Cloning and Expression of Pathogenesis-related Protein Gene, BoPR1, in Brassica oleracea var. italica
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摘要: 病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）是参与植物抗病性的重要物质，在诱导系统抗性过程中起着重要作用。本研究以青花菜为材料，在克隆BoPR1基因的基础上，利用荧光定量PCR技术研究它们在根肿菌和核盘菌侵染下的表达模式。序列分析结果表明，BoPR1基因组全长为489 bp，无内含子，编码162个氨基酸，具1个信号肽和1个SCP结构域。系统发育分析的结果表明，BoPR1与甘蓝型油菜和白菜的PR1遗传距离最小，亲缘关系最近，在进化树上聚为一组；与醉蝶花PR1遗传距离最大，亲缘关系最远。荧光定量PCR结果显示，BoPR1基因的表达受根肿菌诱导，在接种5 d时的表达量最高，为对照的11.84倍；BoPR1基因的表达则不受核盘菌诱导。Abstract: Pathogenesis-related proteins (PRs) are crucial in the induced systemic disease resistance for plants. Using real-time fluorescence quantitative PCR, this study isolated a gene, designated as BoPR1, frombroccoli to examine its expression patterns after inoculated by pathogens, Plasmodiophora brassicae and Sclerotinia sclerotiorum. A sequence analysis indicated that the full genome DNA of BoPR1 was 489 bp in length encoding 162 amino acids and containing no intron. The deduced protein consisted of a signal peptide and a SCP domain. The results from aphylogenetic analysis showed thatBoPR1 had a minimum genetic distance, clustering on a same clade, with the PR1 proteins from Brassica napus and B. rapa, indicating a close relationship among them. On the other hand, it was remotely related to Tarenaya hassleriana, as the genetic distance between the two PR1swas the greatest among the tested samples. Theq RT-PCR results suggested that the expression of BoPR1 was induced by P. brassicae, with the highest level observed 5 d after inoculationwhich was 11.84-fold of control. But, BoPR1 expression was not affected by S. sclerotiorum. Theobtained isolation and expression information on BoPR1 would be useful for futureresearch on thedisease resistance mechanism as well as the molecular breeding programs on B. oleracea.
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Keywords:
- Brassica oleracea var. italica /
- BoPR1 /
- gene cloning /
- expression analysis
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0. 引言
【研究意义】杉木Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook 是我国南方重要速生用材树种之一，有极高的经济价值[1]。铝元素在地壳中含量丰富，酸沉降加速了土壤酸化进程，土壤中的活性铝浓度升高，同时也导致土壤中钙、镁等盐离子的流失[2]。总体上，植物对铝的耐受生理机制分为外部排斥和内部耐受两大类[3-5]。其中，外部排斥机制是通过诱导细胞分泌有机酸、磷酸盐、酚类等物质至根部与铝螯合，改变铝的化学形态，阻碍铝进入细胞。其主要依靠细胞壁和细胞膜两道屏障；内部耐受机制则是通过细胞内部的有机酸与铝的螯合以及液泡的区室化而将铝隔离，从而缓解铝毒害。因此，有机酸在植物耐铝机制中发挥着重要的作用，探究铝胁迫下杉木有机酸的响应特征对缓解杉木铝毒具有重要意义。【前人研究进展】铝胁迫会抑制柑橘枳砧Poncirus trifoliata（L.）Raf 根系三羧酸循环（TCA），其中丙酮酸、L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸代谢物明显降低[6]。梅映雪[7]的研究也表明铝胁迫使水稻叶片中乙酸与乳酸的含量有所降低，柠檬酸、酒石酸的含量升高；根系中富马酸、柠檬酸含量降低。铝对植物有机酸的分泌有两种应答模式，一种是无延迟的快速释放模式，一种是延迟释放模式，一般细胞信号转导仅需数分钟，而此种延迟时间甚至达数小时以上，这种延迟现象暗示，植物在接受铝刺激到有机酸分泌期间，可能有新的与有机酸代谢有关的转运蛋白的合成[8]。这种现象在玉米（Zea Mays L.）上体现得比较突出，其对铝胁迫反应有明显的滞后期，在铝胁迫数小时后才有明显的柠檬酸分泌[9]。Rangel等[10]研究中也有发现铝胁迫下扁豆Lablab purpureus（Linn.）Sweet 中柠檬酸分泌出现滞后现象。【本研究切入点】目前有机酸响应铝胁迫的研究大多集中在农作物上，而铝胁迫下杉木中有机酸含量的变化尚缺乏系统研究。【拟解决的关键问题】本研究采用高效液相色谱法，通过对杉木幼苗中有机酸的提取、分泌物的收集及分析测定，研究铝胁迫对杉木有机酸含量变化的影响，以期阐明杉木有机酸对铝胁迫的响应特征。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试杉木苗及铝胁迫处理
供试杉木苗为福建省洋口国有林场提供的8～10 cm无性系杉木苗穗条。将穗条泥沙用自来水冲洗干净并置于自来水中驯化3 d，浸泡在生根液（ABT生根粉的0.01%水溶液）中30 min后移植到30 L黑色培养桶中生根60 d左右。挑选生根大小一致、根长10～12 cm的杉木苗进行铝胁迫，每桶8株苗为一个处理，每个处理设置3个生物学重复，采用0.5 mmol·L−1 CaCl2简单营养液进行培养，pH为4.00。铝浓度设置为0、1、3、5 mmol·L−1，以六水氯化铝为试剂配制后加入营养液中。各处理光照时长为12 h·d−1（6:00～18:00），温度为25 ℃，每1.5 h通气20 min，胁迫周期为14 d，每7 d更换一次营养液。胁迫处理结束，从茎顶部（不取新叶）取至离茎底端1/3处的叶片，根的采集为根尖0～4 cm部位，−80 ℃保存待测。
1.1.2 仪器及试剂
超纯水机、电子天平、冷冻离心机、超声波清洗器、溶剂过滤器、液相色谱仪、真空冷冻干燥机、氮吹仪。六水氯化铝、二水氯化钙、乳酸、抗坏血酸、磷酸均为分析纯，购于国药集团；草酸标准溶液购于北京北方伟业研究院；苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸均为色谱纯，购于上海源叶公司；富马酸、乙酸，均为色谱纯，购于Standford公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，购于默克集团；纯净水购于娃哈哈集团。
1.2 铝含量的测定
杉木样品用硝酸-高氯酸[V（HNO3）∶ V（HClO4）=3∶1]进行消解，制备成待测溶液，铝含量采用羊毛铬花青 R 法 [11] 进行测定。
1.3 有机酸含量的测定
1.3.1 标准溶液的制备
分别吸取草酸、柠檬酸、富马酸、乳酸、抗坏血酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸标准溶液，混合后得到有机酸混合标准母液，母液质量浓度分别为19.96 mg·L−1（富马酸、乳酸）、197.60 mg·L−1（草酸）、199.60 mg·L−1（抗坏血酸）、998 mg·L−1（苹果酸、琥珀酸、酒石酸）、1996 mg·L−1（柠檬酸）。稀释2、5、10倍共4个浓度标准溶液以制作标准曲线，获得线性方程（表1）。
表 1 各有机酸的线性范围、回归方程及相关系数Table 1. Linear ranges, regression equations, and correlation coefficients on 6 organic acids有机酸
Organic acids线性范围
Linear range/
（mg·L−1）线性回归方程
Regression
equation相关系数
R2
Correlation草酸 Oxalic acid 19.76～197.60 y=1963.12x+15.23 0.99994 酒石酸 Tartaric acid 99.80～998.00 y=2505.44x−5.58 0.99995 L-苹果酸 L-malate 99.80～998.00 y=1195.33x−3.26 0.99994 抗坏血酸 Ascorbic acid 19.96～199.60 y=2612.34x−8.32 0.99991 乳酸 Latic acid 2.00～19.96 y=2810.59x−3.90 0.99995 柠檬酸 Citric acid 199.60～1996.00 y=2892.76x−2.65 0.99996 琥珀酸 Succinic acid 99.80～998.00 y=855.67x−2.66 0.99994 富马酸 Fumaric acid 2.00～19.96 y=4446.75x−4.36 0.99996 1.3.2 液相色谱条件
采用高效液相色谱法（HPLC）测定有机酸含量。Shim-pack Scepter C18色谱柱（5 µm，4.6 mm×250 mm）；流动相为0.1%磷酸∶乙腈=[V（H3PO4）∶V（C2H3N）=98∶2] ，pH=2.45；柱温35 ℃；进样量20 µL；流动相流速1.0 mL·min−1；检测波长210 nm[12]。流动相上机前需经0.45 µm微孔滤膜过滤。
1.3.3 样品的前处理
准确称取干净的针叶或根0.5 g，置于预冷研钵上，加入2 mL纯净水和少许石英砂，冰浴下研磨成匀浆，转移至10 mL离心管，研钵用1 mL纯净水冲洗3次并转入离心管，总体积为5 mL。在4 ℃条件下5 000 r·min−1离心30 min，取上清液过0.45 µm微孔滤膜，上机测定[13]。
1.3.4 根尖分泌有机酸的收集
将胁迫处理结束后（培养过程同1.1.1）的杉木移出培养桶，根尖用去离子水冲洗干净，吸干水分，将其完全浸没在盛有200 mL 0.5 mmol·L−1 CaCl2溶液中，培养12 h后取出[14]。将收集液分装，经冷冻干燥7 d后的粉末用4 mL纯净水溶解于离心管中，经50 ℃氮吹成粉末，用1 mL纯净水溶解，过0.45 µm微孔滤膜，上机测定。
1.4 数据处理
试验数据采用Excel和SPSS19.0软件对所获数据进行统计分析和相关性分析，采用dobe Illustrator（AI）2020 软件辅助作图。
2. 结果与分析
2.1 有机酸的HPLC测定
图1是在最佳的HPLC条件下所获得的不同溶液中有机酸的色谱图。其中有机酸标准溶液按出峰顺序分别为：草酸、酒石酸、L-苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸。
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图 1 不同有机酸溶液的液相色谱图注：A，有机酸标准溶液；B，杉木针叶提取液；C，杉木根提取液；D，根尖分泌物。Figure 1. Liquid chromatogram of organic acid solutionsNote: A: standard organic acid solutions; B: extract of Chinese fir needles; C: extract of Chinese fir roots; D: exudates from root-tips.2.2 杉木针叶中有机酸种类及其含量变化
由图1-B可知，杉木针叶中可检测到6种有机酸：草酸、酒石酸、L-苹果酸、抗坏血酸、柠檬酸和富马酸，其中抗坏血酸含量最高。
表2是不同铝浓度处理后，杉木针叶中6种有机酸的含量测定结果。从表中可知，杉木针叶内不同有机酸含量随铝胁迫浓度的增加，其变化趋势有所不同，酒石酸、L-苹果酸、抗坏血酸含量呈现先升高后降低的变化趋势，在1 mmol·L−1 铝处理时达到峰值；富马酸含量变化也是先升高后降低，在3 mmol·L−1 铝胁迫时达到峰值；而草酸与柠檬酸含量变化则呈先升高后降低又升高的趋势，总体上，草酸含量呈增加的趋势，而柠檬酸则是呈先升高而后降低的趋势。
表 2 铝胁迫下杉木针叶中有机酸含量的变化Table 2. Changes on organic acids in needles of Chinese fir under Al-stress（单位：g·kg−1） 有机酸
Organic acidCK 1 mmol·L−1 铝胁迫
1 mmol·L−1 Al concentration3 mmol·L−1 铝胁迫
3 mmol·L−1 Al concentration5 mmol·L−1 铝胁迫
5 mmol·L−1 Al concentration草酸 Oxalic acid 0.71±0.03 a 0.89±0.13 a 0.75±0.08 a 0.90±0.17 a 酒石酸 Tartaric acid 1.17±0.12 a 1.27±0.14 a 1.15±0.09 a 1.04±0.08 a L-苹果酸 L-malate 1.21±0.09 c 1.77±0.14 a 1.46±0.07 b 1.23±0.10 c 抗坏血酸 Ascorbic acid 16.23±0.69 ab 17.44±0.90 a 16.35±0.32 ab 15.37±0.69 b 柠檬酸 Citric acid 0.89±0.05 a 1.32±0.39 a 0.79±0.27 a 0.85±0.33 a 富马酸 Fumaric acid 5.84±0.32 c 9.90±1.11 a 10.51±0.76 a 7.59±0.30 b 注：同行数据后同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。
Note: Different lowercase letters in the same line mean significant differences (P＜0.05). The same below.统计分析表明，草酸、酒石酸和柠檬酸的含量在对照组和各处理组之间均无显著性差异；富马酸含量中对照组与各处理组之间存在显著性差异，1 mmol·L−1和3 mmol·L−1 铝胁迫与5 mmol·L−1 铝胁迫也分别存在显著性差异；L-苹果酸含量对照组与低浓度1 mmol·L−1和3 mmol·L−1 铝胁迫存在显著性差异，与5 mmol·L−1 铝胁迫不存在显著性差异，处理组之间均显著差异；抗坏血酸含量在对照组与处理组间无显著性差异，1 mmol·L−1与5 mmol·L−1 铝胁迫间存在显著性差异。
2.3 杉木根中有机酸种类及其含量变化
与针叶相同，杉木根中也检测到6种相同的有机酸：草酸、酒石酸、L-苹果酸、抗坏血酸、柠檬酸和富马酸（见图1-C），其含量测定结果列于表3。从表3可见，这6种有机酸的变化趋势基本保持一致，即随着铝胁迫浓度的增加呈现持续下降的趋势。
表 3 铝胁迫下杉木根中有机酸含量的变化Table 3. Changes on organic acids in roots of Chinese fir under Al-stress（单位：g·kg−1） 有机酸
Organic acidCK 1 mmol·L−1 铝胁迫
1 mmol·L−1 Al concentration3 mmol·L−1 铝胁迫
3 mmol·L−1 Al concentration5 mmol·L−1 铝胁迫
5 mmol·L−1 Al concentration草酸 Oxalic acid 1.88±0.21 a 1.11±0.44 b 0.89±0.13 b 0.61±0.11 b 酒石酸 Tartaric acid 0.29±0.02 a 0.16±0.01 b 0.14±0.01b 0.13±0.03 b L-苹果酸 L-malate 1.82±0.01 a 1.19±0.13 b 0.91±0.41 bc 0.64±0.07 c 抗坏血酸 Ascorbic acid 3.49±0.75 a 1.91±0.19 b 1.57±0.17 b 1.49±0.25 b 柠檬酸 Citric acid 0.82±0.18 a 0.30±0.13 b 0.22±0.01 b 0.12±0.03 b 富马酸 Fumaric acid 9.51±2.36 a 0.88±0.05 b 0.57±0.02 b 0.50±0.02 b 统计分析表明，对照组草酸、酒石酸、抗坏血酸、柠檬酸以及富马酸的含量均显著低于各处理组，而各处理组之间均无显著性差异；L-苹果酸含量对照组与各处理组间差异显著，1 mmol·L−1 铝和5 mmol·L−1 铝胁迫之间也存在显著性差异。
2.4 杉木根尖分泌有机酸种类及其含量变化
在根尖分泌物中检测到的有机酸有4种：草酸、L-苹果酸、抗坏血酸和乳酸（图1-D、表4），且以草酸（71.81～126.57 mg·L−1）为主，L-苹果酸和抗坏血酸分泌量较少（分别为3.54～7.42 mg·L−1和0.52～1.22 mg·L−1），乳酸的分泌量（0.03～0.05 mg·L−1）则极少。从表4可见，铝胁迫后，根中分泌的草酸和L-苹果酸含量均下降；抗坏血酸含量随铝浓度的增加表现为先增加后降低，乳酸含量则先降低后增加，但总体变化量不大。
表 4 铝胁迫对杉木根尖有机酸分泌的影响Table 4. Effects of Al-stress on organic acids secreted from root-tips of Chinese fir（单位：mg·L−1） 有机酸
Organic acidCK 1 mmol·L−1 铝胁迫
1 mmol·L−1 Al concentration3 mmol·L−1 铝胁迫
3 mmol·L−1 Al concentration5 mmol·L−1 铝胁迫
5 mmol·L−1 Al concentration草酸 Oxalic acid 126.57±18.69 a 67.79±18.43 b 85.85±23.15 b 71.81±4.01 b L-苹果酸 L-malate 7.42±3.21 a 4.62±1.41 ab 3.54±0.26 b 5.67±0.60 ab 抗坏血酸 Ascorbic acid 0.52±0.05 b 1.22±0.48 a 0.65±0.22 ab 0.85±0.18 ab 乳酸 Latic acid 0.05±0.02 a 0.03±0.02 a 0.03±0.01 a 0.05±0.02 a 统计分析表明，乳酸含量在对照组与各处理组之间无显著性差异；草酸含量表现为对照组显著高于各处理组，各处理组之间无显著性差异；L-苹果酸含量为对照组显著高于3 mmol·L−1处理组；抗坏血酸含量为对照组显著小于1 mmol·L−1处理组，其余均无显著差异。
2.5 杉木中有机酸、铝含量相关性分析
杉木针叶与根中有机酸、铝含量的相关分析结果如表5所示。除了酒石酸外，杉木针叶中草酸、L-苹果酸、抗坏血酸、柠檬酸和富马酸的含量与针叶铝含量之间呈正相关，其中，富马酸含量与针叶铝含量之间的相关达显著水平。杉木根中所有6种有机酸含量与根铝含量之间均具有显著或极显著负相关，表明铝胁迫下根铝积累对杉木根中有机酸含量的变化有显著影响。除了酒石酸外，针叶和根中对应的有机酸含量之间为负相关，其中富马酸达到了极显著水平，表明针叶与根中的有机酸对铝胁迫的响应并不一致。
表 5 杉木中有机酸、铝含量相关分析结果Table 5. Correlations between organic acids and Al content in Chinese fir有机酸
Organic acid针叶铝
Needle Al根铝
Root Al针叶/根有机酸
Needle organic acid/
root organic acid草酸 Oxalic acid 0.528 −0.666* −0.304 酒石酸 Tartaric acid −0.019 −0.927** 0.021 L-苹果酸 L-malate 0.491 −0.653* −0.145 抗坏血酸 Ascorbic acid 0.091 −0.917** −0.175 柠檬酸 Citric acid 0.238 −0.893** −0.104 富马酸 Fumaric acid 0.818** −0.995** −0.799** 注：*表示显著相关（P＜0.05），**表示极显著相关（P＜0.01）。
Note: * represented significant correlation（P＜0.05），** represented extremely significant correlation (P＜0.01).3. 讨论与结论
有机酸在植物体内担任着十分重要的角色，它不仅参与植物的光合作用和呼吸作用，还可以作为代谢活性溶质，调节植物体内渗透压，平衡植株体内过多的阳离子，以应对非生物胁迫[15]。有机酸在TCA中经线粒体的运转，可转化成CO2和水（即有机酸同化物），并伴随着H+和ATP的消耗与运输[16]。娄成后等[17]研究表明有机物同化物通过维管束从源（根为无机物源，叶为有机物源）向尖端生长部位运输，正常的叶会合成和分泌有机物，衰老的叶会运输出所有的内含物。Ma等[18]研究表明，铝在荞麦根尖中以铝-草酸形式存在，通过木质部向上运输过程中配体与柠檬酸发生交换，即以铝-柠檬酸复合体形式迁移。此外，植物体内有机酸与铝的结合，也是植物抵抗铝胁迫的重要机制之一[15]，因为与有机酸结合的铝，其生物毒性会大大降低。本研究中杉木针叶和根中均检测到6种有机酸。杉木针叶中L-苹果酸和富马酸的含量变化比较明显，在铝胁迫下先升高后降低，说明低浓度的铝促进了杉木叶中有机酸的积累，以抵抗铝胁迫；而高浓度的铝，则使其积累受到了抑制。杉木根中有机酸的含量在各铝胁迫浓度下均降低，则可能与根是最先受到铝毒影响的器官有关。相关分析结果也表明，铝胁迫下杉木根中6种有机酸含量变化与根中铝含量均有显著或极显著的负相关，而与叶中大部分有机酸的含量呈正相关，进一步明确了根部受害与铝毒之间的关系，根部受铝毒的影响比针叶大。
本研究结果表明，杉木组织内含有丰富的抗坏血酸，但铝胁迫时从根尖分泌出的抗坏血酸含量较低，主要以分泌草酸为主，表明杉木可能是通过分泌草酸来响应铝胁迫的。已有的报道表明，在茶树和常绿杨的根中[19-20]，草酸是根系分泌物的主要成分之一，这与本文所获结果类似。实际上，铝胁迫下植物分泌有机酸的种类及其主成分不同，通常以苹果酸、柠檬酸和草酸居多，还可能有酒石酸、琥珀酸、乳酸和乙酸等[21-22]。马士成[19]的研究表明，低浓度铝胁迫可促进茶树根系有机酸的生物合成及其分泌，高铝胁迫下，茶树分泌的草酸则会降低。这种铝胁迫下，有机酸分泌反而降低的情况，也体现在常绿杨树根系分泌的琥珀酸和乳酸上[20]。本文在杉木上的研究结果显示，根尖草酸的分泌也是降低的，这可能与本研究中铝胁迫浓度较高或处理时间较长有关。
综上，在杉木中可检测到草酸、酒石酸、L-苹果酸、抗坏血酸、柠檬酸和富马酸等6种有机酸。低浓度铝胁迫使杉木针叶中L-苹果酸和富马酸的含量显著增加。铝胁迫下，杉木根中所有6种有机酸含量均显著下降，草酸的分泌也减少，表明杉木根部对铝胁迫响应比针叶更敏感，胁迫伤害更明显。
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图 2 BoPR1基因及其编码蛋白序列
注：阴影部分为信号肽；划线部分为SCP结构域。
Figure 2. Sequences of BoPR1 gene and deduced protein
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图 3 BoPR1及其同源序列的比较
Figure 3. Comparison between BoPR1 and counterparts with homologous sequence
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图 4 BoPR1及其同源序列的系统发育树
Figure 4. Phylogenetic tree of BoPR1 and counterparts with homologous sequence
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