0.   引言

【研究意义】双孢蘑菇Agaricus bisporus又名蘑菇、白蘑菇、洋蘑菇等，属于担子菌门、担子菌纲、伞菌科、伞菌目、蘑菇属，是一种世界性栽培和消费的食药用菌^[1-4]。闽南地区是国内双孢蘑菇生产的主产区^[5]，截至目前当地双孢蘑菇栽培仍以农户个体式的季节性生产为主，栽培菌株包括As2796、W192、福蘑38等，均是福建省农业科学院食用菌研究所选育品种；2010年前后陆续有人尝试利用空调等温控措施反季节栽培双孢蘑菇，目前工厂化生产双孢蘑菇运行较好的企业包括福建金明食品有限公司、漳州市新发生物科技有限公司、漳州市九冬蘑菇产业园等，栽培菌株几乎都是W192。尤其对工厂化生产企业，生产品种单一存在一定经营风险。未来双孢蘑菇生产的发展趋势必然是工厂化周年生产。随着市场的发展，对多样化、高品质的双孢蘑菇需求日益旺盛，亟需更多优良的双孢蘑菇品种。杂交育种是现代食用菌育种的常规手段, 也是目前较有效的育种方法^[6-9]。杂交育种成功一个非常重要的关键因素是选择合适的亲本^[10-13]。因此，收集拟用于育种的双孢蘑菇品种，评价其生物学性状，分析其遗传背景，可为后期的杂交育种亲本筛选提供依据。【前人研究进展】拮抗反应是体细胞不亲和性的具体表现^[14]，可用于食用菌遗传特异性的鉴定，日本的食用菌品种登记制度也将其列为一个重要指标^[15]。通过拮抗反应判断菌株间的亲缘关系，操作方便，结果也较直观、易辨认，但也存在一些缺陷，如不容易区分遗传背景近似的菌株^[16-17]，而且观察拮抗线时存在主观因素，因此鉴定菌株时采用拮抗反应需结合分子标记等方法。近年来，已陆续有学者利用分子标记技术对双孢蘑菇种质资源进行分类鉴定、辅助育种。王翠等^[18]通过SRAP等3种分子标记，结合农艺性状的表型，表明特定标记与双孢蘑菇产、质量性状具有明显的关联性。林媛等^[19]利用RAPD标记对40个双孢蘑菇品种进行亲缘关系鉴定，王金斌等^[20]采用SSR分子标记鉴定了双孢蘑菇栽培菌株，王新新等^[21]采用SSR标记对国内外不同来源的双孢蘑菇种质建立了分子身份证，顾敏等^[22]对31份As2796的单孢分离株和8份代表性双孢蘑菇栽培菌株进行遗传多样性研究。【本研究切入点】闽南地区双孢蘑菇栽培菌株较单一，本研究以不同途径引进的9个双孢蘑菇菌株为试验材料，利用体细胞不亲和性试验和SSR分子标记对其进行亲缘关系的探讨，旨在为进一步收集保护双孢蘑菇种质资源、杂交亲本选择等提供理论依据和技术支撑。【拟解决的关键问题】本研究采用体细胞不亲和性试验和SSR分子标记相结合对收集的9个双孢蘑菇菌株进行鉴定与分析，以期更准确更科学鉴定收集的双孢蘑菇菌株，明确其亲缘关系，为后续的杂交育种亲本选择等研究工作奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

供试双孢蘑菇菌株具体见表1。

表  1  供试的双孢蘑菇菌株编号

Table  1.  Sample codes for A. bisporus germplasms

编号 No.	菌株名称 Strain	来源 Origin
1	As2796	漳州市农科所
2	W2000	福建省农科院
3	W192	福建省农科院
4	福蘑38	福建省农科院
5	福蘑52	福建省农科院
6	福蘑58	福建省农科院
7	901	制种户
8	A15	制种户
9	HK	香港

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1.2   试验试剂

DNA提取试剂盒、琼脂糖H、SSR引物等由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；6×DNA Loading Dye、DNA Ladder Mix（100-3000 bp）、POP-7^TM Polymer、HiDiFormamide等购自ThermoFisher。

1.3   供试培养基

100 g马铃薯+60 g双孢蘑菇二次发酵晒干草粪料+20 g葡萄糖+18 g琼脂。

1.4   试验方法

1.4.1   培养基制作

将草粪料和去皮、切块的马铃薯分别放入锅中，分别加水0.5 L，在加热器上加热至沸腾，维持约20~30 min，用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤液待用；将2种滤液混合，小火加热，逐步加入糖和琼脂，混匀，水补足至1 L，分装，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.4.2   体细胞不亲和性试验

体细胞不亲和性试验参考文献[14]的方法进行。

1.4.3   供试菌株DNA提取

采用Ezup 柱式真菌基因组DNA抽屉试剂盒提取DNA。

1.4.4   PCR反应体系与条件

参考文献[21-23]，选用12个SSR引物对供试菌株进行扩增。引物信息具体见表2，PCR反应体系组成：10 mmol·L⁻¹ dNTPs 0.4 μL，5 U Taq酶0.3 μL，100 ng DNA 1.0 μL，10 μmol·L⁻¹的上、下游引物各 1 μL，Taq Buffer（含MgCl₂）2.5 μL，加ddH₂O 至 25 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min：94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共10个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃ 保存。

表  2  供试菌株鉴定所用SSR引物

Table  2.  SSR primers for variety identification

引物名 Primer	序列（5′ to 3′）　　 Sequence（5′ to 3′）	5′端修饰 5′end modification	重复基序 Repeat motifs	片段大小/bp Fragment size	退火温度/℃ Annealing temperature
AbSSR005-F	CTCTGGGATATGGACGAGGA	5′6-FAM	（GATGAG）6	118	56
AbSSR013-F	GACTGCCTGATTGACGGATT	5′HEX	（TA）6	162	57
AbSSR015-F	CTCGAGTCGACGAAGGAAAC	5′HEX	（GA）7	238	58
AbSSR016-F	TGTCTGGTTTTGCTCACGTC	5′HEX	（TC）12	242	55
AbSSR018-F	TGGCTCTTTACAGCCTTGGT	5′6-FAM	（CAT）6	122	55
AbSSR084-F	CGACCCATCATCAACTTCCT	5′HEX	（GAA）6	234	59
AbSSR6-F	ACCACATTCTGGAAAACGAA	5′HEX	（GCT）8	181	55
AbSSR36-F	CGTTGATGGAGTTCACTGAG	5′HEX	（GAAG）4（GAAAAG）（GAAG）	148	58
L11-F	ATAAAAAAGCATAATCACAAATG	5′6-FAM	（TC）13	228	50
L15-F	GCAGGTCCAGTGTGAACGG	5′6-FAM	（TCC）8	192	57
L17-F	ATCCAATTCACCAACCAGC	5′6-FAM	（A）11gagaataagaaattgaaaattg（A）16	186	52
L23-F	CTTTTCAGGGGAAGACAACG	5′6-FAM	（GTG）7	174	55

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1.4.5   电泳检测和 STR检测

将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（2 μL样品+6 μL溴酚蓝），300 V电压下12 min，获取鉴定胶图，通过胶图确定模板浓度，加水稀释到毛细管电泳所需浓度，按照相关流程进行STR检测。

1.5   数据分析

体细胞不亲和性试验结果的判断参照NY/T1845-2010。使用Gene mapper4.1软件分析SSR数据，用MVSP软件进行聚类分析，并形成供试菌株的遗传聚类图。

2.   结果与分析

2.1   供试菌株的体细胞不亲和性分析

供试菌株间的拮抗反应存在一定差异，如图1所示。福蘑52、901、As2796等3个菌株间的拮抗反应明显，表现为菌丝隆起。W192和W2000无拮抗反应，这2个菌株与福蘑52拮抗反应明显，表现为拮抗线。福蘑58和W2000无拮抗反应，这2个菌株与901拮抗反应明显，表现为沟状。

图  1  供试菌株拮抗类型

注：І-拮抗线图谱，ІІ- 沟状拮抗图谱，ІІІ-隆起拮抗图谱

Figure  1.  Types of antagonistic germplasms

Note: І-Uplift antagonistic map; ІІ-Antagonistic line map; ІІІ-Groove antagonistic map.

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根据体细胞不亲和性试验结果，拮抗反应具体结果见表3。可以看出，901与A15之间没有拮抗线，但与其他菌株均存在较明显的拮抗线，分为一组；HK、福蘑52两两之间及与其他菌株之间均有较明显拮抗反应，这2个菌株的亲缘关系可能较远，HK分为一组，福蘑52分为另外一组；W192、W2000、As2796、福蘑58两两之间没有明显拮抗线，初步认为这些菌株之间亲缘关系较近，分为一组；As2796与W192等没有明显拮抗线，但菌丝明显不同，单独分为一组。因此，通过体细胞不亲和性试验可以初步将供试菌株分成 5 组。

表  3  供试菌株间的拮抗反应情况

Table  3.  Antagonistic reactions among tested germplasms

菌株 Strain	As2796 As2796	W2000 W2000	W19 2W192	福蘑38 Fomo 38	福蘑52 Fomo 52	福蘑58 Fomo 58	901	A15	HK
As2796 As2796	−
W2000 W2000	−	−
W192 W192	−	−	−
福蘑38 Fomo 38	−	−	−	−
福蘑52 Fomo 52	+	+	+	+	−
福蘑58 Fomo 58	−	−	+	−	+	−
901	+	+	+	+	+	+	−
A15	+	+	+	+	+	+	−	−
HK	+	+	+	+	+	+	+	+	−
注：‘+’表示有拮抗性；‘−’表示无拮抗 Note: + presence of antagonism; − absence of antagonism.

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2.2   供试菌株遗传相似系数分析

遗传相似系数是表示群体或个体间相似程度的度量值，相似系数越大，样本的遗传关系越近，反之则越远。本研究结果表明，9个供试菌株的遗传相似系数变幅较大（0.432～0.905），平均值为0.6721；其中W192与福蘑38、W2000遗传相似系数最大，表明这3个菌株在这9个引进菌株群体中的亲缘关系最近；而W192与901遗传相似系数最小，表明这两个菌株的亲缘关系最远。W192、W2000、福蘑58、福蘑38、As2796之间的遗传相似系数均≥0.8，远大于平均值，表明这几个菌株间的亲缘关系较近；从遗传相似系数数值分布可以看出（表4），遗传相似系数≥0.9占比8.3%，遗传相似系数≤0.5占比11.1%，遗传相似系数0.8～0.89、0.7-0.79、0.6-0.69、0.5-0.59占比各约20%，表明这9个菌株间具有一定的遗传多样性，遗传丰富度较高。

表  4  相似性系数

Table  4.  List of similarity coefficients

菌株 Strain	福蘑38 Fomo 38	福蘑52 Fomo 52	福蘑58 Fomo 58	901	A15	As2796	HK	W192	W2000
福蘑38 Fomo 38	1
福蘑52 Fomo 52	0.615	1
福蘑58 Fomo 58	0.9	0.595	1
901	0.541	0.588	0.629	1
A15	0.462	0.722	0.486	0.765	1
As2796	0.821	0.667	0.865	0.529	0.556	1
HK	0.526	0.686	0.5	0.667	0.743	0.571	1
W192	0.905	0.718	0.8	0.432	0.564	0.821	0.632	1
W2000	0.81	0.769	0.8	0.486	0.615	0.821	0.684	0.905	1

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2.3   亲缘关系分析

如图2所示，结合相似性系数矩阵表，以相似性系数0.76为阈值，可将供试菌株分成4个类群，第一类群只有一个样本HK；第二类群有2个样本A15与901；第三类群只有一个样本福蘑52；第四类群最多，有5个样本，其中W2000，W192和福蘑38在相似性为86%的地方聚为一类，其中W192和福蘑38的相似性有91%；样本AS2796和福蘑58相似性只有87%。

图  2  供试双孢蘑菇菌株SSR分子标记聚类图

Figure  2.  SSR-based dendrogram of A. bisporus germplasms

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3.   讨论与结论

形态标记是人们最早利用的遗传标记类型^[24]。但对食用菌等大型真菌而言，其子实体表型受外部环境因素影响大，因此单纯借助形态学指标区分菌株间亲缘关系难度较大。通过体细胞不亲和性试验可以初步判断菌株间的亲缘关系。本试验的拮抗反应较明显，如HK、福蘑52两两之间及与其他菌株之间的拮抗反应均较明显，说明这2个菌株的亲缘关系较远；As2796、W192、W2000、As2796、福蘑58两两之间没有拮抗反应，说明这些菌株之间的亲缘关系较近；901与A15两个菌株均由国外育种公司选育而成，相互没有拮抗反应，二者亲缘关系可能较近，但与其他菌株之间的拮抗反应均较明显，表明这2个菌株与其他供试菌株的亲缘关系较远，这与菌种来源是相符的。

DNA分子标记目前已广泛用于食用菌品种鉴定^{[15-16，18-22]}。SSR具有等位变异高、共显性、简便、快速、稳定的特点^[25]。SSR技术在农作物品种鉴定、遗传多样性分析、辅助分子育种等方面得到大量应用^[20-28]。本研究结合相似性系数矩阵表，以相似性系数0.76为阈值，可将供试菌株分成4个类群，表明这9个双孢蘑菇菌株具有一定的遗传多样性与遗传丰富度。

有研究报道体细胞不亲和性试验的分类结果与分子标记聚类分析的结果基本相同。唐传红等的^[16]利用拮抗试验和RAPD分子标记技术分析了供试菌株的亲缘关系，结果表明2种方法的鉴定结论是一致。杏鲍菇^[29]，黑木耳^[30-31]等的研究结果也佐证了这一结论。但杨和川等^[15]对29个金针菇进行遗传多样性分析结果表明，大部分拮抗对峙试验结果与聚类分析结果一致，也存在不一致的。因此采用多种鉴定方法对供试菌株进行综合分析，可以得出更准确结论。本研究综合体细胞不亲和性试验和SSR分子标记技术两种方法对供试的9个双孢蘑菇菌株进行鉴定分析，结果表明两种方法所得到的结果基本一致。如HK与其他供试菌株均存在明显拮抗线，SSR分子标记聚类结果也显示HK与其他菌株平均相似系数仅为0.626，单独聚为一类；A15和901二者之间不存在拮抗反应，而与其他供试菌株均存在不同程度的拮抗反应，聚类分析结果显示A15和901相似系数为0.765，与其他菌株平均相似系数分别为0.614和0.579，这两个菌株遗传背景相近，而与其他供试菌株亲缘关系较远。

不同DNA分子标记方法的开发原理是有一定区别的，有时不同分子标记方法的聚类分析结果会存在一定的差异。杨军^[32]综合ISSR和RAPD两种分子标记鉴定分析供试灰树花菌株，结果表明利用2种分子标记比单独使用分子标记鉴定的结果更准确。本研究是综合拮抗反应试验的分类结果与分子标记聚类分析的结果，可以考虑进一步采用其他分子标记验证本试验结果。