0.   引言

【研究意义】 余甘子（Phyllanthus emblica L.），系大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）多年生灌木或小乔木。余甘子的果实具有清热凉血、消食健胃、生津止咳的作用^[1]，历版的《中华人民共和国药典》均有收录^[2]。余甘子主要分布于印度、泰国、马来西亚等热带和亚热带国家以及我国的海南、福建、广东、广西、云南等地^[3]，其中以中国和印度分布面积最大，产量最高^[4]。我国的余甘子种质资源储有量十分丰富，90%以上仍处于野生或半野生状态，由于我国地域分布广大，余甘子命名繁杂，同名异种或同种异名的现象均很严重，对种质资源的收集保存和育种工作带来困难。开发简便、快速的分子标记技术，高效、及时地对余甘子种质资源进行系统精准评价分析，摸清遗传亲缘关系，对余甘子种质资源鉴定和选育种有重要意义。【前人研究进展】近年来，分子标记技术迅猛发展，由ZIETKIEWICZ等^[5]1994年提出的简单重复序列区间（inter-simple sequence repeats，ISSR）标记成为分子辅助育种的重要手段之一，该技术具有操作简便、高效、成本低、无须明确任何靶标序列且稳定性好等优点^[6]，已被广泛地应用在橄榄^[7]，猕猴桃^[8]，山核桃^[9]等多种野生果树的种质资源鉴定当中。但余甘子种质资源ISSR分子标记技术尚未被广泛应用，目前仅有刘晓生^[10]、周春娟^[11]分别对广东潮汕和粤东地区余甘子种质资源进行ISSR分子标记分析；邵雪花^[12]对中国华南地区28份种质进行遗传多样性分析并构建遗传指纹图谱；李巧明等^[13]对云南干热河谷地区的4个余甘子居群进行遗传多样性研究。以上研究均表明ISSR分子标记技术可有效运用于余甘子种质资源多样性分析。【本研究切入点】利用单因素试验并结合响应面分析法优化余甘子ISSR-PCR反应体系研究鲜有研究报道。【拟解决的关键问题】本研究通过应用单因素试验结合响应面分析法分析引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量等反应条件对ISSR反应体系的影响及互相之间的交互作用，建立余甘子ISSR-PCR分子标记反应体系，为余甘子种质资源遗传多样性分析与亲缘关系研究提供研究基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

2019年10月采集来源于缅甸、印度、广东、云南、福建的余甘子种质资源的健康嫩叶于−80 ℃保存备用。试验材料由国家热带植物种质资源库余甘子种质资源分库提供，位于福建省福州市晋安区新店镇埔垱村（119˚19′59ʺE，26˚7′48ʺN，海拔20 m）。品种（系）名及采集地见表1。

表  1  试验材料来源

Table  1.  Sources of testing materials

编号 Code	品种（系）名　　 Name	来源 Source	采样地 Sample Site
1	缅甸实生 Myanmar seedling	缅甸 Myanmar	余甘子种质资源圃 Field genebank for Phyllanthus emblica
2	印度大果 India species	印度 India	余甘子种质资源圃 Field genebank for Phyllanthus emblica
3	甜种 Tianzhong	中国广东 Guangdong, China	余甘子种质资源圃 Field genebank for Phyllanthus emblica
4	盈玉 Yingyu	中国云南 Yunnan, China	余甘子种质资源圃 Field genebank for Phyllanthus emblica
5	福建本地种 Fujian native specie	中国福建 Fujian, China	余甘子种质资源圃 Field genebank for Phyllanthus emblica

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主要试剂：2×Taq Master Mix（由Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和MgCl₂混合而成）购自天根生化科技（北京）有限公司，所用引物为UBC841（序列：GAG AGA GAG AGA GAG AYC）是UBC公布的ISSR通用引物，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

主要仪器设备：离心机（SIGMA 1-14K）、电泳仪（BIO-RAD Power Pac Univer-sal）、电泳凝胶成像仪（BIO-RAD Gel DOCTMXR⁺）、超微量核酸测定仪（Thermo NANODROP ONE）、移液器（Eppendorf Research Plus）和PCR仪（BIO-RADT100TM）等。

1.2   试验方法

1.2.1   DNA提取

本研究选用不同地域来源的5份余甘子的DNA组成混合的DNA模板对ISSR反应体系进行优化，提取余甘子基因组DNA采用李金璐等^[14]改良的CTAB法，选择DNA质量浓度为100～200 ng·μL⁻¹，A260/A280比值为1.83～2.14，1%琼脂糖凝胶电泳条带完整性较好的DNA 样品于−80 ℃保存，进行后续试验。DNA模板各基因组DNA电泳效果见图1。

图  1  余甘子基因组DNA提取电泳效果

注：M为DL15K DNA marker；1.缅甸实生；2.印度大果；3.甜种；4.盈玉；5.福建本地种。

Figure  1.  Electrophoretic DNA extraction on germplasms

Note: M: DL 15K DNA marker; 1: Myanmar seedling; 2: a wild variety from India; 3: Tianzhong; 4: Yingyu; 5:Fujian native species.

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1.2.2   单因素及响应面优化试验设计

分别以引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量3个单因素试验（表2）进行PCR扩增与凝胶电泳成像，明确体系反应条件的变化范围及各因素的适应值。在单因素结果基础上，根据 Box-Behnken Design的试验原理，每个自变量取3个水平，以−1、0、1进行编码（表3），以电泳图谱条带质量的评分为响应值，响应面试验设计见表4。电泳图谱条带质量的评分准则参考尚小红等^[15]的主观分析法进行电泳扩增谱带分析，即根据电泳图谱中电泳条带数量、清晰度、重复性、亮度和背景干净程度分别对17个组合进行打分，1～4分（清晰条带少，亮度弱，杂带多，重复性差，背景模糊），5～8分（清晰条带多，但亮度较弱，有杂带，重复性好，背景较干净），9～12分（清晰条带多，亮度较强，无杂带，重复性好，背景清晰），13～16分（清晰条带多，亮度强，无杂带，重复性好，背景清晰）。

表  2  单因素试验设计

Table  2.  Simple factor experiment

序号 Number	编号 Code	引物浓度 Primer concentration/ （μmol·L−1）	2×Taq Master Mix 添加量 2×Taq Master Mix addition amount/μL	DNA模板量 DNA template amount/ng
1	A	0.2	12	45
2		0.3	12	45
3		0.4	12	45
4		0.5	12	45
5		0.6	12	45
6	B	0.4	8	45
7		0.4	10	45
8		0.4	12	45
9		0.4	14	45
10		0.4	16	45
11	C	0.4	12	15
12		0.4	12	30
13		0.4	12	45
14		0.4	12	60
15		0.4	12	75
注：在整个反应过程中，随着比较因素梯度的设置变动，相应的调整ddH2O的量以保证反应体系为25 μL。 Note: During reaction process, amount of added ddH2O was continually adjusted to maintain volume of reaction system at 25 μL as gradient of comparison factor changed.

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表  3  响应面分析因子及水平表

Table  3.  Factors and levels of response surface design

反应条件 Reation Condition	编码 Code	水平 Levels
		−1	0	1
引物浓度 Primer concentration/（μmol·L−1）	X1	0.30	0.35	0.40
2×Taq Master Mix 添加量 2×Taq Master Mix addition amount/μL	X2	12	13	14
DNA模板量 DNA template amount/ng	X3	25	30	35

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1.2.3   PCR扩增及电泳条件

扩增条件：反应体系为25 µL，反应程序为预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，45 s；退火温度53 ℃，45 s；延伸72 ℃，2 min；35个循环；终延伸72 ℃，6 min；最后于4 ℃保存。扩增完成后，取2 μL扩增产物染色点样于1%琼脂糖凝胶上，加0.5×TEB缓冲液，在120 V电场强度下电泳30 min，于凝胶成像仪上观察拍照。

1.2.4   退火温度的优化及体系适用性研究

以UBC 841为引物，利用最佳ISSR反应体系对PCR扩增程序中的退火温度进行单因素试验，退火温度使用自动梯度50.5、50.7、51.2、51.9、52.7、53.3、53.7、54.0 ℃共8个梯度。根据凝胶电泳图谱结果，选择条带清晰、重复性好、多态性好的温度为最佳退火温度。

1.3   统计分析

采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等软件进行统计分析，其中Design Expert 8.0.6进行响应面试验设计、数据分析和模型的建立。

2.   结果与分析

2.1   单因素对ISSR反应体系的影响

单因素试验的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结果如图2，可见，引物浓度与2×Taq Master Mix添加量对反应体系的影响较大。引物浓度偏高或偏低都会影响扩增结果，引物浓度过高会引起引物与DNA模板错配和非特异性产物扩增，增加产生二聚体的概率，引物浓度偏低则不易测出扩增位点，本研究引物浓度为0.30～0.40 μmol·L⁻¹时电泳效果较好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg²⁺等反应原料，Taq DNA聚合酶直接影响扩增反应的成功与否，浓度过高容易产生非特异的PCR产物，dNTP是ISSR分子标记扩增的重要原料，浓度过高易错配，过低影响合成效率，2×Taq Master Mix添加量为12～14 μL为最佳。DNA模板量范围取决于物种基因组大小和DNA纯度，研究表明，DNA模板量对余甘子ISSR-PCR的影响较小，考虑电泳条带质量和数量，选择DNA模板量最佳为30 ng。

图  2  引物浓度（UBC 841）、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量对ISSR反应体系的影响

注：M为DL15K DNA Maker；A、B、C分别表示引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量单因素试验，1～15代表不同处理。

Figure  2.  Effect of primer concentration, 2×Taq Master Mix addition, and DNA template amount on ISSR reaction

Note: M: DL15K DNA maker; A, B, and C: primer concentration, 2×Taq Master Mix addition, and DNA template amount, respectively, in single factor test; and 1-15: various treatments.

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2.2   响应面法优化ISSR反应体系

以电泳图谱（图3）中电泳条带数量、清晰度、重复性、亮度和背景干净程度的评分（5名科研工作者主观评分）为响应值（表4），采用多元回归拟合，获得引物浓度（X₁），2×Taq Master Mix添加量（X₂），DNA模板量（X₃）的二次多项回归模型为F=11.92−0.4375X₁−0.55X₂−1.7375X₃−0.75X₁X₂−1.575X₁X₃−0.55X₂X₃−4.2975X₁²−3.5225X₂²−2.1975X₃²。检验方程的有效性，对数学模型进行方差分析电泳图评分为响应值时，该二次方程模型有统计学意义（p=0.012 6＜0.05），说明该模型对本试验有较好拟合；回归方程失拟性检验无统计学意义（p=0.757 1），表明未知因素对试验结果干扰很小，模型能较好地反应真实的试验值，可用于响应值的分析和预测，所得的回归方程模型能较好地预测电泳图谱得分随各参数的变化规律。试验所选三因子X₁、X₂和X₃中X₂达到显著影响（p＜0.05），X₁、X₃因子二次项均达到极显著影响（p＜0.001）表明单因素X₂对响应结果影响较大，且X₁与X₃因子有极显著的交互影响。

图  3  17组响应面试验电泳图谱

注：M为DL 2K DNA Maker；1～17分别对应表4序号ISSR反应体系电泳谱图。

Figure  3.  Seventeen sets of electropherograms by response surface test

Note: M: DL 2K DNA maker; 1-17: electrophoresis spectra of ISSR reaction system shown on Table 4.

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表  4  响应面分析方案及试验结果

Table  4.  Design and results on factors and levels of response surface test

序号 Order number	X1	X2	X3	评分 Score
1	0	0	0	14.2±1.41
2	0	1	−1	4.25±1.26
3	1	0	1	2.12±1.26
4	1	−1	0	9.25±0.5
5	−1	−1	0	10.25±0.82
6	1	0	−1	6.75±0.96
7	0	−1	1	6.38±1.60
8	1	1	0	9.38±0.95
9	0	−1	−1	8.13±0.85
10	0	0	0	13.55±2.46
11	0	1	1	7.38±1.38
12	0	0	0	10.00±1.83
13	1	0	1	5.13±0.82
14	0	1	0	8.75±0.96
15	−1	0	−1	2.25±0.50
16	−1	0	1	7.50±1.29
17	0	0	0	14.75±5.19

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根据回归拟合方程得出各试验因子引物浓度（X₁）、2×Taq Master Mix添加量（X₂）、DNA模板量（X₃）两两因素交互作用的等高线图（图4），等高线图可直观反映出2个变量间交互作用的显著程度，其中圆形表示两两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两两因素交互作用显著^[16]；等高线图由蓝到红的变化越快，沿自变量方向高度差越大^[17]，引物浓度（X₁）和DNA模板量（X₃）之间交互作用显著。

图  4  引物浓度（UBC841）和DNA模板量对电泳图谱评分的影响

Figure  4.  Effects of primer UBC841 concentration and DNA template amount on electrophoretic scores

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根据Design Expert 8.0.6 软件分析出的若干解决方案与其相应预测得分值，考虑到保证高响应值的同时节约成本，对响应面优化结果进行最优分析验证，得到ISSR反应体系的实际值（图5），该值与理论预测值进行比较计算相对误差，结果见表 5。结果表明，最优实际解决方案引物浓度为0.40 μmol·L⁻¹，2×Taq Master Mix添加量为13.0 μL，DNA模板量30 ng，该条件与理论预测响应值13.130 4的相对误差仅为9.39%，说明该模型具有好的分析能力，可为实际操作提供良好的指导。

图  5  验证试验电泳图谱

注：M为DL2K DNA Marker；A、B与C、D分别为验证试验1、2电泳结果。

Figure  5.  Electropherogram of validation test

Note: M: DL15K DNA marker; A and B: results of validation test 1; C and D: results of validation test 2.

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表  5  验证试验与结果

Table  5.  Validation test results

序号 Number	理论解决方案 Theoretical solution	实际解决方案 Practical solution	理论评分 Theoretical score	实际评分 Actual score	相对误差 Relative error/%
1	X1：0.36 μmol·L−1，X2：13.46 μL，X3：29.41 ng	X1：0.35 μmol·L−1，X2：13.5 μL，X3：30 ng	13.1149	11.4±0.55	9.58
2	X1：0.37 μmol·L−1，X2：13.09 μL，X3：29.06 ng	X1：0.40 μmol·L−1，X2：13.0 μL，X3：30 ng	13.1304	12.5±0.79	9.39

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2.3   退火温度对ISSR反应体系的影响

退火温度影响ISSR图谱的稳定性，较低的退火温度可保证引物与模板结合的稳定性，但较易产生错误的扩增。由电泳图谱（图6）可知，35循环数下，50.5～54.0 ℃随着退火温度的升高谱带质量与条带数有较明显的变化，退火温度为50.5～52.7 ℃时，随着温度的升高条带数呈增加趋势，条带质量变好，52.7～54.0 ℃时，部分条带模糊，缺失。选择较高的退火温度可减少引物和模板间非特异性的结合，提高扩增产物的特异性，综合谱带质量和条带数，退火温度为52.7 ℃时最佳，可获得较好的扩增效果。

图  6  退火温度对ISSR反应体系的影响

注：M为DL2K DNA Marker；电泳谱1～8依次表示50.5 、50.7、51.2 、51.9 、52.7 、53.3、53.7 和54.0 ℃退火温度下扩增效果。

Figure  6.  Effect of annealing temperature on ISSR assay

Note: M: DL2K DNA marker; Electrophoresis 1-8: at ISSR annealing temperatures of 50.5 , 50.7 , 51.2 , 51.9, 52.7, 53.3 , 53.7 and 54.0 ℃, respectively.

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通过优化得到ISSR-PCR反应的体系为引物浓度为0.4 μmol·L⁻¹，2×Taq Master Mix添加量为13 μL，DNA模板量30 ng，退火温度为52.7 ℃，循环次数35次；将该体系应用于不同余甘子种质资源效果见图7，引物UBC841在该体系下可扩增出条带清晰和多态性良好的电泳图谱，表明该体系适宜应用于余甘子种质资源的遗传多样性和亲缘关系研究。

图  7  引物UBC841对不同余甘子种质资源扩增的电泳结果

注：M.DL 2K DNA Marker；1～5表示不同来源的余甘子种质资源。

Figure  7.  Electrophoretic results on amplification of germplasms using primer UBC841

Note: M: DL 2K DNA marker; 1-5: 5 P. emblica germplasms.

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3.   讨论与结论

ISSR是在SSR的基础上发展起来的一种新型的分子标记，目前，ISSR已广泛用于植物品种鉴定、遗传图谱、遗传多样性及分子生态学研究^{[18, 19]}。ISSR分子标记技术基于PCR反应，其扩增谱带受反应条件和扩增程序变化以及物种不同的影响，采用不同的反应体系组合和扩增程序电泳结果差异较大，因此，开发ISSR分子标记对其反应体系和扩增程序优化显得必不可少。

本研究综合运用单因素试验与响应面分析法，首先确定了各因素的有效范围，再对各因素组合优化，从而确立普遍适用于余甘子种质资源的ISSR-PCR反应体系。本研究PCR扩增采用2×Taq Master Mix试剂，该试剂将多种扩增原料混合，研究结果虽未能直观体现Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺ 等原料对余甘子ISSR-PCR反应体系的影响^[20]，但可大大提高工作效率，达到了节省物料、简便、快速的目的，可在ISSR分子标记研究中加以推广应用。本研究结果表明引物浓度对余甘子ISSR反应体系影响较大，DNA模板量与引物浓度有显著的交互作用，与前人研究较一致^{[21, 22]}。应用响应面法对影响ISSR反应体系的主要因素进行筛选，建立余甘子ISSR反应体系模型F=11.92−0.437 5X₁−0.55X₂−1.737 5X₃−0.75X₁X₂−1.575X₁X₃−0.55X₂X₃−4.297 5X₁²−3.522 5X₂²−2.197 5X₃²，可较快地得到最优组合，避免了单因素试验结果的不足。

本研究确立余甘子ISSR-PCR反应体系：引物浓度为0.4 μmol·L⁻¹，2×Taq Master Mix添加量为13 μL，DNA模板浓度30 ng，扩增循环数为35循环，退火温度52.7 ℃；扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可应用于余甘子种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系研究。