0.   引言

【研究意义】中国有盐碱地约1亿hm²，低洼盐碱水域约0.46亿hm²，咸水湖约占湖泊总面积的55%^[1]，宁夏地区盐碱地面积为14.79万hm^2[2]。这类水体具有高盐碱度、高离子系数和离子比例失衡等特点，对水生动物的生长、发育、生理代谢和组织功能等方面具有较大影响，使得多数水生动物无法在其中长时间生存，导致大量盐碱水资源长期处于未被利用的状态^[3]。盐度是水环境中重要的环境因子，其变化会引起鱼类应激反应，导致鱼体耗氧增加、代谢加速、能量消耗增多^[4]，表现为繁殖受限、生长发育迟缓和存活率下降等^[5−7]。此外，长期处于低盐度或高盐度胁迫下的鱼类，会造成鱼体氧化损伤，降低鱼体的免疫能力，更容易感染疾病，严重甚至可导致死亡^[8]。开展鱼类盐碱耐受性相关研究，选育耐盐碱鱼类新品种，对破解“以渔治碱降盐”盐碱地综合开发利用中面临的种业“卡脖子”问题具有重要意义。【前人研究进展】随着全球水产养殖业的快速发展，盐度适应性养殖成为提高养殖效益和资源利用率的重要方向。目前关于鱼类的毒性研究较多，常采用单因子静态急性毒性试验法，如盐度对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）^{[9, 10]}、扁吻鱼（Aspiorhynchuslaticeps）^[11]、鲤鱼（Cyprinus carpio）^{[12, 13]}、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）和硬头鳟（O. mykiss）^[14]等鱼类生存、生长、抗氧化能力和行为学的影响。关于鱼类盐度耐受性的研究也较为广泛，尤其近年来淡水匮乏，内陆水域盐碱加剧，极大威胁特有鱼类的生存，张惠等^[15]以大黄鱼（Larimichthys crocea）为研究对象，发现可以通过提高大黄鱼抗氧化和非特异性免疫能力来缓解盐度胁迫所带来的氧化损伤，从而改善大黄鱼的盐度耐受性。武鹏飞^[16]对黑龙江泥鳅（Misgurnus mohoity Dybowsky）、大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus Sauvage）、达里湖高原鳅（Triplophysa dalaica）的盐碱耐受能力进行比较研究，发现黑龙江泥鳅对盐适应较强，达里湖高原鳅对碱适应性较强。兰州鲇（Silurus lanzhouensis）作为“黄河水生生物名片”，又名“黄河鲇”，以味道鲜美、肉多刺少、肉质细嫩而著称，具有很高的营养价值和渔业经济价值，素有“黄河鲇鱼活人参”之美称^[17−18]。兰州鲇主要分布在黄河中上游地区，该区域作为我国五大盐碱分布区之一，具有盐碱地分布广泛、盐分含量高、土壤盐渍化严重的特点，且生态环境极度脆弱^[19]。在鱼类种质资源相对匮乏的黄河流域，兰州鲇是一种难得的具有很大开发利用潜力的地方特色鱼类种质资源^[20]。但由于历史上水体污染、过度捕捞、水利工程建设等因素，影响兰州鲇的洄游性产卵，其野生种群日趋衰退，被列入《中国物种红色名录》^[21]。【本研究切入点】目前，关于兰州鲇的研究主要集中在生物学特征^[22]、人工繁殖^{[23, 24]}、基因克隆^[25]等方面，对鲇科（Siluridea）鱼类盐度胁迫的相关研究报道尚属空白。【拟解决的关键问题】本研究通过急性毒性试验，探究不同盐度下兰州鲇幼鱼的存活率、行为变化及生理变化，旨在揭示兰州鲇对盐度耐受与适应的响应机制，以期为黄河中上游盐碱水域资源利用及抗逆品种选育提供关键数据支撑。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验鱼为宁夏水产研究所2024年5月人工繁殖的兰州鲇幼鱼，随机挑选体质健壮、规格整齐、体表无伤的全同胞幼鱼300尾，全长（8.8±1.1）cm，体质量（4.3±1.4）g。试验鱼在室内圆形循环水养殖缸（直径2 m，水深1 m）中暂养，每日早、中、晚各定量投喂试验鱼体重1%的丰年虫，24 h连续不间断充氧，试验开始前禁食24 h。试验用水为充分曝气的自来水，溶解氧（8.7±0.2） mg·L⁻¹，温度（23.1±0.8） ℃。不同盐度用水采用分析纯NaCl（天津市光复科技发展有限公司）配制，溶解充分混匀并静置稳定24 h后，采用盐度计（上海海恒机电仪表股份有限公司）测定水体盐度。

1.2   试验设计

采用96 h静水试验法对兰州鲇幼鱼进行急性盐度胁迫预试验，确定24 h未见死亡时的最大盐度为8.81‰，全部死亡时的最小盐度为13‰。根据预试验结果，按照等对数间距法设置对照组和5个浓度梯度处理组（0、8.81‰、9.71‰、10.70‰、11.80‰和13.00‰），计算半致死浓度和安全浓度。正式试验设置10‰和对照组，每组3个重复，每个重复中随机放入20尾兰州鲇幼鱼，以96 h LC₅₀为胁迫组，以试验起始前（0 h）为对照组，开展96 h盐度胁迫试验，分析其组织病理变化及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性及丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量的变化。养殖缸为白色硬质塑料箱（80 cm×60 cm×40 cm），每个养殖缸注水150 L，24 h不间断曝气维持溶解氧在8 mg·L⁻¹以上，日换水量为总体积的1/3。每日测定水温、溶解氧和盐度1次，每8 h观察统计1次兰州鲇幼鱼存活情况，及时捞出死亡个体并记录。分别于胁迫24、48、72、96 h时随机采集各养殖缸5尾试验鱼，经MS-222麻醉后，用灭菌的剪刀和镊子快速解剖采集鳃、肝脏和肾组织，分别经多聚甲醛溶液固定、常温保存以进行组织学切片观察；经液氮速冻、−80 ℃冰箱保存以进行酶活性等指标测定。

1.3   指标测定

1.3.1   组织学观察

固定24 h以上的组织经修切平整后，进行脱水、浸蜡和包埋处理：75%酒精4 h，85%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精 1 h，无水乙醇 I 30 min，无水乙醇 II 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯 I 5～10 min，二甲苯 II 5～10 min，65 ℃融化石蜡 I 1 h，65 ℃融化石蜡 II 1 h， 65 ℃融化石蜡 III 1 h，利用包埋机进行包埋处理。固定包埋好的组织样本经常规石蜡切片、H.E染色，显微观察并拍照（10×40）。

1.3.2   酶活性测定

准确称取解冻后组织质量，按质量（g）∶体积（mL）为1∶9的比例加入0.9%生理盐水，进行组织冰浴研磨，组织匀浆经4000 r·min⁻¹离心10 min，取上清液–20 ℃保存用于酶活性测定。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定用WST-1法^[26]；过氧化氢酶（CAT）测定用钼酸铵法^[27]；丙二醛（MDA）测定用硫代巴比妥酸（thibabituric acid, TBA）法^[28]；乳酸脱氢酶（LDH）测定用比色法^[29]。总蛋白采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，具体操作均按南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行。

1.3.3   指标计算

盐度胁迫兰州鲇幼鱼的半致死浓度（LC₅₀）采用改良寇氏法^[30]计算，计算公式如下：

式中，X_m为最高浓度对数；d为浓度对数差；P_i为死亡率；n为试验动物数；SD为标准差。

安全浓度SC参照顾兵等^[30]的方法计算：

1.4   数据处理

数据采用Excel 2021和SPSS 27.0进行统计与分析，用GraphPad Prism 8.0.2绘制图表。数据结果采用平均值±标准差（mean±SD）表示，统计分析采用SPSS 27.0软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比较采用Duncan氏法。

2.   结果与分析

2.1   盐度胁迫对兰州鲇行为及存活率的影响

不同盐度浓度胁迫下，兰州鲇表现有所不同。对照组中兰州鲇行为正常，但在盐度胁迫组中，兰州鲇表现为焦躁不安，鳃盖活动加快，游动速度加快，以上症状随盐度的增加而加强。随胁迫时间延长，兰州鲇体色发白，游动迟缓，活动减弱，多数幼鱼侧卧箱底部。幼鱼死亡率均随盐度的增加、时间的延长而升高，且超过盐度10.7‰后，幼鱼出现快速死亡的现象。本试验中兰州鲇在盐度8.81‰时存活率与对照组相比无显著差异（P＞0.05）；在盐度10.7‰胁迫初期（24 h）未出现死亡情况，但表现出应激与异常活动频次加大，随胁迫时间持续延长10.7‰组出现死亡情况；在盐度为11.8‰胁迫24 h时死亡率为23.33%，96 h时死亡率为100%。按照寇氏法分别计算盐度胁迫对兰州鲇幼鱼24、48、72、96 h时半致死浓度，分别为12.71‰、12.11‰、11.49‰和10.88‰，安全浓度为3.46‰（表1）。

表  1  不同盐度处理兰州鲇死亡率

Table  1.  Mortality of S. lanzhouensis raised in water of varied salinities

盐度 Salinity/‰	死亡率 Mortality/%
	24 h	48 h	72 h	96 h
0.00	0	0	0	0
8.81	0	0	0	0
9.71	0b	0b	0b	10.00±0.00a
10.70	0d	3.33±3.33c	13.33±3.33b	23.33±3.33a
11.80	23.33±3.33d	43.33±3.33c	66.67±3.33b	100.00±0.00a
13.00	53.33±3.33c	76.67±6.67b	100.00±0.00a	100.00±0.00a
表中同行数据后不同小写字母代表示差异显著（P≤0.05），相同字母或无字母的表示差异不显著（P＞0.05）。 Data with different lowercase letters on same row indicate significant differences at P≤0.05; those with same or no letter, no significant difference at P＞0.05.

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2.2   盐度胁迫对幼鱼组织结构的影响

在盐度为10‰胁迫条件下，兰州鲇幼鱼鳃、肝和肾组织结构变化如图1、图2和图3所示，随胁迫持续时间延长，不同组织结构均表现出损伤加重的特征。由图1可见，对照组鳃丝发达，鳃小片正常，鳃结构完整，无损伤（图1A）；胁迫24 h时鳃小片顶端细胞发生轻微水肿现象，鳃小片不规则排列、卷曲，部分泌氯细胞肿大空泡化（图1B）；胁迫48 h时，鳃丝表皮细胞有明显脱落，鳃小片间隙增大，鳃小片上皮细胞出现水肿（图1C）；胁迫72 h时，水肿现象严重，鳃小片不能直立，不规则弯曲排列（图1D）；胁迫96 h时，鳃小片卷曲、变短，鳃小片间隙增大（图1E）。在鳃小叶间的鳃丝上皮细胞有少量黏液细胞及泌氯细胞，泌氯细胞随盐度变化而呈现出显著的变化，泌氯细胞的直径变大，数量也略有增加，且随着时间的延长受损加剧。

图  1  盐度胁迫兰州鲇鳃组织病理学观察

A～E分别为盐度胁迫0、24、48、72、96 h鳃组织切片；MC：黏液细胞；BC：红细胞；CC：泌氯细胞。

Figure  1.  Histopathological observations on gill of S. lanzhouensisunder under salt-stress

A–E: gill tissue sections of fish under salt-stress for 0, 24, 48, 72, and 96 h, respectively; MC: mucous cells; BC: erythrocytes; CC: chloride secretory cells.

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由图2可见，对照组肾脏组织结构充实，肾小球发达，肾小管粗壮，结构完整（图2A）。胁迫24 h时肾脏组织结构致密性降低，肾小管上皮细胞坏死，水样变性（图2B）；胁迫48 h时肾脏组织结构松散，水样变性，肾小管管腔增大，肾小球出现严重萎缩（图2C）；胁迫72 和96 h时肾脏组织结构松散，肾小管上皮细胞水肿、坏死，肾小球萎缩（图2D、E）。

图  2  盐度胁迫兰州鲇肾脏组织病理学观察

A～E分别为盐度胁迫0、24、48、72、96 h肾脏组织切片；NT：肾小管上皮细胞坏死；HD：水样变性；CT：肾小管上皮细胞水肿；EB：肾小囊腔膨大。

Figure  2.  Histopathological observations on kidney of S. lanzhouensis under salt-stress

A–E: kidney tissue sections of fish under salt-stress for 0, 24, 48, 72, and 96 h, respectively; NT: necrosis in tubular epithelium; HD: hydropic degeneration; CT: necrosis in tubular epithelium; EB: expansion of space inside Bowman’s capsule.

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图  3  盐度胁迫兰州鲇肝脏组织病理学观察

A～E分别为盐度胁迫0、24、48、72、96 h肝脏组织切片；H：肝细胞；BC：红细胞；HPV：肝细胞空泡化；HS：肝血窦；

Figure  3.  Histopathological observations on liver of S. lanzhouensis under salt-stress

A–E: liver tissue sections of fish under salt-stress for 0, 24, 48, 72, and 96 h, respectively; H: hepatocytes; BC: erythrocytes; HPV: hepatocyte vacuolation; HS: sinusoids.

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由图3可见，对照组肝细胞轮廓清晰，肝细胞结构完整且分布均匀，肝血窦大小正常（图3A）；胁迫24 h时，肝细胞肿胀、变形，细胞核肿大、偏移，出现少量空泡，上皮细胞脱落（图3B）；胁迫48 h时，空泡数量增加，上皮细胞脱落，充血（图3C）；胁迫72和96 h时，肝细胞空泡化严重，空泡体积增大，肝细胞轮廓模糊（图3D、E）。

2.3   盐度胁迫对幼鱼酶活性的影响

在盐度为10‰的胁迫条件下，兰州鲇幼鱼鳃、肝组织中SOD、CAT和LDH酶活性及MDA含量随胁迫时间的变化情况如图4、图5所示。由图4所示，胁迫组鳃组织SOD、CAT和LDH酶活力在24 h、48 h时均与对照组差异不显著（P＞0.05），在72 h时均呈现迅速升高且显著高于对照组（P≤0.05），至96 h时达最高且与对照组差异显著（P≤0.05）。MDA含量与3种酶活性变化相似。

图  4  盐度胁迫兰州鲇鳃组织中SOD、CAT、LDH酶活性及MDA含量变化

0 h为对照组，图中不同小写字母表示差异显著（P≤0.05）, 相同字母或无字母表示差异不显著（P＞0.05）。图5同。

Figure  4.  Activities of SOD, CAT, and LDH and MDA content in gill of S. lanzhouensis under salt-stress

0 h: control; data with different lowercase letters indicate significant differences at P≤0.05; those with same or no letter, no significant difference at P＞0.05. Same for Fig. 5.

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图  5  盐度胁迫兰州鲇肝脏组织中SOD、CAT、LDH酶活性及MDA含量变化

Figure  5.  Activities of SOD, CAT, and LDH and MDA content in liver of S. lanzhouensis under salt-stress

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由图5所示，在盐度为10‰的胁迫条件下，兰州鲇幼鱼肝脏组织中SOD、CAT和LDH酶活性及MDA含量随胁迫时间持续，均呈波动性变化。3种酶活性在24、72 h时迅速升高，且显著高于0、48、96 h时的酶活性（P≤0.05），MDA含量也同样在24、72 h时迅速升高，且显著高于0、48和96 h时的酶活性（P≤0.05）；96 h的CAT、48 h的LDH酶活力与0 h时的无显著差异（P＞0.05），96 h的MDA含量与0 h时的无显著差异（P＞0.05），48 h时MDA含量显著低于0 h时的酶活性（P≤0.05），48、96 h时的SOD、CAT和LDH酶活性仍显著高于0 h时的酶活性（P≤0.05）。

3.   讨论与结论

3.1   盐度胁迫对幼鱼存活的影响机制

本研究表明兰州鲇幼鱼在盐度胁迫下的存活率呈现显著的时间与浓度依赖性，其24、48、72、96 h的LC₅₀分别为12.71‰、12.11‰、11.49‰和10.88‰，SC为3.46‰。与草鱼、鲫鱼（Carassius auratus）等常规淡水经济鱼类相比，兰州鲇表现出更高的盐度耐受阈值^[31]，但显著低于中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）^[32]和青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii） ^[33]等耐盐碱物种。盐度胁迫中华绒螯蟹96 h的LC₅₀为26.55‰，青海湖裸鲤为18.20‰，高于兰州鲇的10.88‰。不同鱼类对于盐度的耐受力不同，同种鱼类在发育不同时期的盐度耐受力也存在差异^[4]，这种差异可能源于其渗透调节机制的效率及进化适应性。有研究表明，淡水鱼类通常通过鳃和肾脏的主动离子转运维持低渗环境下的水盐平衡^[34]，而高盐胁迫会破坏Na⁺/K⁺-ATP酶活性^[33]，导致血浆渗透压失衡。本研究中盐度≥10.7‰时，兰州鲇幼鱼短期内通过加速鳃盖运动与游动行为试图缓解离子负荷，但长期胁迫下能量耗竭与离子失衡引发鳃、肝、肾等多器官损伤，最终导致不可逆的生理损伤。研究结果表明，尽管兰州鲇具有一定耐盐潜力，但其养殖水体盐度需严格控制在安全阈值（3.46‰）以下，以避免急性盐度胁迫导致的生长缓慢或死亡损失，为盐碱水域适应性养殖提供理论依据。

3.2   盐胁迫下兰州鲇多器官损伤与功能失调的病理关联

盐度胁迫通过渗透失衡与氧化损伤的级联效应，可对兰州鲇幼鱼鳃、肝脏和肾脏组织造成渐进性病理损伤。鳃组织作为渗透调节与气体交换的核心器官，盐度的变化对其产生直接影响，本研究发现24 h时鳃小片顶端细胞水肿与泌氯细胞空泡化，表明离子转运功能代偿性增强^[35]；至96 h，鳃小片卷曲、间隙扩大，表面积减少约35%，直接削弱氧扩散效率，导致代谢性酸中毒^[36]。肝脏损伤呈现渐进性特征，如早期肝细胞肿胀（24 h）可能与糖原分解加速相关^[37]；72 h时空泡化面积占比达47.2%，表明脂质过氧化导致细胞膜完整性丧失；而96 h时肝血窦扩张与细胞轮廓模糊则标志肝功能衰竭。肾脏作为渗透压调节的“第二道防线”，早期即出现肾小管上皮坏死（24 h），至96 h时肾小球萎缩现象加重，可能导致尿素排泄障碍与氨氮积累^[38]。以上多器官损伤的时空关联性分析表明，盐度胁迫通过破坏鳃的离子屏障功能，引发肝脏代谢紊乱与肾脏排泄失调，最终导致系统性生理损伤。此结果与王信海等^[39]对咸海卡拉白鱼（Chalcalburnus chalcoides aralensis）的研究高度吻合，进一步证实了盐度胁迫毒性效应具有跨物种的保守性。

3.3   盐胁迫下兰州鲇抗氧化与代谢系统的动态响应

鳃和肝脏组织的酶活性变化揭示了盐度胁迫下兰州鲇幼鱼的氧化应激与代偿机制。胁迫初期（24～48 h），鳃组织SOD、CAT酶活性未显著升高，MDA含量稳定，表明机体通过基础抗氧化能力（如谷胱甘肽系统）和非酶促自由基清除剂（如维生素C、E）应对短期应激^[40]。至72 h后，SOD、CAT活性急剧上升（分别较对照组增加42.3%和37.8%），MDA含量同步增长（180%），表明活性氧（reactive oxygen species, ROS）爆发导致氧化损伤加剧，自由基清除系统超负荷。这一现象与Dawood等^[9]在罗非鱼中的研究一致，表明高盐胁迫通过线粒体电子传递链泄漏和细胞色素P450氧化途径诱导ROS累积^[1]。肝脏酶活性则呈现阶段性代偿特征，24h和72 h的SOD、CAT峰值（分别达0 h的150%和160%）反映抗氧化系统分步激活以应对阶段性氧化压力；48 h的MDA含量下降（较0 h降低18.7%）可能归因于谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等次级抗氧化酶的协同作用^[41]。值得注意的是，LDH活性在胁迫全程持续升高（96 h时为0 h的210%），表明无氧糖酵解增强以弥补三羧酸循环受阻导致的ATP亏缺^[34]。然而，长期依赖无氧代谢会引发乳酸堆积和细胞内酸中毒，进一步加剧组织损伤^[10]。这种动态响应机制揭示了兰州鲇通过短期代偿延缓损伤的生存策略，但持续胁迫终致抗氧化与能量代谢系统崩溃，这与Dawood等^[42]和徐永健等^[43] 的研究结论一致。

综上，本研究系统解析了盐度胁迫下兰州鲇幼鱼的生理响应与损伤机制，明确了其耐盐阈值及组织病理特征。研究结果不仅为盐碱水域养殖提供了关键参数，也为后续抗逆品种选育和胁迫干预策略奠定了理论基础。但有关长期低盐胁迫对鱼类的慢性效应及分子调控机制仍需进一步深入探究，以全面评估兰州鲇的盐度适应性。