medium was MS+1.00 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 IBA to yield a multiplication factor of 6.61. For efficient rooting, the best medium was MS+0.05 mg·L-1 IBA+2.50 mg·L-1 activated carbon to result in a 95.56% rate. The mixing ratio of the substrates for seedling transplanting was optimized to be fine sand:vermiculite:perlite:coconut bran=1:2:3:1 that provided a seedling survival rate as high as 98.33%.Conclusion A highly efficient, rapid propagation method using cut stems from Double Delight Chinese rose plants was established for scale-up productions.
-
0. 引言
【研究意义】红双喜(Double Delight)月季，为蔷薇科蔷薇属木本花卉，月季经典品种, 芳香型月季之首，适应性强，耐寒耐旱。其常以盆栽或鲜切花出售，亦可提取精油，在医药等方面也有重要的作用，且在园林绿化、园林造景等方面的应用极为广泛，具有很高的经济价值和观赏价值，深受人们喜爱，市场需求量大。因此，开展红双喜月季组织培养快繁技术的研究有利于种质资源保存、加快繁殖速度，以达到工厂化生产，满足市场需求的同时，亦可为精油的提取及其他方面研究提供原材料。【前人研究进展】近年来，关于月季组织培养已有不少报道[1-5]，有关红双喜月季组织培养报道多集中于继代增殖培养，如李启任[6]、高彩云[7]等均对红双喜月季增殖培养进行了研究。【本研究切入点】目前关于红双喜月季组织培养完整体系报道较少，未对各培养阶段进行系统的研究，尤其鲜见对移栽基质研究的报道。另外，本课题组的前期研究发现，取材、生长环境不同导致红双喜月季组织培养条件存在差异。为此，对红双喜月季初代培养、继代增殖、生根培养、炼苗移栽阶段关键影响因素进行相关研究。【拟解决的关键问题】本研究通过茎段直接诱导丛生芽途径，研究各培养阶段最佳培养条件，建立红双喜月季组培快繁技术，为大规模生产提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以2017年5月取自白山基地月季品种红双喜为试验材料，选取当年生未木质化茎段中部为外植体进行组织培养。试验前阶段在吉林农业大学园艺学院园林生物技术实验室进行，移栽阶段在吉林农业大学设施基地园林实践基地温室内进行。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体预处理及灭菌时间筛选
用剪刀剪去外植体叶片和皮刺，将茎段用稀释过的洗洁精浸泡5 min，期间不断震荡，再放到流水下冲洗45 min后装入烧杯备用。在超净工作台上，用75%的酒精对外植体灭菌15、30、45 s，无菌水冲洗4~5遍，用0.1%的升汞灭菌4、5、6、7 min，再用无菌水冲洗5~6遍。将处理好的外植体接种到MS培养基上，每个处理接种30个外植体，3次重复，30 d后统计、计算污染率及死亡率。
1.2.2 初代诱导培养基筛选
按L9(34)正交表设计3因素3水平正交试验[8](基本培养基：MS、B5、WPM；6-BA：1.00、2.00、3.00 mg·L-1；NAA：0.10、0.20、0.30 mg·L-1)。将消毒后的外植体，接种到1~9号的培养基中(附加30 g·L-1蔗糖，pH值调至5.8~6.0，下同)，每个处理接种30个外植体，3次重复。放至培养室培养[光照强度2 000 lx，光照时间14 h·d-1，温度(25±2)℃]30 d后统计、计算诱导率。
1.2.3 腋芽增殖培养
采用随机区组设计[8]进行2因素4水平试验，将初代培养得到的无菌苗接种到MS培养基上，附加不同浓度6-BA(0.50、1.00、1.50、2.00 mg·L-1)与IBA(0.10、0.20、0.30、0.40 mg·L-1)，每个处理接种30个无菌苗，3次重复，30 d后统计、计算增殖系数。
1.2.4 生根培养
将生长健壮的组培苗分别接种在MS、1/2MS、1/4MS、1/6MS培养基(附有0.10 mg·L-1 IBA)上，进行生根培养，以选出最适基本培养基。在此基础上分别添加不同浓度NAA(0.05、0.10、0.15 mg·L-1)、IBA(0.05、0.10、0.15 mg·L-1)进行培养。在上述最佳生根培养基上，添加不同浓度活性炭(0、1.50、2.00、2.50、3.00 g·L-1)进行生根培养，每个处理接种30个无菌苗，3次重复，30 d后统一计算生根率、平均根数、平均根长。
1.2.5 炼苗移栽
按L9(34)正交表设计4因素3水平正交试验[8](V细沙：0、1、2；V蛭石：1、2、3；V珍珠岩：1、2、3；V椰糠：0、1、2)，选择组培苗高于3.00 cm，根系未老化的植株在温室中炼苗5 d后移栽于不同基质中，每个处理20棵组培苗，浇透水覆盖上塑料进行保湿，给予一定的光照条件，每天中午通风，在温室中培养30 d后观察植株的生长情况，统计成活率。
1.3 数据处理
采用SPSS20.0进行方差分析和多重比较，各指标计算公式如下：
污染率%=污染的外植体数/接种的外植体总数×100%；死亡率%=死亡的未污染的外植体数/接种的外植体总数×100%；诱导率%=诱导出芽外植体总数/接种外植体总数×100%；增殖系数=切出有效芽总数/接种芽数；成活率%=成活苗数/移栽苗数× 100%；平均根长=总根长/总根数；平均根数=生根苗总根数/生根苗数；生根率%=生根苗数/接种苗数× 100%。
2. 结果与分析
2.1 灭菌时间对外植体接种的影响
分析表 1中数据可知，随着酒精、升汞消毒时间的增加，茎段污染率有所下降，但与此同时其死亡率也随之升高。虽处理A11、A12的茎段污染率为0，但其死亡率相对较高，所以综合死亡率和污染率考虑，从表中可以看出最佳灭菌时间为处理A7，即30s 75%酒精与6 min 0.1%升汞配合使用，污染率为2.22%，死亡率为0%。
表 1 灭菌时间对外植体接种的影响Table 1. Effect of disinfection time on explant inoculation处理
Treatment灭菌时间Disinfection time/min 污染率
Contamination rate/%死亡率
Mortality rate/%75%酒精
75% alcohol0.1%升汞
0.1% mercuric chlorideA1 0.25 4 65.56±0.96a 0 A2 0.25 5 58.89±0.91b 0 A3 0.25 6 34.44±0.76e 0 A4 0.25 7 18.89±0.94g 4.44±0.56c A5 0.50 4 57.78±0.84b 0 A6 0.50 5 45.56±0.96c 0 A7 0.50 6 2.22±1.92h 0 A8 0.50 7 0 17.78±0.94b A9 0.75 4 41.11±2.26d 2.22±1.92d A10 0.75 5 24.44±0.50f 3.33±0.38d A11 0.75 6 0 18.89±0.13b A12 0.75 7 0 26.67±1.53a 注：同列数据后不同字母者表示差异达显著水平(P＜0.05)。表 2~8同。
Note:The difference between different letters after the same column data reached a significant level(P＜0.05).The same as table 2-8.2.2 不同培养基对红双喜月季初代培养的影响
将灭菌后外植体接种到1~9号培养基中，在接进去第8 d发现，以MS为基本培养基上的外植体开始萌动，腋芽明显膨大，而以B5、WPM为基本培养基上的外植体并无反应，在接种16 d时以MS为基本培养基上的外植体多数诱导出腋芽且叶片大，而以B5、WPM为基本培养基上外植体诱导出腋芽整体小且弱。30 d后统计、计算诱导率(表 2)。由表 2可知，基本培养基、6-BA、NAA的极值分别为60.37、15.56、11.48，进而可知影响诱导率高低的主因子效应大小依次为基本培养基＞6-BA＞NAA。从各因素水平诱导率均值可以看出，A因素中MS效果好于另两种且差异显著，B因素中随6-BA浓度的增加，诱导率呈先降低后升高的趋势，以3.00 mg·L-1 6-BA诱导率均值最高，C因素中随NAA浓度的增加诱导率呈先降低后增加的趋势，以0.30 mg·L-1 NAA诱导率均值高于另两个水平。从而可得正交试验最优组合为A1B3C3，即MS+3.00 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA，诱导率为95.56%(处理3)。由于B3与B1、C3与C1之间差异不显著，另一个较优的组合为A1B1C1，诱导率为83.33(处理1)，处理1与处理3间差异显著，处理3诱导率最高为95.56%，所以最适诱导培养基为MS+3.00 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA，基本培养基为MS。
表 2 诱导率正交试验极差分析及多重比较Table 2. Extreme difference analysis and multiple comparison on induction rates obtained from orthogonal test处理
Treatment因素Factor 诱导率
Inductivity/%A：基本培养基
Minimal mediumB：6-BA 6-Benzylaminopurine
/(mg·L-1)C：NAA 1-naphthlcetic acid
/(mg·L-1)1 1(MS) 1(1.00) 1(0.10) 83.33±3.34b 2 1 2(2.00) 2(0.20) 47.78±5.09c 3 1 3(3.00) 3(0.30) 95.56±1.93a 4 2(B5) 1 2 20.00±3.33de 5 2 2 3 11.11±3.85f 6 2 3 1 14.44±1.93ef 7 3(WPM) 1 3 16.67±3.34ef 8 3 2 1 23.33±3.34d 9 3 3 2 18.89±3.85de X1 75.56 a 40.00 a 40.37 a X2 15.18 b 27.41 b 28.89 b X3 19.63 b 42.96 a 41.11 a R 60.37 15.56 11.48 最优组合 A1 B3 C3 注：Xv1、X2、X3分别为各列各水平诱导率均值；R为极值。
Note:X1, X2, X3 are the mean values of induction rate at each level in each column, R is the extreme value.2.3 不同质量浓度6-BA与IBA配比对增殖的影响
从表 3可以看出，6-BA、IBA的各水平增殖系数均值之间差异极显著，随着6-BA浓度的增加，增殖系数呈先升高后下降的趋势，以1.00 mg·L-16-BA增殖效果最好；随着IBA浓度的增加增殖系数逐渐降低，以0.10 mg·L-1 IBA增殖效果最好，二者最优组合为1.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1 IBA。就16个处理(表 4)而言，结合增殖系数和植株生长状态来看，同样以1.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1 IBA配合使用增殖效果佳(图 1-A)，增殖系数达到6.61。
表 3 6-BA、IBA水平间增殖系数的多重比较Table 3. Multiple comparison on proliferation coefficients between 6-BA and IBA levels6-BA
6-Benzylaminopurine/
(mg·L-1)均值
Mean valueIBA
Indole-3-Butytric acid(mg·L-1)均值
Mean value0.50 4.40b 0.10 5.20a 1.00 5.12a 0.20 4.65b 1.50 3.78c 0.30 3.40c 2.00 2.34d 0.40 2.39d 表 4 不同质量浓度6-BA与IBA配比对增殖的影响Table 4. Effects of 6-BA and IBA concentrations on seedling proliferation处理
Treatment6-BA 6-Benzylaminopurine
/(mg·L-1)IBA Indole-3-Butytric acid/(mg·L-1) 增殖系数
Propagation coefficient生长状态
Growing statusB1 0.50 0.10 6.07±0.20b 叶片绿色，株高4 cm左右 B2 0.50 0.20 5.19±0.23c 叶片翠绿色，株高4.5 cm左右 B3 0.50 0.30 4.15±0.15e 部分叶片黄色，株高4.8 cm左右 B4 0.50 0.40 2.20±0.10i 叶片绿色，株高3 cm左右 B5 1.00 0.10 6.61±0.11a 叶片翠绿，较多腋芽，株高6 cm左右 B6 1.00 0.20 5.99±0.19b 腋芽叶片黄绿色，株高7 cm左右 B7 1.00 0.30 4.01±0.15ef 叶绿色个别脱落，株高5.5 cm左右 B8 1.00 0.40 3.85±0.29f 叶片黄绿色，株高4 cm左右 B9 1.50 0.10 4.73±0.06d 叶小绿色，株高3.5 cm左右 B10 1.50 0.20 4.55±0.11d 叶片微卷，株高8 cm左右 B11 1.50 0.30 3.58±0.23g 叶翠绿色较小，株高5 cm左右 B12 1.50 0.40 2.25±0.05i 叶黄脱落，基部有愈伤，株高3 cm左右 B13 2.00 0.10 3.40±0.56g 叶小，部分发白，株高3.5 cm左右 B14 2.00 0.20 2.86±0.02h 叶浅绿色，株高4 cm左右 B15 2.00 0.30 1.84±0.02j 叶绿色，株高3 cm左右 B16 2.00 0.40 1.25±0.04k 叶基部浅黄色，株高2.5 cm左右 ![]()
图 1 红双喜月季组织培养注：A为增殖苗；B为生根苗；C为移栽苗；D为移栽3个半月后苗。Figure 1. Tissue culture of Double Delight Chinese roseNote:A is a proliferating seedling.B is rooting seedling.C is transplanted seedling. D is a seedling cultured for 3 and a half months after transplanting.2.4 基本培养基对生根的影响
在接种第15 d时，发现MS、1/4MS有根源出现，在接种第20 d时，1/2MS、1/6MS长出1 cm左右的白色不定根，培养30 d后统计、计算各项指标，结果如表 5，由表 5可以看出C3与C4、C1、C2之间生根率差异均显著，从生根率和根生长状态来看C3整体效果也好于其他3种处理且移栽易成活。所以选择1/4MS作为生根基本培养基。
表 5 基本培养基对生根的影响Table 5. Effect of basal medium on rooting of seedlings处理
Treatment基本培养基
Minimal mediumIBA
Indole-3-Butytric acid/(mg·L-1)生根率
Rooting rate
/%平均根数
Average rootnumber/条平均根长
Average root length/cm生长状态
Growing statusC1 MS 0.10 76.67±3.34b 3.50 2.00 褐色，细弱 C2 1/2MS 0.10 54.44±1.93c 2.10 4.80 白色，较粗 C3 1/4MS 0.10 84.44±5.09a 5.10 4.30 白色，较粗 C4 1/6MS 0.10 72.22±3.85b 7.60 6.00 黄褐色，较细 注：生根率为均值±标准差；表 6、7同。
Note:Rooting rate is mean±standard deviation, table 6 and 7 identical.2.5 不同浓度IBA、NAA对生根的影响
由表 6可知，随IBA浓度的增加，生根率呈逐渐降低的趋势；随NAA浓度的增加，生根率呈先升高后下降的趋势。当IBA与NAA浓度相同时，IBA生根率大于NAA生根率。同种激素不同浓度下，以较小浓度(0.05 mg·L-1)IBA生根效果好，生根率达91.11%。
表 6 不同浓度IBA、NAA对生根的影响Table 6. Effect of IBA and NAA concentrations on rooting of seedlings处理
Treatment培养基
MediumIBA
Indole-3-Butytric acid/(mg·L-1)NAA
Naphthlcetic acid/(mg·L-1)生根率
Rooting rate/%平均根数
Average root number/条平均根长
Average root length/cm生长状态
Growing statusD1 1/4MS 0.05 - 91.11±6.94a 5.40 4.90 白色，粗 D2 1/4MS 0.10 - 84.44±5.09a 5.10 4.30 白色，较粗 D3 1/4MS 0.15 - 71.11±5.09b 5.60 2.10 黑色，细弱 D4 1/4MS - 0.05 60.00±3.33cd 1.00 2.50 黄褐色，细弱 D5 1/4MS - 0.10 67.78±6.94bc 2.30 3.20 黄白色，较粗壮 D6 1/4MS - 0.15 54.44±5.09d 3.50 4.70 褐色，较细 2.6 活性炭浓度对生根的影响
在1/4MS+0.05 mg·L-1 IBA的基础上添加不同浓度的活性炭，结果如表 7。处理E4与E2、E3、E5之间差异显著，虽与E1差异不显著，但生根率提高4.45%。所以可以认为最佳生根培养基为1/4MS+0.05 mg·L-1 IBA+2.50 g·L-1活性炭，生根率为95.56%。生根效果如图 1-B。
表 7 不同活性炭浓度对生根的影响Table 7. Effect of activated carbon concentration on rooting of seedlings处理
Treatment活性炭浓度
Activated carbon concentration/(g·L-1)生根率
Rooting rate
/%平均根数
Average root number/条平均根长
Average root length/cm生长状态
Growing statusE1 0 91.11±5.09 ab 4.20 4.50 根较粗，白色 E2 1.50 76.67±3.34 d 3.50 3.20 根细，白色 E3 2.00 80.00±3.34 cd 3.00 6.50 根细，白色 E4 2.50 95.56±1.93 a 4.60 5.30 根较细，白色 E5 3.00 85.56±5.09 bc 5.20 5.60 根细，白色 2.7 不同基质对移栽成活率的影响
将组培苗移栽于不同的栽培基质中，30 d后统计、计算成活率，结果见表 8，从极值R可以看出，影响移栽成活率大小的主要因素依次为蛭石＞珍珠岩＞细沙＞椰糠。由各因素、水平均值，可以筛选出栽培基质最优组合为A2B2C3D2，即V细沙:V蛭石:V珍珠岩:V椰糠=1:2:3:1。可见该组合并没有出现在正交表内，验证该组合成活率为98.33%。从正交表可以看出，处理F5即A2B2C3D1成活率最高为96.67%，并且与其他处理差异显著，就成活率来看，移栽基质选最优组合为A2B2C3D2，按成本来看移栽基质可以选择组合A2B2C3D1。移栽效果图 1-C、D。
表 8 不同基质正交试验结果极差分析及多重比较Table 8. Range analysis and multiple comparisons on culture media tested with orthogonal matrix处理
Treatment因素Factor 成活率
Survival rate/%A(细沙)Fine sand B(蛭石)Vermiculite C(珍珠岩)Perlite D(椰糠)Coconut bran F1 0 1 1 0 63.33±5.77 de F2 0 2 2 1 76.67±2.89 c F3 0 3 3 2 70.00±5.00 cd F4 1 1 2 2 55.00±5.00 f F5 1 2 3 0 96.67±2.89 a F6 1 3 1 1 86.67±5.77 b F7 2 1 3 1 66.67±2.89 de F8 2 2 1 2 75.00±5.00 c F9 2 3 2 0 61.67±2.89 ef X1 70.00 b 61.67 c 75.00 a 74.44 a X2 80.00 a 83.33 a 64.67 b 76.67 a X3 67.78 b 72.78 b 78.33 a 66.67 b R 12.22 21.67 13.87 10.00 最优组合 A2 B2 C3 D2 注：X1、X2、X3分别为各列各水平成活率均值，R为极值。
Note:X1、X2、X3 are the mean values of survival rate at each level in each column, R is the extreme value.3. 讨论与结论
月季组培快繁技术建立关键步骤之一是外植体消毒的研究，拥有较高的污染率和死亡率既影响了繁殖速度、增加成本，同时也浪费大量培养材料[9]。李坤峰等[10]采用75% C2H5OH灭菌40s，再用0.1%HgCl2灭菌10 min，成活率为83.3%。武荣花等[11]采用75% C2H5OH浸泡30 s，再用2%NaClO溶液消毒13~14 min，外植体成活率在67%左右。以上研究外植体成活率均未达到90%，本试验研究发现以75% C2H5OH灭菌30 s配合0.1% HgCl2灭菌6 min，可将外植体成活率提高至90%以上，高达97.78%。产生这种差异的原因可能是由于试剂不适宜或时间过长致使外植体褐化或死亡，进而导致成活率不高。也有可能与外植体取材因时间、地点、外植体大小不同以及植物本身所处环境积累的有害物质等有关，另本课题组前期研究发现，取自长春儿童公园的月季，要比取自白山基地温室内的月季在外植体消毒方面困难，培养材料易污染，培养时需在培养基中加入抑菌剂，启动培养也相对较缓慢，进一步验证了存在这种差异的可能性。
笔者在初代培养阶段采用正交试验设计，以较小的试验规模，研究多因素共同作用下对初代培养的影响，筛选出最佳培养基为MS+3.00 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA，诱导率为95.56%，较刘会超等[12]研究诱导率提高了25.42%。其中对诱导率影响力大小的主要因素依次为基本培养基＞6-BA＞NAA，试验研究发现以MS作为基本培养基进行培养，在外植体萌发时间、丛生芽长势及芽苗质量上效果均要好于B5和WPM培养基。在试验范围内可以初步确定MS为红双喜月季组培最适基本培养基，由于现有的研究并未见到关于红双喜月季组织培养基本培养基的筛选，因此本试验进一步完善了其组织培养体系。闫海霞[13]、李纯佳[14]等研究表明，月季‘卡罗拉’和大花香水月季在组织培养阶段所需基本培养基均为WPM。这与本试验存在差异，可见在对不同品种月季进行组织培养时筛选基本培养基的重要性，而产生这种差异的原因可能是因为不同品种月季组织培养所需的化学成分及用量不同，MS培养基大量元素中的K+、NH4+用量均比WPM大，且Ca2+、VB1用量也不同，在WPM的基础上，MS比其多了KI、CoCl2·6H2O两种化学成分。
在红双喜月季继代增殖培养阶段，有研究表明采用6-BA与NAA配合使用，其增殖系数普遍不高(2.09[6]、2.40[12]、3.50[7]、5.00[15])。与前人不同，本研究以0.10 mg·L-1 IBA与1.00 mg·L-1 6-BA配合使用增殖系数可达6.61，有效地提高了其繁殖速度，可在短时间内获得大量的无菌苗。存在这种差异，可能是因为增殖系数对于6-BA与IBA之间的交互作用比对6-BA与NAA之间的交互作用反应更敏感，且各自不同浓度配比对彼此交互作用产生不同影响，或促进或抑制，从而导致作用于同种植物产生不同效果。由于试验仅对激素及浓度进行了研究，其他影响因素如继代周期等并未进行相关探讨，存在一定的局限性，对其进行研究有望将增殖系数进一步提高。
木本植物组培苗能否正常生根是组培快繁关键技术难点之一。研究发现，在红双喜月季生根阶段，其最佳培养基为1/4 MS+0.05 mg·L-1 IBA+2.50 g·L-1活性炭，生根率可达95.56%，高于前人研究结果(1/2 MS+0.01 mg·L-1 IBA，生根率73.3[12]；1/2 MS+0.3 mg·L-1 NAA，生根率90%[15])。与前人研究不同的是本研究发现将矿物质浓度降低至1/4 MS，可以取得较好的生根效果。在不定根的形成过程中，生长素起着重要的作用，添加生长素可引起组培苗基部薄壁细胞脱分化，形成愈伤组织，进而长出不定根[16]。试验研究发现，IBA对于促进诱导生根效果优于NAA，且较小浓度的IBA(0.05 mg·L-1)生根效果好，生根率91.11%，高浓度反而会抑制根系生长。有研究发现在生根培养基中添加300 mg·L-1活性炭，3个品种月季生根率均能达到90%以上[17]。前人也有研究表明，在诱根培养基中加入活性炭对根的诱导并没有促进作用，反而会推迟其生根时间[18]。笔者发现在添加2.50 g·L-1活性炭时可将红双喜月季生根率提高4.88%，生根率达到95.56%，取得较好的生根效果。存在这种差异的原因可能是不同月季品种对于不同浓度活性炭敏感程度不同，也可能是添加不同浓度活性炭改变培养基pH，导致个别矿物质元素易形成不溶性化合物，影响植物对其吸收，然而其作用机理并未十分明了，还有待进一步研究。
组培苗移栽是否成活是植物组织培养能否规模化生产的关键所在。在组培苗进行移栽时，常用的栽培基质有蛭石、珍珠岩、泥炭、细沙、腐殖土、草炭土等，或者几种基质以不同比例混合使用[19-21]。本试验采用正交试验设计，探讨细沙、蛭石、珍珠岩、椰糠不同体积配比的移栽成活率，在减少试验花费的同时，也能取得较好的试验结果。其结果显示以细沙、蛭石、珍珠岩和椰糠(体积比为1:2:3:1)混合使用，即保证其具有良好的透气性、排水性，同时也确保不会因土壤湿度过大致使组培苗腐烂死亡，移栽成活率为98.33%。与现有研究相比[22-24]，采用此方法可有效地提高组培苗移栽成活率，进而获得大量的完整植株，达到工产化生产的目的。
综上所述，试验明确了红双喜月季茎段最佳灭菌处理为75%酒精灭菌30s+0.1%升汞灭菌6 min；最适初代培养的培养基为MS+3.00 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA，诱导率为95.56%；继代增殖培养最适培养基为MS+1.00 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 IBA，增殖系数为6.61；生根培养最适培养基为1/4MS+0.05 mg·L-1 IBA+2.50 g·L-1活性炭，生根率为95.56%；组培苗移栽最适基质为V细沙:V蛭石:V珍珠岩:V椰糠=1:2:3:1，移栽成活率为98.33%。本研究所建立的组培快繁技术体系，可为工厂化生产提供科学依据及技术指导。
-
![]()
图 1 红双喜月季组织培养
注：A为增殖苗；B为生根苗；C为移栽苗；D为移栽3个半月后苗。
Figure 1. Tissue culture of Double Delight Chinese rose
Note:A is a proliferating seedling.B is rooting seedling.C is transplanted seedling. D is a seedling cultured for 3 and a half months after transplanting.
表 1 灭菌时间对外植体接种的影响
Table 1 Effect of disinfection time on explant inoculation
处理
Treatment灭菌时间Disinfection time/min 污染率
Contamination rate/%死亡率
Mortality rate/%75%酒精
75% alcohol0.1%升汞
0.1% mercuric chlorideA1 0.25 4 65.56±0.96a 0 A2 0.25 5 58.89±0.91b 0 A3 0.25 6 34.44±0.76e 0 A4 0.25 7 18.89±0.94g 4.44±0.56c A5 0.50 4 57.78±0.84b 0 A6 0.50 5 45.56±0.96c 0 A7 0.50 6 2.22±1.92h 0 A8 0.50 7 0 17.78±0.94b A9 0.75 4 41.11±2.26d 2.22±1.92d A10 0.75 5 24.44±0.50f 3.33±0.38d A11 0.75 6 0 18.89±0.13b A12 0.75 7 0 26.67±1.53a 注：同列数据后不同字母者表示差异达显著水平(P＜0.05)。表 2~8同。
Note:The difference between different letters after the same column data reached a significant level(P＜0.05).The same as table 2-8.
下载: 导出CSV
表 2 诱导率正交试验极差分析及多重比较
Table 2 Extreme difference analysis and multiple comparison on induction rates obtained from orthogonal test
处理
Treatment因素Factor 诱导率
Inductivity/%A：基本培养基
Minimal mediumB：6-BA 6-Benzylaminopurine
/(mg·L-1)C：NAA 1-naphthlcetic acid
/(mg·L-1)1 1(MS) 1(1.00) 1(0.10) 83.33±3.34b 2 1 2(2.00) 2(0.20) 47.78±5.09c 3 1 3(3.00) 3(0.30) 95.56±1.93a 4 2(B5) 1 2 20.00±3.33de 5 2 2 3 11.11±3.85f 6 2 3 1 14.44±1.93ef 7 3(WPM) 1 3 16.67±3.34ef 8 3 2 1 23.33±3.34d 9 3 3 2 18.89±3.85de X1 75.56 a 40.00 a 40.37 a X2 15.18 b 27.41 b 28.89 b X3 19.63 b 42.96 a 41.11 a R 60.37 15.56 11.48 最优组合 A1 B3 C3 注：Xv1、X2、X3分别为各列各水平诱导率均值；R为极值。
Note:X1, X2, X3 are the mean values of induction rate at each level in each column, R is the extreme value.
下载: 导出CSV
表 3 6-BA、IBA水平间增殖系数的多重比较
Table 3 Multiple comparison on proliferation coefficients between 6-BA and IBA levels
6-BA
6-Benzylaminopurine/
(mg·L-1)均值
Mean valueIBA
Indole-3-Butytric acid(mg·L-1)均值
Mean value0.50 4.40b 0.10 5.20a 1.00 5.12a 0.20 4.65b 1.50 3.78c 0.30 3.40c 2.00 2.34d 0.40 2.39d
下载: 导出CSV
表 4 不同质量浓度6-BA与IBA配比对增殖的影响
Table 4 Effects of 6-BA and IBA concentrations on seedling proliferation
处理
Treatment6-BA 6-Benzylaminopurine
/(mg·L-1)IBA Indole-3-Butytric acid/(mg·L-1) 增殖系数
Propagation coefficient生长状态
Growing statusB1 0.50 0.10 6.07±0.20b 叶片绿色，株高4 cm左右 B2 0.50 0.20 5.19±0.23c 叶片翠绿色，株高4.5 cm左右 B3 0.50 0.30 4.15±0.15e 部分叶片黄色，株高4.8 cm左右 B4 0.50 0.40 2.20±0.10i 叶片绿色，株高3 cm左右 B5 1.00 0.10 6.61±0.11a 叶片翠绿，较多腋芽，株高6 cm左右 B6 1.00 0.20 5.99±0.19b 腋芽叶片黄绿色，株高7 cm左右 B7 1.00 0.30 4.01±0.15ef 叶绿色个别脱落，株高5.5 cm左右 B8 1.00 0.40 3.85±0.29f 叶片黄绿色，株高4 cm左右 B9 1.50 0.10 4.73±0.06d 叶小绿色，株高3.5 cm左右 B10 1.50 0.20 4.55±0.11d 叶片微卷，株高8 cm左右 B11 1.50 0.30 3.58±0.23g 叶翠绿色较小，株高5 cm左右 B12 1.50 0.40 2.25±0.05i 叶黄脱落，基部有愈伤，株高3 cm左右 B13 2.00 0.10 3.40±0.56g 叶小，部分发白，株高3.5 cm左右 B14 2.00 0.20 2.86±0.02h 叶浅绿色，株高4 cm左右 B15 2.00 0.30 1.84±0.02j 叶绿色，株高3 cm左右 B16 2.00 0.40 1.25±0.04k 叶基部浅黄色，株高2.5 cm左右
下载: 导出CSV
表 5 基本培养基对生根的影响
Table 5 Effect of basal medium on rooting of seedlings
处理
Treatment基本培养基
Minimal mediumIBA
Indole-3-Butytric acid/(mg·L-1)生根率
Rooting rate
/%平均根数
Average rootnumber/条平均根长
Average root length/cm生长状态
Growing statusC1 MS 0.10 76.67±3.34b 3.50 2.00 褐色，细弱 C2 1/2MS 0.10 54.44±1.93c 2.10 4.80 白色，较粗 C3 1/4MS 0.10 84.44±5.09a 5.10 4.30 白色，较粗 C4 1/6MS 0.10 72.22±3.85b 7.60 6.00 黄褐色，较细 注：生根率为均值±标准差；表 6、7同。
Note:Rooting rate is mean±standard deviation, table 6 and 7 identical.
下载: 导出CSV
表 6 不同浓度IBA、NAA对生根的影响
Table 6 Effect of IBA and NAA concentrations on rooting of seedlings
处理
Treatment培养基
MediumIBA
Indole-3-Butytric acid/(mg·L-1)NAA
Naphthlcetic acid/(mg·L-1)生根率
Rooting rate/%平均根数
Average root number/条平均根长
Average root length/cm生长状态
Growing statusD1 1/4MS 0.05 - 91.11±6.94a 5.40 4.90 白色，粗 D2 1/4MS 0.10 - 84.44±5.09a 5.10 4.30 白色，较粗 D3 1/4MS 0.15 - 71.11±5.09b 5.60 2.10 黑色，细弱 D4 1/4MS - 0.05 60.00±3.33cd 1.00 2.50 黄褐色，细弱 D5 1/4MS - 0.10 67.78±6.94bc 2.30 3.20 黄白色，较粗壮 D6 1/4MS - 0.15 54.44±5.09d 3.50 4.70 褐色，较细
下载: 导出CSV
表 7 不同活性炭浓度对生根的影响
Table 7 Effect of activated carbon concentration on rooting of seedlings
处理
Treatment活性炭浓度
Activated carbon concentration/(g·L-1)生根率
Rooting rate
/%平均根数
Average root number/条平均根长
Average root length/cm生长状态
Growing statusE1 0 91.11±5.09 ab 4.20 4.50 根较粗，白色 E2 1.50 76.67±3.34 d 3.50 3.20 根细，白色 E3 2.00 80.00±3.34 cd 3.00 6.50 根细，白色 E4 2.50 95.56±1.93 a 4.60 5.30 根较细，白色 E5 3.00 85.56±5.09 bc 5.20 5.60 根细，白色
下载: 导出CSV
表 8 不同基质正交试验结果极差分析及多重比较
Table 8 Range analysis and multiple comparisons on culture media tested with orthogonal matrix
处理
Treatment因素Factor 成活率
Survival rate/%A(细沙)Fine sand B(蛭石)Vermiculite C(珍珠岩)Perlite D(椰糠)Coconut bran F1 0 1 1 0 63.33±5.77 de F2 0 2 2 1 76.67±2.89 c F3 0 3 3 2 70.00±5.00 cd F4 1 1 2 2 55.00±5.00 f F5 1 2 3 0 96.67±2.89 a F6 1 3 1 1 86.67±5.77 b F7 2 1 3 1 66.67±2.89 de F8 2 2 1 2 75.00±5.00 c F9 2 3 2 0 61.67±2.89 ef X1 70.00 b 61.67 c 75.00 a 74.44 a X2 80.00 a 83.33 a 64.67 b 76.67 a X3 67.78 b 72.78 b 78.33 a 66.67 b R 12.22 21.67 13.87 10.00 最优组合 A2 B2 C3 D2 注：X1、X2、X3分别为各列各水平成活率均值，R为极值。
Note:X1、X2、X3 are the mean values of survival rate at each level in each column, R is the extreme value.
下载: 导出CSV
-
[1] 杨涛, 钱蕾, 吕永桂, 等.丰花月季低成本组织培养快繁的研究[J].江苏农业科学, 2015, 43(8):53-55. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/jsnykx201508017 YANG T, QIAN L, LV Y G, et al.Studies on tissue culture and rapid propagation with low-cost of floribunda roses[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2015, 43(8):53-55.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/jsnykx201508017
[2] 孟令宁, 晏慧君, 张颢, 等.大花香水月季再生体系的初步建立[J].云南农业大学学报(自然科学), 2012, 27(6):870-874. DOI: 10.3969/j.issn.1004-390X(n).2012.06.017 MENG L Y, YAN H J, ZHANG Y, et al.Prelimary establishment of the regeneration system of Rosa odorata var.gigantea[J]. Yunnan Agricultural University(Natural Science) , 2012, 27(6):870-874.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1004-390X(n).2012.06.017
[3] 林桂玉, 李美芹, 吕金浮, 等.藤本月季紫皇后组织培养技术[J].江苏农业科学, 2014, 42(9):56-58. DOI: 10.3969/j.issn.1002-1302.2014.09.017 LIN G Y, LI M Q, LV J F, et al.Tissue culture technology of purple queen climbing rose varieties[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2014, 42(9):56-58.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1002-1302.2014.09.017
[4] 冯欢, 易姝利, 谢佳恒, 等.微型月季愈伤组织诱导及植株再生[J].植物学报, 2014, 49(5):595-602. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwxtb201405009 FENG H, YI S L, XIE J H, et al.Callus induction and plant regeneration of Rosa hybrida[J].Chinese Bulletin of Botany, 2014, 49(5):595-602.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwxtb201405009
[5] 马雪, 陈雪, 张金柱, 等.树状月季'2004-4'的组织培养及快繁体系的建立[J].作物杂志, 2012(2):62-64, 159. DOI: 10.3969/j.issn.1001-7283.2012.02.015 MA X, CHEN X, ZHANG J Z, et al.Tissure culture and progagation of standards rose '2004-4' in vitro[J]. Crops, 2012(2):62-64, 159.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1001-7283.2012.02.015
[6] 李启任, 吴明林.月季组培快繁技术研究[J].云南大学学报(自然科学版), 1997(4):366-369. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/ahnykx200621039 LI Q R, WU M L.Studay on rapid multiplication technique of Rosa chinensis by tissue culture[J]. Journal of Yunnan Agricultural University(Natural Science), 1997(4):366-369.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/ahnykx200621039
[7] 高彩云, 季晓泉, 李宝山.月季组织培养技术[J].现代农业, 2005(7):26-27. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/xiandny200507032 GAO C Y, JI X Q, LI B S.Tissue culture technology of Chinese rose[J]. Modern Agriculture, 2005(7):26-27.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/xiandny200507032
[8] 廖明安.园艺植物研究法[M].北京:中国农业出版社, 2005:45-57. LIAO M A.Research Methods of Horticultural Plants[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2005:45-57.(in Chinese)
[9] 孙冬玲.黄连花种子萌发及组织培养体系建立[D].哈尔滨: 东北林业大学, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10225-1014402378.htm SUN D L.Establishment of seed germination and tissue culture system of Lysimachia davurica Ledeb.[D]. Northeast Forestry University, 2014.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10225-1014402378.htm
[10] 李坤峰, 陈志, 陈剑平, 等.Vendela月季产业化快繁体系研究[J].核农学报, 2014, 28(10):1790-1797. DOI: 10.11869/j.issn.100-8551.2014.10.1790 LI K F, CHEN Z, CHEN J P, et al.Plant regeneration of Rosa chinensis 'Vendela'for scale-up production via direct qrganogenesis[J]Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2014, 28(10):1790-1797.(in Chinese) DOI: 10.11869/j.issn.100-8551.2014.10.1790
[11] 武荣花, 于晓淅, 王升, 等.月季F1代植株的组培快繁研究[J].河南农业科学, 2018, 47(10):102-104, 136. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/hnnykx201810018 WU R H, YU X X, WANG S, et al.Optimal choice of F1 rose tissue culture and rapid propagation technique[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2018, 47(10):102-104, 136.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/hnnykx201810018
[12] 刘会超, 郭丽娟, 贾文庆, 等.不同消毒方式及生长调节剂浓度对红双喜月季组培的影响[J].贵州农业科学, 2010, 38(10):14-17. DOI: 10.3969/j.issn.1001-3601.2010.10.005 LIU H C, GUO L J, JIA W Q, et al.Effect of different sterilization pattern and growth regulator concentration on tissue culture of Chinese rose[J]. Guizhou Agricultural Sciences , 2010, 38(10):14-17.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1001-3601.2010.10.005
[13] 闫海霞, 蒋月喜, 黄昌艳, 等.月季'卡罗拉'的组培快繁技术[J].热带作物学报, 2016, 37(9):1741-1746. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.014 YAN H X, JIANG Y X, HUANG C Y, et al.The tissue culture and rapid regeneration of rosa hybrida 'carola'[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2016, 37(9):1741-1746.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.014
[14] 李纯佳, 张颢, 周宁宁, 等.大花香水月季(Rosa odorata var.gigantea)茎段组织培养的抗褐化研究[J].西南农业学报, 2012, 25(3):1047-1050. DOI: 10.3969/j.issn.1001-4829.2012.03.063 LI C J, ZHANG Y, ZHOU N N, et al.Study on anti-browning in shoots tissue culture of rosa odorata var.gigantea[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2012, 25(3):1047-1050.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1001-4829.2012.03.063
[15] 曹伟杰, 陈崇顺, 王轶, 等.月季离体培养植株高效再生体系的建立[J].江苏农业科学, 2008(1):102-105. DOI: 10.3969/j.issn.1002-1302.2008.01.037 CAO W J, CHEN C S, WANG Y, et al.Establishment of the efficient regeneration system via culture in vitro for Chinese rose[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2008(1):102-105.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1002-1302.2008.01.037
[16] 张治安, 陈展宇.植物生理学[M].长春:吉林大学出版社, 2009:204. ZHANG Z A, CHEN Z Y.Phytophysiology[M]. Changchun:Jilin University Press, 2009:204.(in Chinese)
[17] 龚维红, 尤伟忠, 丁小晏.3个不同月季品种的组培技术研究[J].现代农业科技, 2014(12):170, 174. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/ahny201412107 GONG W H, YOU W Z, DING X Y, et al.Study on tissue culture of 3 kinds of different roses[J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2014(12):170, 174.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/ahny201412107
[18] 叶贻勋, 黄青峰, 黄瑞方, 等.月季的离体快速繁殖技术[J].福建农业大学学报(自然科学版), 2000(2):172-175. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/fjnydxxb200002009 YE Y X, HUANG Q F, HUANG R F, et al.In vitro rapid propagation techniques of China rose[J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition), 2000(2):172-175.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/fjnydxxb200002009
[19] 邱玉娟, 张含生, 张建全, 等.蓝靛果组培苗移栽壮苗基质研究[J].中国野生植物资源, 2018, 37(1):75-79. DOI: 10.3969/j.issn.1006-9690.2018.01.016 QIU Y J, ZHANG H S, ZHANG J Q, et al.The research for lonicera edulis in vitro plantlets transplanting matrix[J]. Chinese Wild Plant Resources, 2018, 37(1):75-79.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1006-9690.2018.01.016
[20] 许燕, 张绍龙, 陈育华, 等.姜薯高效离体再生体系的建立[J].作物杂志, 2017(6):60-64. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwzz201706011 XU Y, ZHANG S L, CHENG Y H, et al.Establisment of highly effective in vitro regeneration system of Dioscorea alata L.[J]Crops, 2017(6):60-64.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/zwzz201706011
[21] 林茂, 唐庆, 李进华, 等.不同因素对金花茶组培苗移栽成活的影响[J].西南农业学报, 2017, 30(9):2119-2123. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/xnnyxb201709033 LIN M, TANG Q, LI J H, et al.Effects of different factors on tissue culture seedling transplanting survival of camellia nitidissima[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2017, 30(9):2119-2123.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/xnnyxb201709033
[22] 俞燕芳, 管帮富, 彭火辉, 等.3种不同花色大花月季的组织培养研究[J].江西农业学报, 2013, 25(10):33-35. DOI: 10.3969/j.issn.1001-8581.2013.10.010 YU Y F, GUAN B F, PENG H H, et al.Study on tissue culture of 3 kinds of hybrid tea roses with different colors[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2013, 25(10):33-35.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1001-8581.2013.10.010
[23] 李艳, 王青, 王火旭, 等.微型月季组织培养试管苗移栽试验[J].辽宁师范大学学报(自然科学版), 2001(3):306-307. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lnsfdxxb200103018 LI Y, WANG Q, WANG H X, et al.Test of transplant on miniature roses plantlets[J]. Journal of Liaoning Normal University(Natural Science Edition), 2001(3):306-307.(in Chinese) http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/lnsfdxxb200103018
[24] 刘小夫, 李彩华, 张金柱, 等.丰花月季YJ'2004-2'组培快繁技术研究[J].作物杂志, 2012(6):74-76, 1. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10225-1014402378.htm LIU X F, LI C H, ZHANG J Z, et al.Tissue culture and propagation of floribunda rose YJ'2004- 2'in vitro[J]. Crops, 2012(6):74-76, 1.(in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10225-1014402378.htm
-
期刊类型引用(6)
1. 周艳，侯秋梅，张佳佳，杨朔，吴洪娥. 月季离体快繁技术研究现状及展望. 农业与技术. 2025(05): 133-137 . 
百度学术
2. 文天崇，乾朝阳，李布野. 植物组织培养外植体灭菌技术研究进展. 现代农业科技. 2024(13): 72-76 . 百度学术
3. 刘扬，李宏杨，许惠秋，张贻雷，梁静萍，陈冠铭. 月季粉扇离体快繁技术研究. 热带农业科学. 2022(01): 37-42 . 百度学术
4. 王云云，马珊珊，张旌，陈韦彤，车代弟. 不同抗寒性月季品系的组织培养. 分子植物育种. 2022(04): 1264-1272 . 百度学术
5. 李芬，刘木清，祝剑峰. 欧月红宝石冰组织培养快繁技术研究. 湖北农业科学. 2022(15): 218-221 . 百度学术
6. 苗卫东，高换超，李俊涛，王宇扬，李凯薇. 月季无菌材料的获得及不定芽的诱导. 江苏农业科学. 2021(18): 48-53 . 百度学术
其他类型引用(0)
计量
- 文章访问数: 1510
- HTML全文浏览量: 216
- PDF下载量: 33
- 被引次数: 6
