0.   引言

【研究意义】大花金挖耳Carpesium macrocephalum Franch.et Sav.又名香油罐、神灵草，属于菊科Compositae天名精属Carpesium多年生草本植物，在我国陕西、甘肃南部、四川北部、东北、华北等地的山坡灌丛及混交林缘有分布^[1]。KIM等^[2]、YANG C等^[3]、王俊儒等^[4]从大花金挖耳分离鉴定得到黄酮类、萜类、香豆素等化合物近100种，大花金挖耳具有抗肿瘤、止血等医用价值^{[1, 5]}和杀菌、杀虫及除草等多种农药活性^[6-8]，目前尚无人工引种栽培。大花金挖耳及天名精属同属植物多含黄酮、酚类、萜类、甾体、脂肪酸及苯的衍生物等多种化合物，药用价值高^[9]，极具开发价值。【前人研究进展】为了缓解大花金挖耳及同属植物资源保护与利用的矛盾, 以及黄酮等生物活性物质人工合成的困难^[10-11]，利用植物细胞培养技术生产大花金挖耳活性成分是一种有效方法^[12]。研究表明，铁Fe、锰Mn、锌Zn、铜Cu、钼Mo、硼B和钴Co等微量元素对植物细胞培养次生代谢产物具有重要的作用^[13-15]。【本研究切入点】截至目前，国内外尚无微量元素影响大花金挖耳悬浮细胞黄酮生物合成的研究。【拟解决的关键问题】本文在摇瓶液体悬浮培养条件下, 研究了大花金挖耳细胞培养基中添加不同浓度Mn²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、I^-、BO₃^3-、MoO₄^2-等8种微量元素^[16]对大花金挖耳悬浮培养细胞的生长和黄酮生物合成的影响，并测试了大花金挖耳悬浮培养细胞的乙醇粗提物对苘麻、鬼针草2种常见杂草和黄瓜、黄豆2种食用植物的化感作用, 试验结果为大规模细胞培养大花金挖耳活性物质奠定了基础。

1.   材料和方法

1.1   试验材料

1.1.1   受体植物

苘麻Abutilon theophrasti和鬼针草Bidens pilosa植物种子采自西北农林科技大学试验农场。黄瓜种子(Cucumis sativus，品种为西农58)和黄豆种子Glycine max购自陕西杨陵种子市场。

1.1.2   试剂

芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)；萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA) (美国Sigma公司)；培养基中添加的蔗糖、肌醇、盐酸硫胺素(VB1)及各种微量元素化合物均为分析纯；丙酮、乙醇为分析纯。

1.2   试验方法

1.2.1   细胞培养方法

大花金挖耳悬浮细胞系^[12]继代培养于NT+1.0 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 6-BA培养基中，继代培养3代后，接种约40 g·L^-1鲜重于不同试验处理的NT培养基中进行悬浮培养。培养条件为：摇床转速120r·min^-1、(25±2)℃、光照强度1 500~2 000 lx、光照12 h·d^-1，蔗糖4%、培养基高压灭菌前pH调至5.8, 所有试验重复3次。试验采用250 mL三角瓶, 每瓶盛100 mL培养基。

1.2.2   8种微量元素对大花金挖耳细胞生长和黄酮类化合物累积的影响

以NT为基本培养基，通过加减改变NT培养基中8种微量元素的浓度，分别考察微量元素对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响，并以NT培养基中Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、I^-、BO₃^3-、MoO₄^2-等8种微量元素固有的浓度^[16]为对照。Zn²⁺在NT培养基中的浓度设置为0.03(CK)、0.06、0.12、0.18、0.3 mmol·L^-1；Mn²⁺在NT培养基中的浓度依次为0.1(CK)、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol·L^-1；Co²⁺在NT培养基中的浓度依次为0.05、0.1(CK)、0.2、0.3、0.5、0.7 μmol·L^-1；Cu²⁺在NT培养基中的浓度依次为0.1、0.2(CK)、0.4、0.6、0.8 μmol·L^-1；Fe²⁺在NT培养基中的浓度依次为0.05、0.1(CK)、0.2、0.3、0.4 mmol·L^-1；I^-在NT培养基中的浓度依次为5(CK)、10、15、20、25、30 μmol·L^-1；BO₃^3-在NT培养基中的浓度依次为0.1(CK)、0.2、0.4、0.6、1.0 mmol·L^-1；MoO₄^2-在NT培养基中的浓度依次为1.0(CK)、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μmol·L^-1。各处理均设3次重复。

1.2.3   生物量的测定

将上述不同处理悬浮培养20 d的褐化细胞进行抽滤，所得细胞置于60℃烘箱中，烘至恒重，以细胞干重(g·L^-1)为生长指标, 细胞净生长量=收获时细胞干重-接种时细胞干重。

1.2.4   黄酮含量的测定和产量的计算

采用分光光度法测定总黄酮含量^[12]。以芦丁为标准品，绘制标准曲线，确定检测波长为510 nm，以芦丁的浓度C(mg·mL^-1)对吸光值A进行线性回归，得回归方程C=0.0768 A-0.0004，r=0.999 7。将上述各试验处理中培养20 d的褐化细胞抽滤、烘干、粉碎, 过60目筛后，取适量细胞干粉, 以丙酮为溶剂，摇床振荡提取3次, 每次24 h，合并3次所得提取液, 浓缩后用30%乙醇定容至0.50 g·mL^-1。移取适量供试液, 在510 nm下测定其吸光值，按公式计算总黄酮含量(X)，X% = V×Y/N×M×10^-1，V为提取液体积(mL)，Y为供试液总黄酮质量浓度(mg·mL^-1)，N为样品质量(g)，M为稀释倍数。悬浮培养细胞总黄酮产量(mg·L^-1) =黄酮含量(%)×细胞生长量(g·L^-1)×1000。

1.2.5   幼苗生长的生物测定

采用幼苗生长法^[17]测试悬浮培养细胞粗提物对苘麻、鬼针草、黄瓜和黄豆等4种受体植物幼苗根生长的化感作用。将悬浮培养于NT+1.0 mg·L^-1NAA +0.2 mg·L^-1 6-BA中(NT培养基中微量元素为固有浓度^[16])20 d的褐化细胞抽滤、烘干、粉碎、过筛(60目), 取适量细胞干粉, 乙醇提取减压浓缩成浸膏，以超声波促溶，配制不同浓度的蒸馏水溶液, 在铺有2层滤纸、直径9 cm的培养皿中等量均匀加入2.5 mL供试蒸馏水溶液, 并将供试种子催芽后，均匀置入皿中，进行化感测定, 以蒸馏水处理作对照。各处理均置于(25±2)℃温室中暗光培养, 其间适量补充水分, 2 d后测定受体植物种子幼苗根生长的平均长度, 按公式IR=(CK- T)/CK(CK为对照值，T为处理值)计算化感抑制率(IR)。用最小二乘法得出供试溶液的毒力回归方程、相关系数(R)、抑制中浓度(EC₅₀)和95%置信限。

1.3   数据统计与分析

采用DPS数据分析软件对试验数据进行Duncan分析(P=0.05)。

2.   结果与分析

2.1   不同微量元素对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

2.1.1   Zn²⁺离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 1所示，NT培养基中，Zn²⁺离子浓度在0.03~0.30 mmol·L^-1范围内增加时，对大花金挖耳悬浮培养细胞黄酮生物合成有显著影响，细胞生长量和黄酮含量表现为先增后降。就细胞生长而言，0.03~0.3 mmol·L^-1 Zn²⁺浓度均适于细胞的生长，其中Zn²⁺浓度0.12 mmol·L^-1时，细胞生长显著增加，净生长量最高，达24.55 g·L^-1，是对照的1.13倍。随Zn²⁺浓度的增加，培养基中细胞黄酮含量增大，Zn²⁺浓度0.06 mmol·L^-1时，细胞黄酮含量最大为1.46%，是对照的1.20倍(P < 0.05)；Zn²⁺浓度0.12 mmol·L^-1时，培养基细胞黄酮产量达最高值382 mg·L^-1(P < 0.05)，是对照的1.33倍。

图  1  锌离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

注：图中不同字母表示不同处理在0.05水平存在显著差异(P < 0.05)，下同。

Figure  1.  Effects of Zn²⁺ concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

Note:Different lowercase letters on columns indicate significant difference between treatments at P < 0.05.The same as following charts.

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2.1.2   Mn²⁺离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 2所示，Mn²⁺浓度在0.1~0.8 mmol·L^-1范围内增加时，悬浮培养细胞的净生长量先增后降，但影响不显著，维持在19.16~22.76 g·L^-1，其中Mn²⁺浓度在0.1~0.8 mmol·L^-1范围内适于细胞的生长，浓度过高不利于细胞的生长。随着Mn²⁺浓度在0.1~0.8 mmol·L^-1范围内增加，大花金挖耳悬浮培养细胞中黄酮类化合物累积显著降低，从1.22%下降到0.43%，高浓度Mn²⁺不适于细胞黄酮的生物合成，黄酮产量以Mn²⁺浓度0.1~0.2 mmol·L^-1时较高，其中Mn²⁺浓度0.2 mmol·L^-1时, 黄酮产量最大，为291.28 mg·L^-1，是对照的1.01倍。

图  2  锰离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  2.  Effects of Mn²⁺ concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.1.3   Co²⁺离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 3所示，Co²⁺在0.05~0.7 μmol·L^-1浓度范围内增加时，对大花金挖耳悬浮培养细胞黄酮生物合成有显著影响，细胞生长量和黄酮含量呈先增后降的趋势。就细胞生长而言，0.1~0.7 μmol·L^-1 Co²⁺浓度均适于细胞的生长，其中Co²⁺浓度0.2 μmol·L^-1时，细胞净生长量最高，达24.55 g·L^-1，是对照的1.03倍。培养基中随Co²⁺浓度的增加，细胞黄酮含量先升后降，Co²⁺浓度0.2 μmol·L^-1时，细胞黄酮含量最高达1.35%，是对照的1.11倍(P < 0.05)，该浓度下细胞黄酮产量最高，达327.34 mg·L^-1，是对照1.14倍。

图  3  钴离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  3.  Effects of Go²⁺ concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.1.4   Cu²⁺离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 4所示，Cu²⁺在0.1~0.8 μmol·L^-1浓度范围内变化时，对悬浮培养细胞的生长和黄酮生物合成均有显著影响，细胞生长量和黄酮含量呈先增后降的趋势。Cu²⁺浓度0.4 μmol·L^-1时，细胞净生长量显著增大，高达22.95 g·L^-1，是对照的1.10倍。随培养基中Cu²⁺浓度的增加，细胞黄酮含量先升后降，Cu²⁺浓度0.4 μmol·L^-1时，细胞黄酮含量最高，达1.35%，是对照的1.11倍(P < 0.05)，培养基细胞黄酮产量最高，达337.82 mg·L^-1，是对照1.16倍。

图  4  铜离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  4.  Effects of Cu²⁺ concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.1.5   Fe²⁺离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 5所示，Fe²⁺浓度在0.05~0.4 mmol·L^-1范围内增加时，对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮生物合成影响显著，细胞净生长量和黄酮含量先增后降，随Fe²⁺浓度的增加，细胞褐化严重。Fe²⁺浓度在0.1~0.3 mmol·L^-1时，细胞净生长量、黄酮含量和产量都达到稳定高值，细胞净生长量维持在20.53~21.61 g·L^-1，黄酮含量维持在1.22~1.24%，黄酮产量维持在279.33~288.89 mg·L^-1，以Fe²⁺浓度在0.1 mmol·L^-1(对照)时，黄酮产量最高。

图  5  铁离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  5.  Effects of Fe²⁺ concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.1.6   I^-离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 6所示，在NT培养基添加KI时，当I^-浓度在5~30 μmol·L^-1范围内变化时，对悬浮培养细胞的生长影响不显著，但对细胞黄酮类化合物含量的影响显著。培养基中I^-浓度在5~20 μmol·L^-1范围内，黄酮含量变化不大，黄酮产量稳定，维持在288.69~293.90 mg·L^-1，I^-浓度在25~30 μmol·L^-1范围内继续加大时，黄酮含量显著下降。

图  6  碘离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  6.  Effects of I^- concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.1.7   BO₃^3-离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

如图 7所示，当NT培养基中BO₃^3-浓度在0.1~0.6 mmol·L^-1范围内，细胞生长良好，当BO₃^3-浓度在0.2 mmol·L^-1时，细胞净生长量高达22.75 g·L^-1，是对照的1.05倍。随培养基中BO₃^3-浓度的增加，黄酮含量先升后降，高浓度的BO₃^3-不利于细胞生长和黄酮合成，当BO₃^3-浓度在0.4 mmol·L^-1时，细胞黄酮含量和产量最高，分别达1.35%和333.76 mg·L^-1，分别是对照的1.11和1.16倍。

图  7  硼离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  7.  Effects of BO₃^3- concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.1.8   MoO₄^2-离子对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响

由图 8可知，在NT培养基中MoO₄^2-在1.0~6.0 μmol·L^-1时，对悬浮培养细胞的生长和黄酮生物合成均有显著影响。就细胞生长而言，MoO₄^2-浓度1.0~6.0 μmol·L^-1均适于细胞的生长，其中含4.0 μmol·L^-1 MoO₄^2-浓度的培养基细胞净生长量高, 达23.48 g·L^-1，是对照的1.08倍。随培养基中MoO₄^2-浓度的增加，黄酮含量先增后降，含3.0 μmol·L^-1 MoO₄^2-浓度的培养基细胞黄酮含量最高达1.53%，是对照的1.25倍，含3.0~4.0 μmol·L^-1 MoO₄^2-浓度的培养基细胞黄酮产量达379 mg·L^-1。

图  8  钼离子对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响

Figure  8.  Effects of MoO₄^2- concentration on cell growth and flavonoids content in suspension culture

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2.2   大花金挖耳培养细胞的乙醇粗提物对供试4种植物幼苗根的生长抑制作用

由表 1可见, 大花金挖耳悬浮培养细胞的乙醇粗提物对4种供试植物幼苗根的生长均有不同的抑制作用，并随粗提物水溶液浓度的升高，种子幼根生长抑制率增大。细胞粗提物对4种供试植物幼苗根生长的抑制中浓度(EC₅₀)在14.69~59.07 mg·mL^-1，EC₅₀值的大小顺序依次为:黄豆、苘麻、黄瓜、鬼针草，对黄豆的毒力最低, EC₅₀值为59.07 mg·mL^-1, 对鬼针草的毒力最大, EC₅₀值为14.69 mg·mL^-1。

表  1  大花金挖耳培养细胞的粗提物对4种供试植物幼苗根生长的毒力(2 d)

Table  1.  Virulence of crude extracts from C. macrocephalum culture on root growth of plant seedlings(2 d)

供试种子 Tested seeds	毒力回归线 Regression equation	有效中浓度/(mg·mL-1) EC50(95%CL)	相关系数 R
苘麻(根)Root of A.theohprasti	Y=-2.3061+5.6291 X	19.8571(10.0363~39.2878)	0.9971
鬼针草(根)Root of B.bipinnata	Y=3.3295+1.4313 X	14.6940(9.3904~22.9931)	0.9640
黄瓜(根)Root of C.sativus	Y=3.6709+1.0389 X	19.0260(12.2396~29.5752)	0.9522
黄豆(根)Root of G.max	Y=3.7408+0.7109 X	59.0704(49.8513~69.9943)	0.9914
注:Y表示生长抑制率的几率值；X表示粗提物质量浓度的对数值。 Note:Y is probability of growth inhibition rate and X logarithmic mass concentration of crude extracts.

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3.   讨论与结论

微量元素虽然含量较少，但大多是酶的组成成分或活化剂，在植物细胞代谢过程中与大量元素一样具有很重要的作用^[18-20]。本研究发现8种微量元素对大花金挖耳悬浮培养细胞黄酮类化合物的生物合成有显著影响。Co²⁺、Cu²⁺分别为培养基原浓度2倍、BO₃^3-和MoO₄^2-分别为培养基原浓度4倍时，黄酮生物合成显著增加，黄酮含量在各处理中最高，高浓度的Mn²⁺、I^-导致大花金挖耳悬浮培养细胞黄酮含量降低，说明在培养基中适量添加这些微量元素有利于大花金挖耳细胞的生长和黄酮的生物合成，但过高浓度的微量元素会导致黄酮生物合成下降。Fe²⁺在多种氧化还原反应中发挥着重要作用，与Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺等离子具有拮抗作用，培养基中Fe²⁺浓度过高会抑制细胞吸收Cu²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺等微量元素，从而抑制一些酶的活性而对细胞的生长和次生代谢物积累产生很大的影响^[21-22]。其可能的机理是：在细胞培养中，微量元素具有重要的生理作用，微量元素通过独立或相互作用影响着大花金挖耳悬浮细胞的光合、呼吸、氮代谢等初生代谢，进而影响黄酮类等化合物的次生代谢。如锰是许多酶的活化剂，在光合反应中发挥着重要的作用^{[21, 23]}；锌存在于许多不同植物细胞的蛋白质中，是呼吸作用的一个重要因素，缺锌和铁会造成悬浮细胞呼吸速率下降^[24]，研究发现NT培养基中微量元素Zn²⁺对大花金挖耳细胞黄酮产量的影响最大；钴能改善植物的生长、蒸腾及光合作用；铜具有多种氧化还原功能，能催化植物氧化还原反应^[21]；硼与细胞膜的功能关系密切，有影响细胞质膜上NADH氧化酶活性和质子分泌的作用，从而对悬浮细胞的生长造成影响^[24]；钼是氧化酶的辅酶，可促进光合作用强度^[25]。研究结果为进一步优化培养基成分和培养条件，提高大花金挖耳细胞悬浮培养活性物质奠定了基础。

植物化感作用是通过向环境中释放代谢物质，并主要影响植物种子萌发及幼苗生长，形成不同植物在化学方面的相互作用，协调植物与环境的关系^[26]。已知黄酮类化合物具有植物化学防御、化感作用和抗氧化等作用^[27]。本研究发现大花金挖耳悬浮细胞的胞内代谢产物对4种受体植物具有不同程度的化感作用，这可能与细胞代谢中产生的黄酮等物质有关。研究结果为进一步分离大花金挖耳细胞悬浮培养农药活性物质奠定了基础，为有效控制田间杂草、牧草混播和粮食作物的保护和农林复合系统的合理构建及优化提供了新的试验依据。