Cloning and Polymorphism Analysis of VIPR-1 Gene in Black Muscovy Duck
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摘要: VIPR-1基因是研究家禽就巢性状的重要候选基因,VIPR-1基因的克隆和测序能为进一步研究黑番鸭就巢性状的单核苷酸多态性奠定理论基础,为鸭分子遗传育种提供基因素材。本研究以黑番鸭基因组为模板进行PCR扩增,获取黑番鸭VIPR-1基因序列[1 864bp(序列1)和1 673bp(序列2)的基因片段],并进行目的基因片段克隆和测序。结果分析表明,序列1包含第5外显子(101bp)、第5内含子(1 630bp)及第6外显子(133bp)的完整序列;序列2包含第12外显子(42bp)、第12内含子(1 455bp)的完整序列和第13外显子(176bp)的部分序列。根据基因序列特征,对获取的2段黑番鸭VIPR-1基因序列分别设计4对引物,进行扩增序列测序比对。结果发现:在序列1第318处、454处存在C/T突变,第547处存在A/G突变,第923处存在A/T突变;序列2第89处、944处存在C/T突变,第662处存在G/A突变,第1 031处存在A/G突变,第1 334处存在A/C突变。黑番鸭VIPR-1基因序列的克隆与单核苷酸多态性SNP突变位点的发现为进一步开展VIPR-1基因的多态性与黑番鸭就巢性状相关研究奠定了基础。Abstract: As a critical candidate gene of poultry broodiness,the length of 1 864 bp(target 1) and 1 673 bp(target 2) gene fragments of the vasoactive intestinal peptide-1 gene were amplified with polymerase chain reaction method from the genomic DNAs Abstracted from the blood of black Muscovy duck.The results of sequence analysis demonstrated that the target fragment 1 included the complete sequence of the 5th exon(101 bp),the 5th intron(1 630 bp) and the 6th exon(133 bp).The target fragment 2 contained the complete sequence of the 12th exons(42 bp),the 12th introns(1 455 bp) and partial sequence of the 13th exons(176 bp).Another four pairs of specific primers(P1-P8) were designed according to the two sequences fragments,respectively.The results showed that the target fragment 1 had C/T mutation at position 318 bp and 454 bp,A/G mutation at 547 bp,A/T mutation at 923 bp;the target fragment 2 had C/T mutation at 89 bp and 944 bp,A/G mutation at 662 bp and 1 031 bp,A/C mutation at 1 334 bp.The characterization and mutations discovery with the VIPR-1 gene provided the basic evidences for the further study on the association of its polymorphisms with broodiness trait with the black Muscovy ducks.
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Keywords:
- black muscovy duck /
- VIPR-1 gene /
- clone /
- polymorphism analysis
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农用地和畜禽养殖是农业领域氧化亚氮(N2O)的重要排放源。IPCC第三工作组第四次评估报告指出, 全球农业排放的非CO2温室气体占人为排放的非CO2温室气体总量的14%，其中农业排放了84%的N2O和47%的甲烷(CH4)[1]。农业土壤排放的N2O约占人类活动N2O总排放量的52%[2]，农业生产对温室气体总排放量的贡献率大约是20%[3]。1994年发布的国家温室气体清单中农业活动排放N2O占N2O总排放量的92%、CH4占CH4总排放量的50%[4]。准确合理地估算农业活动温室气体排放量，是制定农业减排政策的重要前提。然而，我国不同地区或省份间产业结构、经济水平、种植制度、养殖制度、土壤地形、气候等因素千差万别，N2O排放量存在较大差异[5]，对应的N2O减排措施也就存在差异。在此背景下，开展省级尺度的N2O排放清单研究具有重要意义。国家发展改革委员会《省级温室气体清单编制指南(试行)》[6]的出台，引起了政府部门及学术界的广泛关注，众多学者相继开展了清单编制方法学[7-9]及省级尺度温室气体清单编制研究[10-18]。
针对福建省N2O排放问题，李艳春等[19]应用区域氮素循环模型IAP-N方法，估算了1991-2010年福建省农业生态系统N2O排放量，并分析其排放特征；梅煌伟[20]、赵胜男[21]和许肃等[22]也对福建省温室气体排放进行了核算，但由于这些研究的核算方法与年限范围以及排放参数的选取等存在一定不足，所得到的排放清单结果不足以反映福建省最新的农用地和畜禽养殖N2O排放情况及其驱动因素。本研究基于文献[6, 23-24]的IPCC核算方法，以2005年为基准年，估算2005年、2010年和2015年福建省农业活动N2O排放情况，分析N2O总排放量变化趋势及不同排放源的N2O排放量，进一步分析不同排放源的主要控制因素，旨在为建立福建省温室气体排放清单提供基础数据，并为制定福建省农业温室气体减排措施提供决策参考。
1. 材料与方法
1.1 农业活动N2O排放源界定
1.1.1 农用地N2O排放
农用地N2O排放源分为直接排放源和间接排放源，直接排放源是指施用的化肥氮、粪肥氮、秸秆还田氮；间接排放源是指大气沉降到农田内外的活性氮，以及农田中淋溶和径流损失的氮。
1.1.2 动物粪便管理N2O排放
动物粪便管理N2O排放源包括奶牛、非奶牛、山羊、猪、家禽等粪便管理过程中产生的N2O。福建省不考虑绵羊、马、驴、骡和骆驼的排放。粪便指畜禽排泄的粪便和尿液。
1.2 排放量估算方法
1.2.1 农用地N2O排放
按照《省级温室气体清单编制指南(试行)》[6]，农用地N2O排放等于各排放过程的氮输入量乘以其相应的N2O排放因子，农用地N2O排放量根据公式(1)计算。
EN2O=∑(N输入⋅EF) (1) 式中，EN2O为农用地N2O排放总量(包括直接排放、间接排放)；N输入为各排放过程氮输入量；EF为对应的N2O排放因子。
(1) 农用地N2O直接排放：农用地氮输入量主要包括化肥氮(N化肥)、粪肥氮(N粪肥)、秸秆还田氮(N秸秆)，根据以下(2)~(4)式计算农用地N2O直接排放量。
N2O直接=N农田输入·EF直接=(N化肥+N粪肥+N秸秆)·EF直接 (2) N粪肥=(畜禽总排泄氮量+乡村人口总排泄氮量)×(1−淋溶径流损失率−挥发损失率)−畜禽粪便管理系统N2O排放氮量 (3) 式中，淋溶径流损失率为15%，挥发损失率为20%。
N秸秆=地上秸秆还田氮量+地下根氮量=(作物籽粒产量/经济系数−作物籽粒产量)×干重比×秸秆还田率×秸秆含氮率+作物籽粒产量/经济系数×根冠比×干重比×根或秸秆含氮率 (4) 式中，根含氮率如无法获取，可近似用秸秆含氮率代替。
(2) 农用地N2O间接排放：农用地N2O间接排放(N2O间接)源于施肥土壤和畜禽粪便氮氧化物(NOX)和氨(NH3)挥发经过大气氮沉降引起的N2O排放(N2O沉降)，以及土壤氮淋溶和径流损失进入水体而引起的N2O排放(N2O淋溶)。
大气氮沉降引起的N2O间接排放：大气氮沉降引起的N2O排放用公式(5)计算，大气氮主要来源于农业排泄氮(即畜禽粪便排泄氮和乡村人口排泄氮，N农业排泄)和农用地输入(N农田输入)的NH3和NOX挥发。因福建省没有N农业排泄和N农田输入的挥发率观测数据，因此采用文献[6]推荐值20%和10%。排放因子采用《IPCC1996指南》的排放因子0.01。
N2O沉降=(N农业排泄×20%+N农田输入×10%)×0.01 (5) 淋溶径流引起的间接排放：农田氮淋溶径流引起的N2O间接排放量采用公式(6)计算。其中，氮淋溶径流损失的氮量按照农用地总氮输入量20%来估算。排放因子采用《IPCC2006指南》的排放因子0.007 5。
N2O淋溶=N农田输入×20%×0.0075 (6) 1.2.2 动物粪便管理N2O排放
按照文献[6]，动物粪便管理N2O排放量等于动物粪便管理N2O排放因子乘以动物数量，然后相加可得总排放量。
特定动物粪便管理N2O排放量采用公式(7)计算：
EN2O,manure,i=EFN2O,manure,i⋅APi⋅10−7 (7) 式中，EN2O, manure, i为第i种动物粪便管理的N2O排放量，单位为万t·年-1；EFN2O, manure, i则为特定种群粪便管理的N2O排放因子，单位为kg·头-1·年-1；APi为第i种动物的头数。
1.3 活动水平数据确定
1.3.1 农用地N2O排放活动水平数据
农用地直接和间接排放氮投入量由化肥氮、粪肥氮、秸秆还田氮计算获得。
化肥氮：包括氮肥和复合肥中的氮。氮肥中氮含量数据来源于《福建经济与社会统计年鉴2006(农村篇)》[25]、《福建农村统计年鉴2011》[26]和《福建农村统计年鉴2016》[27]。通过调研福建省农业生产所用复合肥情况并进行分析，确定2005年复合肥氮折纯量按15%计算，2010年和2015年按30%计算。
粪肥氮：包括畜禽粪肥施用量和乡村人口的排泄物施入到农田的量。畜禽饲养量、乡村人口等数据来源于文献[25-27]。畜禽单位年排泄氮量参考文献[6]。乡村人口年排泄氮量参照文献[28]，取值5.4 kg·年-1·人-1。
秸秆还田氮：主要包括水稻、花生、油菜籽、芝麻、甘蔗、烟叶、蔬菜等，其产量数据来源于文献[25-27]，主要农作物参数见表 1。秸秆直接还田率来源于全国农户抽样调查数据，取值0.171[29]。
表 1 福建省主要农作物参数Table 1. Factors involving N2O emission by main crops in Fujian农作物 干重比 秸秆含氮率 经济系数 根冠比 水稻 0.86 0.008 0.489 0.13 花生 0.90 0.018 0.556 0.20 油菜籽 0.82 0.005 0.271 0.15 芝麻 0.90 0.013 0.417 0.20 甘蔗(茎) 0.32 0.004 0.750 0.26 烟叶 0.83 0.014 0.830 0.20 蔬菜 0.15 0.008 0.830 0.25 1.3.2 动物粪便管理N2O排放活动水平数据
动物粪便管理N2O排放所需畜禽饲养量数据(年末存栏数)来源于文献[25-27]。奶牛、非奶牛、山羊、猪、家禽的氮排泄量参考文献[6]，分别为60、40、12、16、0.6 kg·头-1·年-1。
1.4 排放因子确定
1.4.1 农用地N2O排放因子
福建省农用地N2O排放因子采用文献[6]的推荐值，N2O直接排放因子取0.017 8，范围0.004 6~0.022 8；大气氮沉降引起的N2O排放因子取0.010 0，范围0.002 0~0.050 0；氮淋溶径流引起的N2O排放因子取0.007 5，范围0.000 5~0.025 0，单位为kg N2O-N/kg氮输入量。
1.4.2 动物粪便管理N2O排放因子
福建省动物粪便管理N2O排放因子参考文献[6]，符合福建省实际情况的奶牛、非奶牛、山羊、猪、家禽的排放因子分别为2.065、0.846、0.113、0.175、0.007 kg·头-1·年-1。
1.5 N2O排放量不确定性计算方法[6]
活动水平的不确定性主要源于农业统计部门对农用地面积、畜禽存栏数统计产生的误差，其不确定性以±5%进行估算。
农用地N2O排放因子的不确定性按照公式(8)进行计算。
Uf=±[(C−B)/A/2×100] (8) 式中，Uf为排放因子不确定性(%)，A为排放因子推荐值，B为排放因子下限，C为排放因子上限。
依据《IPCC国家温室气体清单优良作法指南和不确定性管理》的规定，动物粪便管理N2O排放因子的不确定性以±50%进行估算。
当某一估计值为n个估计值之积时，该估计值的不确定性采用公式(9)计算：
Uc=√U2s1+U2s2+⋯+U2sn=√N∑n=1U2sn (9) 式中，Uc表示n个估计值之积的不确定性(%)；Us1…Usn表示n个相乘的估计值的不确定性(%)。
当某一估计值为n个估计值之和或差时，该估计值的不确定性采用误差传递公式(10)计算：
Uc=√(Us1μs1)2+(Us2μs2)2+⋯+(Usnμsn)2|μs1+μs2+⋯+μsn|=√N∑n=1(U2snμsn)2|N∑n=1μsn| (10) 式中，μs1…μsn表示n个相加减的估计值。
2. 结果与分析
2.1 农用地N2O排放量
2005年福建省农用地N2O排放总量为2.99万t，其中N2O直接排放量为2.49万t(占83.28%)，间接排放量为0.50万t(占16.72%)；2010年福建省农用地N2O排放总量为2.96万t，其中N2O直接排放量为2.51万t(占84.80%)，间接排放量为0.45万t(占15.20%)；2015年福建省农用地N2O排放总量为2.94万t，其中N2O直接排放量为2.46万t(占83.67%)，间接排放量为0.48万t(占16.33%)。
福建省农用地N2O排放量的地区分布比例见图 1。从地区分布看，2005年、2010年和2015年排放量最大的均为漳州市(> 23%)、最小的均为厦门市(< 3%)。从年际间变化趋势看，N2O排放量增加的有漳州市、南平市、三明市、宁德市，N2O排放量降低的有泉州市、厦门市。
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图 1 福建省各地区农用地氧化亚氮排放量Figure 1. Spatial distribution of N2O emission from farmlands in Fujian2.2 动物粪便管理N2O排放量
福建省主要动物粪便管理N2O排放量比例见图 2。2005年、2010年和2015年福建省动物粪便管理N2O排放量分别为0.42万t、0.39万t和0.35万t。从动物种类看，N2O排放量最大的均为猪(>50%)，排放量最小的均为奶牛(< 4%)。从年际间变化趋势看，主要动物N2O排放量均呈现先降低后增加的趋势(猪除外)。
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图 2 福建省主要动物粪便管理氧化亚氮排放量Figure 2. Proportions of N2O emission from animal waste in Fujian福建省各地区主要动物粪便管理N2O排放量分布比例见图 3。从地区分布看，2005年、2010年和2015年排放量最大的均为龙岩市(>20%)、最小的均为厦门市(< 4%)。从年际间变化趋势看，N2O排放量增加的有龙岩市、南平市，N2O排放量降低的有漳州市、泉州市、三明市、莆田市、厦门市。2015年漳州市和泉州市N2O排放量降低幅度较大、而南平市则大幅增加，可能与其畜禽养殖产业政策调整有关。
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图 3 福建省动物粪便管理氧化亚氮排放量地区分布Figure 3. Spatial distribution of N2O emission from animal waste in Fujian2.3 福建省农业活动N2O排放量
综合以上数据，得出2005年、2010年和2015年福建省农业活动N2O排放总量(表 2)。2005年福建省农业活动N2O排放总量为3.41万t，其中农用地排放2.99万t(占87.68%)、粪便管理排放0.42万t(占12.32%)；2010年福建省农业活动N2O排放总量为3.35万t，其中农用地排放2.96万t(占88.36%)、粪便管理排放0.39万t(占11.64%)；2015年福建省农业活动N2O排放总量为3.29万t，其中农用地排放2.94万t(占89.36%)、粪便管理排放0.35万t(占10.64%)。
表 2 福建省农业活动氧化亚氮排放总量Table 2. Total N2O emission from agricultural activities in Fujian排放源 2005年 2010年 2015年 N2O排放量/万t CO2当量 N2O排放量/万t CO2当量 N2O排放量/万t CO2当量 农用地 2.99 926.90 2.96 917.60 2.94 911.40 动物粪便管理 0.42 130.20 0.39 120.90 0.35 108.50 总计 3.41 1057.10 3.35 1038.50 3.29 1019.90 注：N2O折合成CO2当量的系数是310。 采用《IPCC第二次评估报告》提供的全球变暖潜势值数据计算，2005年、2010年和2015年福建省农业活动排放N2O分别相当于1057.10万t、1038.50万t和1019.90万t二氧化碳当量。
2.4 N2O排放量不确定性分析
不确定性分析是温室气体核算的重要组成部分，也是判断核算质量的依据。农业活动N2O排放量的不确定性来源于多方面，受多种因素影响[30]，本研究中只考虑活动水平及排放因子的不确定性。
根据公式(9)和公式(10)计算得到：2005年、2010年和2015年福建省农用地N2O排放量计算结果的不确定性分别为50.04%、49.93%和50.76%；主要动物粪便管理N2O排放量计算结果的不确定性分别为29.60%、32.85%和30.13%；2005年、2010年和2015年福建省农业活动N2O排放总量的总体不确定性分别为44.03%、44.36%和45.47%。
3. 讨论与结论
3.1 福建省农业活动N2O排放变化
本研究表明，2005年、2010年和2015年福建省农业活动N2O排放总量分别为3.41万t、3.35万t和3.29万t，2015年和2010年分别比2005年减少3.52%和1.76%；农用地N2O排放量，2015年和2010年分别比2005年减少1.67%和1.00%；动物粪便管理N2O排放量，2015年和2010年分别比2005年减少16.67%和7.14%。农业活动N2O排放总量的变化与农用地规模及种植结构、畜禽养殖规模及结构变化有很大的关系。本研究中2005年和2010年福建省农用地和畜禽粪便管理N2O排放估算结果与李艳春等[19]和许肃等[22]的研究结果相近或一致，而目前对2015年福建省农业活动N2O排放总量的估算研究鲜有报道。
3.2 减少农用地N2O排放的途径和方法
许肃等[22]研究表明，农用地是福建省N2O第一排放源，约占N2O总排放的75%~80%；其次是畜禽粪便管理，约占总排放的10%~13%；农业活动N2O排放占福建省N2O总排放量的85%~93%。因此，减少农业活动N2O排放是减少福建省N2O排放的关键。农业土壤N2O排放受多种因素的影响，作物品种、气候条件、土壤条件、土地利用类型、农业耕作措施，以及水肥管理都会影响到农田N2O排放[31]。许肃等[22]对1980-2013年福建省农业活动N2O排放的研究表明，畜禽粪便管理阶段的N2O排放相对稳定，减少农用地氮肥(化肥和粪肥)施用后N2O直接排放是减少N2O排放的主要途径。氮肥过量施用是造成农田土壤N2O排放的主要原因[32-35]。因此，减少农田氮肥施用是目前的首要目标。可采取优化氮肥施用技术[35-37]、改变氮肥形态[32, 38]和施用硝化抑制剂等[37, 39]，达到减少农田N2O排放的目标。
3.3 减少动物N2O排放的途径和方法
影响动物N2O排放的因素包括日粮类型、环境温度等一系列因素[40-42]。李艳春等[19, 43]研究认为，控制和减少畜禽养殖N2O及CH4排放的关键是优化畜牧业结构，提高规模化养殖水平，改良畜禽品种，改进动物饲养和畜禽排泄物处理技术。要加强畜产品安全监测和管理，实现畜产品生产的全程控制，从源头上实现畜牧业的清洁生产，才能从深层次解决畜禽养殖温室气体排放及污染问题[44-46]。
3.4 N2O排放估算结果的不确定性分析
农业活动N2O排放量的不确定性来源于多方面，受多种因素影响[30]，本研究中只考虑活动水平及排放因子的不确定性。本研究存在的主要困难和问题：①福建省的统计数据基础比较薄弱，目前的统计指标体系与清单编制所要求的数据体系不一致，有些活动水平指标尚未纳入统计体系；②在计算福建省农业活动N2O排放清单时，由于缺少福建省当地的实际排放因子，本文采用的是全国(分区域)通用的排放因子，并不完全符合福建当地的情况，因此存在不确定性；③不确定性的来源还包括其他因素，如涉及农作物的经济系数、含氮率、干重比，氮肥施入农田后的淋溶和径流损失率，以及N2O间接排放因子等，这些参数因福建省各县市农事作业方式的多样性而存在一些差异，由于缺少相关数据，本研究中统一采用福建省的参数，导致存在可能不确定性。因此，研究适合福建省当地实际情况的温室气体排放因子是亟待加强的一项基础性研究工作。
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陈杰,卢立志,陈伟华,等.四季鹅繁殖周期中血浆某些生殖激素水平的变化[J].南京农业大学学报,1991,14(4):76-80. COLDSMITH A R,WILLIAMS D M.Incubation in mallards:Changes in plasma levels of prolactin and luteinizing hormone[J].Journal of Endocrinology,1980,86:371-379.
李昂,林福忠,王寿昆,等.番鸭就巢内分泌调控机制的研究[C]//第十三次全国动物遗传育种学术讨论会论文集,2005:683-687. LEA R W,DODS A S,SHARP P J,et al.The possible role ofprolactin in the regulation of nesting behavior and the secretionof Luteinizing hormone in broody bantams[J].Journal ofEndocrinology,1981,91:89-97.
DUN I C,MC E G,OKHUBO T,et al.Genetic mapping ofthe chicken prolactin receptor gene:a candidate gene for thecontrol of broodiness[J].British Poultry science,1998,39:23-24.
崔建勋,杜红丽,张细权.鸡催乳素基因序列及生物信息学分析[J].遗传,2005,27(2):208-214. 饶友生,聂庆华,梁勇,等.鸡8个功能基因5′-侧翼区与内含子的SNP多样性比较[J].生物多样性,2007,15(4):432-436. KANSAKU N,SHIMADA K,OHKUBO T,et al.Molecularcloning of chicken vasoactive intestinal polypeptide receptorcomplementary DNA,tissue distribution and chromosomallocalization[J].Biol Reprod,2001,64(5):1575-1581.
HALAWANI E L,SILSBY J,MAURO L.Vasoactiveintestinal peptide is a hypothalamic prolactin releaseingneuropepptide in the turkey[J].General and ComparativeEndocrinology,1999,78:66-73.
YOU S,HSU C C,KIM H,et al.Molecular cloning andexpression analysis of the turkey vasoactive intestinal peptidereceptor[J].GenComp Endocrinol,2001,124(1):53-65.
郑嫩珠,陈晓燕,陈晖,等.黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析[J].农业生物技术学报,2012,20(5):529-535. 周敏,梁菲菲,饶友生,等.VIPR-1基因5’侧翼区2个SNP与鸡产蛋就巢的相关性[C]//第十三次全国家禽学术讨论会议文集,2007:513-516. 周敏,何丹林,刘满清,等.清远麻鸡VIPR-1基因多态性及与生长性状的关联分析[J].养禽与禽病防治,2009,(7):2-4. -
期刊类型引用(5)
1. 秦硕璞，李婷，张雅京，杨淼，郝一涵，汪明明，马欣悦，王辰星，严岩. 中国农业源非CO_2温室气体排放核算. 生态学报. 2024(17): 7536-7551 . 
百度学术
2. 杨玲，聂三安，钟俊杰，盛浩，余展. 基于Meta分析的茶园土壤N_2O排放及主要影响因素. 土壤通报. 2023(06): 1484-1492 . 百度学术
3. 王国峰，刘朴，邓祥征，刘玉洁，孙志刚. 双碳目标下中国农业系统N_2O排放及主粮低碳化生产研究. 南京信息工程大学学报(自然科学版). 2022(04): 484-492 . 百度学术
4. 张学智，王继岩，张藤丽，李柏霖，焉莉. 中国农业系统甲烷排放量评估及低碳措施. 环境科学与技术. 2021(03): 200-208 . 百度学术
5. 王成己，李艳春，刘岑薇，王义祥，黄毅斌. 福建省规模化养猪场温室气体减排效益评估. 福建农业学报. 2019(04): 465-470 . 本站查看
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