Isolation and Identification of Duck Plague Virus and Sequence Analysis on Its UL2 and TK Genes
-
摘要: 2015年,福建省福州地区2个鸭场(M18肉鸭场及蛋鸭场)发生大量鸭死亡,初诊疑似鸭瘟。为明确其病原,分别采集病死鸭肝脏、食道样品进行鸭瘟病毒特异性PCR检测和病毒分离,对获得的2株病毒分离株分别进行鸭已知病原的检测,确定均为鸭瘟病毒。对新分离鉴定的2株鸭瘟病毒株的UL2基因进行序列测定及分析发现,均具有强毒株的分子特征;经TK基因序列测定及分析表明,2株新分离的鸭瘟病毒株与强毒代表株、弱毒疫苗株的TK基因核苷酸同源性均高达98.7%。Abstract: In March 2015, massive deaths happened to the M18 Duck Farm and an egg-laying duck farm in Fuzhou. It was suspected of an outbreak of duck plaque. Samples of liver and esophagus from the dead birds were collected for pathogenic identification using PCR and virus isolation. Two strains with virulent characteristics were thus identified. Subsequently, a sequence analysis on their UL2 genes further confirmed the classification. In addition, the TK gene sequences of the two isolated virus strains showed a nucleotide homology of 98.7% with those of the common virulent strain as well as the vaccine strain.
-
Keywords:
- virulent duck plague virus /
- isolation and identification /
- UL2 gene /
- TK gene /
- sequence analysis
-
鸭瘟(Duck plague),又称鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE),是由鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起的鸭、鹅及其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性、烈性传染病[1]。临床上以成年种鸭和蛋鸭多见,感染鸭主要表现为体温升高、两腿发软、下痢、流泪,部分鸭出现头颈肿胀;剖检病鸭主要特征为食道黏膜出血或溃疡,泄殖腔黏膜出血与坏死,肝脏出血或(和)有坏死点(灶),淋巴器官损伤以及实质性脏器出现退行性病变[1]。
DPV属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属的鸭疱疹病毒1型[2],其基因组为线状双股DNA,全长约为160 kb,主要分为长独特区(UL)、短独特区(US)以及US两端的内部重复序列(IRS)和末端重复序列TR区,其基因组结构为UL-IR-US-TR,共包含约78个开放阅读框(ORFs)[3-4]。该病自1923年被Baudet等首次发现以来,全球多个国家均有报道。我国于1957年在广州首先发现该病[5]。鸭瘟流行广泛、传播迅速、发病率和病死率都很高,曾给世界养鸭业造成较大经济损失。20世纪60年代,随着鸭瘟弱毒疫苗的研制与广泛应用,该病得到有效控制,甚至罕见发生[1, 5]。近些年来,有报道认为鸭瘟病毒对鸭的致病力有所减弱,临床症状不典型,也有不少免疫过鸭瘟弱毒疫苗的鸭群依然发生该病[6-9]。
2015年3月,福建省福州地区2个养鸭场发生疑似鸭瘟的病例,1个为养有近5 000只的18周龄麻鸭场,另一鸭场饲养有近7 500只的9周龄M18肉鸭,其发病率高达75%、病死率高达93%;剖检可见食道黏膜出血、大量纵行黄色假膜覆盖,肝脏局灶性出血,肠道、泄殖腔黏膜出血。为进一步明确其病原,我们采集发病(或病死)鸭肝脏、食道组织样品,采用PCR方法对样品进行检测,经病毒分离鉴定为鸭瘟病毒;进而对新分离病毒的部分基因序列进行分析,以期为新流行鸭瘟的诊断及防控提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
Easy Pure Viral DNA/RNA Kit、Easy Script One-Step RT-PCR Super Mix以及2×Easy Taq PCR Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司;胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)、质粒小量抽提试剂盒(Plasmid Mini KitⅠ)均购自广州飞扬生物工程有限公司;pMD18-T克隆载体、DL2000 DNA Marker、感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司;其余化学试剂为分析纯试剂。
1.2 临床病料的采集与处理
分别采集病死鸭的肝脏、食道样品,剪碎后加入磷酸盐缓冲液研磨成匀浆,以12 000 r·min-1离心10 min,取上清,分别用于PCR检测和病毒分离。同时以2个疫苗公司生产的鸭瘟弱毒冻干疫苗作为对照病毒,分别命名为A公司弱毒疫苗(简称为A)和B公司弱毒疫苗(简称为B),以灭菌生理盐水将冻干疫苗溶解重悬,离心取上清备用。
1.3 临床样品的PCR检测
参照文献[10]合成DPV (UL30~UL31)特异性引物P1和P2,用于检测临床样品是否含鸭瘟病毒。同时,对已知的鸭病毒(鸭流感病毒、鸭1型副粘病毒、鸭坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒、鸭圆环病毒等)及鸭致病性细菌(鸭疫里默氏菌、鸭致病性大肠杆菌、鸭沙门氏菌)引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成,用于检测样品是否含其他病原。
1.4 病毒的分离与鉴定
将1.2所述组织匀浆液用0.22 μm滤器过滤,滤液经尿囊腔接种11日龄鸭胚5枚,每枚接种0.3 mL后于37℃恒温培养,连续观察7 d。将分离的病毒以鸭胚连续传代3次,无菌收集致死鸭胚尿囊液,对所收集尿囊液再次进行PCR或RT-PCR检测,所收集尿囊液于-80℃储存备用。
1.5 UL2基因的扩增、序列测定及分析
参照文献[9]合成引物UL2f/UL2r,分别扩增新分离鸭瘟病毒FZ1501株、FZ1502株的UL2基因,同时以该地区使用的2个公司商品化鸭瘟弱毒疫苗为对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,阳性样品送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件进行序列编辑和ORF预测,获得序列用MEGA5软件进行比对分析。
1.6 TK基因的扩增、序列测定及分析
根据GenBank上已发表的DPV TK基因序列,使用Primer 5.0设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物如下。上游引物:5′-ATG TCA CTG CGC GAC TCT TGC-3′;下游引物:5′-TCA ATT AAT TGT CAT CTC GGT-3′;预期片段大小为1 077 bp。
2. 结果与分析
2.1 临床样品的PCR检测
使用合成的鸭瘟病毒特异性检测引物P1/P2,分别检测2份送检病鸭(M18肉鸭及麻鸭)的肝脏和食道样品。结果显示,待检样品均在预期位置约446 bp处扩增出明显的条带。同时,对所采样品进行鸭的其他病原检测,结果均为阴性(图 1)。
2.2 病毒的分离鉴定
2份病鸭组织匀浆液(麻鸭源及M18肉鸭各取1份)接种鸭胚后48~168 h间可陆续观察到胚死亡,死亡鸭胚可见胚体出血。无菌收集接种48 h后死亡的鸭胚尿囊液,经连续传代3次后收集并测定其血凝活性,结果显示病毒尿囊液均不能凝集SPF鸡红细胞和鸭红细胞,表明所分离病毒无血凝活性;同时PCR检测,结果显示分离的2株病毒均为鸭瘟病毒,其余病原均为阴性(图 2),将该2株病毒分别命名为FJ-1501(麻鸭源)和FJ-1502(M18肉鸭源)。
2.3 UL2基因的扩增、序列测定与分析
使用引物UL2f/UL2r,分别扩增新分离鸭瘟病毒FJ1501株、FJ1502株的UL2基因,同时以2株疫苗弱毒株为对照。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示,2株新分离鸭瘟病毒PCR产物可在约1 311 bp位置出现明显的目的条带;而2个公司鸭瘟弱毒疫苗PCR检测产物可在约783 bp位置出现目的条带,上述样品PCR产物与预期大小相符(图 3)。
PCR样品经序列测定后分别用DNAstar软件进行分析,并对UL2基因核酸序列的同源性进行了比对。结果显示,2株新分离鸭瘟病毒(FJ-1501株、FJ-1502株)与强毒2085株、CHv株、CV株同源性最高,核苷酸同源性为99.6%~99.9%。2株新分离鸭瘟病毒与VAC株、C-KCE株、A公司鸭瘟弱毒疫苗(A)、B公司鸭瘟弱毒疫苗(B)差异显著,核苷酸同源性为89.6%~89.9%;2株新分离鸭瘟病毒间核苷酸同源性为99.6%;弱毒株与强毒株相比,均在UL2基因区域发生了1个528 bp的基因片段缺失。遗传进化分析显示,鸭瘟强毒株与弱毒株在遗传进化上处于2个独立的分支,2株分离毒株均与强毒株处于同一个分支,而A、B公司鸭瘟弱毒疫苗株与弱毒株均处于同一个分支(图 4)。
2.4 TK基因的扩增、序列测定与分析
使用引物TKf/TKr,分别扩增新分离鸭瘟病毒FJ-1501株、FJ-1502株以及A、B公司鸭瘟弱毒疫苗株的TK基因,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示,2株新分离鸭瘟病毒和A、B公司鸭瘟弱毒疫苗株PCR产物均可在约1 077 bp位置出现明显的目的条带,与预期相符(图 5)。
PCR产物经序列测定后进行编辑及比对,结果显示,2株新分离鸭瘟病毒(FJ-1501株、FJ-1502株)及A、B公司鸭瘟弱毒疫苗株TK基因全长均为1 077 bp。2株新分离的鸭瘟病毒株与强毒株(2 085株、CHv株、CV株)、弱毒株(VAC株、C-KCE株与A、B公司鸭瘟弱毒疫苗株)核苷酸同源性在98.7%以上;2株新分离鸭瘟病毒间TK基因核苷酸同源性为98.6%(图 6)。
3. 讨论与结论
有报道认为,鸭瘟病毒感染鸭的病死率及临床剖检病变因毒力、宿主、日龄等的不同而存在差异[1]。近年来,随着临床上“非典型”鸭瘟病变及鸭瘟疫苗免疫失败病例的发生,使鸭瘟的防控变得更为复杂。本次病例主要表现为食道黏膜出血、纵行黄色假膜覆盖,肠道环状出血带、泄殖腔黏膜出血,但鸭瘟的其他病变(如眼睑水肿、肝脏表面坏死、腺胃与肌胃等的病变等)在本次病例中并未发现,经病原检测及病毒分离鉴定结果显示,所分离病毒为鸭瘟病毒。因此,在临床中对于鸭瘟的诊断,应根据其特征病变并结合实验室检测,才能防止误诊。
对新分离鸭瘟病毒的UL2基因进行分析,结果显示2株新分离毒与强毒2 085株、CHv株、CV株均有较高的同源性,而鸭瘟疫苗株VAC株、C-KCE株及该地区使用的两个公司的鸭瘟弱毒疫苗株则处于另一分支,且与弱毒株相比,新分离毒株在UL2基因区域有插入528 bp大小的基因片段,与已报道的强毒株分子特征相符[3],表明新分离的2株DPV均为鸭瘟病毒强毒株。而2株新分离鸭瘟病毒间核苷酸同源性高达99.6%,表明新分离的2株鸭瘟病毒尽管宿主来源不同,但其在UL2基因上高度同源。
鸭瘟病毒基因组庞大,其中TK基因是疱疹病毒的主要毒力基因,其编码的病毒非结构蛋白-胸苷激酶(Thymidine Kinase, TK)参与病毒DNA的合成,在神经组织感染及潜伏性感染中具有重要作用。前期研究表明,我国不同地区分离的鸭瘟病毒株或不同强弱毒株的TK基因序列均具有较高的同源性[11-14]。为此,本研究根据已发表的TK基因序列,设计引物分别扩增新分离鸭瘟病毒FJ-1501株、FJ-1502株及A、B公司鸭瘟弱毒疫苗株的TK基因,并对其进行序列测定及分析。结果显示,2株新分离鸭瘟病毒及两个公司弱毒疫苗株TK基因全长均为1 077 bp。经序列比对分析显示2株新分离鸭瘟病毒株与强毒(2 085株、CHv株、CV株)及弱毒(VAC株、C-KCE株、A公司鸭瘟弱毒疫苗株、B公司鸭瘟弱毒疫苗株)核苷酸同源性均在98.7%以上,初步表明新分离的2株鸭瘟强毒株与鸭瘟强毒代表株在TK基因上高度同源,但对于其抗原性及致病性是否存在差异,有待进一步研究确定。
本研究自福建省福州地区2个鸭场(蛋鸭场和M18肉鸭场)发生严重病死的鸭脏器中均分离到鸭瘟强毒,这是福建省于1998年发生鸭瘟病例报道[15]后的新发病例,其发生原因有待进一步探究。
-
-
[1] SAIF Y M.禽病学[M].苏敬良, 高福, 索勋, 译. 12版.北京:中国农业出版社, 2012:444-454. [2] DAVISON A J, EBERLE R, EHLERS B, et al. The order Herpesvirales[J]. Arch Virol, 2009, 154(1):171-177. DOI: 10.1007/s00705-008-0278-4
[3] WANG J, HOPER D, BEER M, et al. Complete genome sequence of virulent duck enteritis virus (DEV) strain 2085 and comparison with genome sequences of virulent and attenuated DEV strains[J]. Virus Res, 2011, 160(1-2):316-325. DOI: 10.1016/j.virusres.2011.07.004
[4] LI Y, HUANG B, MA X, et al. Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus[J]. Virology, 2009, 391(2):151-161. DOI: 10.1016/j.virol.2009.06.018
[5] 黄引贤, 欧守杼, 邝荣禄, 等.鸭瘟病毒的研究[J].华南农学院学报, 1980, (1):21-36. [6] 孟刚, 王经满, 曹瑞兵. 2株鸭瘟病毒强毒株的分离鉴定[J].畜牧与兽医, 2012, (4):59-62. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XMYS201204019.htm [7] 吕桂霞. "新型鸭瘟"流行病学及病原特性的研究[D].泰安:山东农业大学, 2003. [8] 魏笑笑, 高亚东, 刘志杰, 等.一株鸭瘟病毒(GM株)的分离与鉴定[J].中国家禽, 2015, (6):63-65. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGJQ201506020.htm [9] 姜甜甜, 张大丙.鸭瘟强毒与疫苗毒的囊膜糖蛋白序列比较[J].中国兽医杂志, 2013, (2):3-7. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZSYZ201302002.htm [10] 孟日增, 石建平, 肖成蕊, 等.鸭瘟病毒PCR检测方法的建立及验证[J].中国生物制品学杂志, 2009, (7):709-712. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SWZP200907029.htm [11] 董嘉文, 黄永亮, 牛学锋, 等.鸭瘟病毒GD株TK、dUTPase和PK基因的克隆及序列分析[J].动物医学进展, 2010, (5):53-57. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-DYJZ201005014.htm [12] 余爱花, 杨阳, 张宝来, 等.鸭瘟病毒YZH株的分离鉴定及其TK基因的序列分析[J].动物医学进展, 2012, (12):133-137. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-DYJZ201212032.htm [13] 李昌主, 韩先杰, 邹玲, 等.鸭瘟病毒AV1221株TK基因的克隆与序列分析[J].青岛农业大学学报:自然科学版, 2007, (3):162-164. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-LYXI200703002.htm [14] 张馨月, 张存, 冉多良.鸭瘟病毒强弱毒株TK基因的克隆及序列比较分析[J].新疆农业大学学报, 2007, (4):29-33. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XJNY200704005.htm [15] 李文杨, 程龙飞, 黄瑜.某北京鸭场暴发鸭瘟的诊断与控制[J].中国家禽, 1998, (9):47-49. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGJQ809.031.htm -
期刊类型引用(12)
1. 叶玮. 福州地区鸭病毒性肠炎的血清学调查与分析. 现代牧业. 2024(01): 28-31 . 百度学术 2. 莫建新,廖炳次. 一例蛋鸭群疑似鸭瘟的诊治报告. 广西畜牧兽医. 2023(04): 174-175 . 百度学术 3. 张瑞,刘荣昌,陈长福,黄瑜,程龙飞,傅光华,施少华,陈红梅,万春和,傅秋玲. 一例半番鸭感染鸭瘟的病原分离鉴定及病理组织学观察. 福建农业学报. 2021(03): 312-318 . 本站查看 4. 林晓英. 福建罗源县一起鸭瘟病例的诊治体会. 中国动物保健. 2021(09): 117-118+120 . 百度学术 5. 张红丽,黄靖,刘霞,吴赟竑,冯肖肖,吴雪军,徐辉. 鸭瘟病毒ZJ2016强毒株部分基因序列的测定与分析. 浙江农业学报. 2020(02): 226-233 . 百度学术 6. 岳稳,傅光华,黄瑜. 一起麻鸭鸭瘟的诊断与紧急处理. 福建畜牧兽医. 2020(03): 70-71 . 百度学术 7. 万春和,刘荣昌,陈翠腾,程龙飞,傅光华,施少华,陈红梅,傅秋玲,黄瑜. 鸭肠炎病毒强毒和疫苗弱毒鉴别诊断PCR方法的建立. 福建农业学报. 2018(03): 219-224 . 本站查看 8. 贺欣薇,苟万里,张明洋,周碧君,程振涛,文明. 蛋白激酶C抑制剂及激活剂对鸭肠炎病毒增殖的影响. 中国畜牧兽医. 2018(07): 2001-2007 . 百度学术 9. 傅光华,陈翠腾,刘荣昌,卢立志,施少华,江斌,傅秋玲,程龙飞,沈军达,田勇,万春和,陈红梅,黄瑜. 鸭瘟病毒新近分离毒株部分基因变异分析. 畜牧兽医学报. 2018(10): 2215-2222 . 百度学术 10. 张蕊,傅光华,傅秋玲,施少华,程龙飞,万春和,刘荣昌,陈红梅,梅景良,黄瑜. 一株樱桃谷种鸭胚源鸭3型星状病毒分离鉴定与序列分析. 中国家禽. 2018(21): 66-68 . 百度学术 11. 万春和,刘荣昌,陈翠腾,程龙飞,施少华,傅光华,陈红梅,傅秋玲,黄瑜. 鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立. 福建农林大学学报(自然科学版). 2018(06): 722-728 . 百度学术 12. 康志金. 一起半番鸭感染鸭瘟的诊治报告. 福建畜牧兽医. 2017(05): 53-54 . 百度学术 其他类型引用(4)