Bioinformatics and Expression of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase 13 Gene of Maize
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摘要:目的 对玉米（Zea mays L.）甘油-3-磷酸酰基转移酶（Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）家族成员ZmGPAT13进行生物信息学分析和在不同非生物胁迫处理下的基因表达模式变化检测，为进一步研究ZmGPAT13的生物学功能奠定理论基础。方法 通过TAIR和MaizeGDB数据库获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）和玉米中GPAT家族蛋白序列，利用生物信息学方法进行理化性质、蛋白结构、亚细胞定位、保守基序、系统进化、磷酸化位点和启动子顺式作用元件等分析，并采用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对ZmGPAT13在不同组织部位及甘露醇（Mannitol）、NaCl、脱落酸（ABA）、高温（42 ℃）、低温（4 ℃）处理下的相对基因表达量进行分析。结果 ZmGPAT13是一个定位于线粒体的跨膜蛋白，与部分GPAT家族成员含有排序相同的15个保守基序（motif），且与拟南芥中AtGPAT1的亲缘关系最近；预测分析发现ZmGPAT13含有62个磷酸化位点，可能与玉米中多个GPATs存在相互作用关系；ZmGPAT13基因启动子富含多种与低温和ABA响应等相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR技术对ZmGPAT13组织表达模式分析发现ZmGPAT13的相对基因表达量在胚芽鞘（Coleoptile）中最高，根（Root）中次之，叶片（Leaf）中最低；甘露醇（Mannitol）、NaCl、脱落酸（ABA）及高温（42 ℃）和低温（4 ℃）处理均能诱导ZmGPAT13的基因表达显著上调。结论 玉米中ZmGPAT13具有高度的进化保守性，可能通过转录水平的变化参与调控玉米对干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫的响应过程。
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关键词:
- 玉米 /
- 甘油-3-磷酸酰基转移酶 /
- ZmGPAT13 /
- 生物信息学分析 /
- 非生物胁迫
Abstract:Objective Bioinformatics and expressions under stresses of glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT) gene family member, ZmGPAT13, in maize were studied.Method Sequences of GPAT family members in Arabidopsis thaliana and Zea mays L. were obtained from the TAIR and MaizeGDB databases. Physicochemical properties, protein structure, subcellular localization, conserved motifs, phylogenetic evolution, phosphorylation sites, and cis-acting elements of promoter sequence of the GPATs were analyzed by bioinformatic methods. Expressions of ZmGPAT13under the stresses of mannitol, NaCl, abscisic acid (ABA), high temperature at 42 ℃, and low temperature at 4 ℃ were examined by qRT-PCR.Result A transmembrane protein, ZmGPAT13 localized in mitochondria, shared the same 15 conserved motifs with other GPAT family members, and had the highest homology with AtGPAT1 in arabidopsis. It contained 62 phosphorylation sites and might interact with multiple GPATs of maize. The promoters of ZmGPAT13consisted of numerous cis-acting elements associated with the responses to low temperature and ABA stresses. The gene expressed most highly in the coleoptile, followed by the roots and the lowest in the leaves. And, relatively, the expressions were significantly elevated under the stress of mannitol, NaCl, ABA or high or low temperature.Conclusion A high evolutionary conservation seemed existed in ZmGPAT13. It was postulated that, at transcription level, ZmGPAT13 might be involved in the responses of maize plants to abiotic stresses such as drought, salt, and extreme temperatures.-
Keywords:
- Zea mays L. /
- glycerol-3-phosphate acyltransferase /
- ZmGPAT13 /
- bioinformatics /
- abiotic stresses
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0. 引言
【研究意义】植物脂质（Lipid）主要包括脂肪酸（Fatty acid）、油脂（Grease）、类固醇（Steroid）、蜡质（Wax）、角质（Cutin）、木栓质（Suberin）、甘油磷脂（磷脂质，Glyceryl phosphatide）、甘油糖脂（糖基甘油酯，Glyceroglycolipid）、萜烯（Terpene）和生育酚（Totaxin）等多种化合物，它们在植物生长发育中发挥一系列重要功能[1]。甘油脂质是植物脂质的主要成分，植物甘油脂质生物合成主要在质体/叶绿体、线粒体和内质网等细胞器，此外细胞质膜、细胞质、细胞核、脂滴、溶酶体等场所也存在参与甘油脂质生物合成的酶[2-3]。尽管过去几十年对参与脂质生物合成途径的酶和基因进行了大量研究，但对大多数的酶和基因的功能及它们之间的相互作用关系仍不清晰[4]。因此，分析脂质生物合成途径中的关键酶和基因的生物学功能，对进一步研究脂质在植物生长发育及胁迫响应过程中的调控作用具有重要意义。【前人研究进展】甘油-3-磷酸酰基转移酶（Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）是参与植物脂质生物合成的关键限速酶，负责催化膜脂和贮存脂从头合成的第一步反应。GPAT将酰基基团转移到甘油-3-磷酸（G-3-P）的sn-1或sn-2位，以生成溶血磷脂酶。迄今为止至少在37种植物中报道了GPAT基因，包括模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana），玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、普通小麦（Triticum aestivum）等农作物，陆地棉（Gossypium hirsutum）、甘蓝型油菜（Brassica napus）、花生（Arachis hypogaea）等经济作物，菠菜（Spinacia oleracea）、南瓜（Cucurbita rnoschata）等蔬菜，柑橘（Citrus reticulata）、柚子（Citrus grandis）等果树和丹参（Salvia miltiorrhiza）、东北连翘（Forsythia mandshurica）等药用植物[4]。研究发现GPAT在植物脂质合成、植物育性、种子发育、胁迫抗性等方面发挥重要作用[5]。拟南芥AtGPAT6突变后影响植株花粉萌发，导致种子结实率下降[6]；AtGPAT5 参与合成拟南芥种皮和根中的木栓质，AtGPAT7参与植物损伤修复过程；过表达花生中AhGPAT9提高种子含油量[7]。拟南芥AtGPAT1突变会延缓绒毡层细胞的程序性死亡，影响花粉粒细胞内膜形成，进而导致雄性不育[8-9]，但同时影响赤霉素的合成，进而提高了植株高度[10]。玉米中ZmMs33/ZmGPAT6功能缺失导致玉米花药角质层缺陷，花药壁层停滞退化，育氏体和外壁形成异常，最终导致完全雄性不育[11]。另外，很多研究表明GPATs对盐、低温和高温等不同胁迫有响应并显著影响植株抗性，例如盐地碱蓬（Suaeda salsa）GPAT的过量表达增强了拟南芥的耐盐性，番茄（Lycopersicon esculentum）中LeGPAT的过量表达增加了磷脂酰甘油中的顺式不饱和脂肪酸从而增强了耐盐性和耐冷性，百合（Lilium pensylvanicum）LpGPAT基因也被证明与低温胁迫相关[12]。过表达甘蓝型油菜中的BnATS1提高了不饱和脂肪酸含量进而增强植株冷胁迫耐受性[13]。拟南芥gpat5突变体植株根中的木栓质含量降低了50%，Atgpat5突变体对盐胁迫的耐受性低于野生型[14]。甘蓝型油菜 BnGPAT4干扰株系叶片角质层有明显的几丁质缺陷，气孔不能正常关闭，使植株长期处于高蒸腾作用状态，容易失水[15]。蜡质生物合成对最初的病原体防御至关重要，与野生型植株相比，甘蓝型油菜BnGPAT19和BnGPAT21的RNAi植株在接种真菌后出现了严重的坏死病变，这表明BnGPAT19和BnGPAT21可能参与了角质层的蜡质生物合成[16]；AtGPAT4和AtGPAT8双突变后植株茎和叶中的角质含量下降，影响了正常的气孔结构，进而导致对干旱和病菌的耐受性降低[5, 6]；烟草（Nicotiana benthamiana）或番茄中沉默GPAT6均会增加叶片对疫霉菌感染的敏感性，此外，还观察到番茄gpat6-a突变体细胞壁-角质层连续性受损，气孔减少，但水分流失增加[17]。【本研究的切入点】尽管不同物种中的GPAT响应非生物胁迫过程，但是玉米中GPAT是否在胁迫过程中发挥作用尚不清楚。本实验室前期对ZmEREBP60转基因玉米材料进行干旱胁迫处理后通过转录组测序发现编号为Zm00001d011430的基因在干旱处理前后的玉米材料中具有明显表达差异，表明该基因受到干旱胁迫诱导，推测其在玉米耐旱过程中发挥作用[18]。通过序列比对发现Zm00001d011430（GRMZM2G177150，Zm00001eb358940）编码蛋白为甘油-3-磷酸酰基转移酶13（Glycerol-3-phosphate acyltransferase 13，GPAT13），即ZmGPAT13。【拟解决的关键问题】通过对ZmGPAT13及其家族成员进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对ZmGPAT13在不同玉米组织及不同非生物胁迫处理下的表达模式进行分析，以期为后续深入研究ZmGPAT13的生物学功能奠定理论基础，也为培育抗逆性强的玉米新品种提供基因资源。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为玉米自交系B73，由本实验室保存。
1.2 试验方法
1.2.1 GPAT生物信息学分析
利用在线软件ExPASy-ProtParam（https://web. expasy.org/protparam/）分析ZmGPAT13的理化性质（氨基酸数量、相对分子质量、等电点、分子式和总平均亲水性），利用TMHMM Server v.2.0 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测ZmGPAT13的跨膜结构域，SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件预测ZmGPAT13蛋白二级结构。通过SWISS-MODEL 程序对ZmGPAT13三级结构预测（https://swissmodel.expasy.org/interactive） 后利用Swiss-Pdbviever 4.1.0对模型进行可视化。
通过拟南芥数据库Tair及玉米数据库MaizeGDB分别下载拟南芥和玉米中的GPAT家族蛋白序列。通过在线软件MEME（http://meme-suite.org）对GPAT蛋白序列中的保守基序（motif）进行预测分析，然后使用TBtools软件对蛋白保守基序进行可视化，motif数量为20，motif长度为1～60，其他为默认参数。利用在线Cell-PLoc网站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）对GPAT进行亚细胞定位预测。使用MEGA 11.0软件采用邻接法（Neighbor joining，NJ）对GPAT家族成员进行系统进化树构建（Bootstrap=1000）。
利用在线软件NetPhos 3.1（http://www.Cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对磷酸化位点进行预测，通过STRING在线网站（https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bMNeidVMJTER&input_page_active_form=single_sequence）对玉米中GPAT家族成员之间的相互作用关系进行预测。
根据玉米全基因组序列，下载ZmGPAT13基因CDS上游2000 bp核苷酸序列作为启动子区域，使用网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对ZmGPAT13基因启动子序列进行顺式作用元件预测分析。
1.2.2 ZmGPAT13基因提取及表达量分析
（1）植物材料处理。筛选饱满均一的玉米种子，用1%次氯酸钠消毒5 min，蒸馏水冲洗3次，浸泡12 h后于28 ℃培养室内催芽。催芽3 d后，选取长势一致的种子，种植于1/4 Hoagland培养液中，于温度28 ℃/22 ℃（日/夜），光照强度200 μmol·m−2·s−1，光照周期14 h/10 h（L/D）的培养室中培养，每3 d更换一次培养液，培养至三叶一心期用于后续非生物胁迫处理。取三叶一心期幼苗的根（Root）、胚芽鞘（Coleoptile）、叶片（Leaf）在液氮中迅速冷冻后保存于−80 ℃冰箱中，用于后续提取RNA检测ZmGPAT13基因的组织表达模式。将三叶一心期玉米幼苗分别转移至200 mmol·L−1甘露醇（Mannitol）溶液、200 mmol·L−1 NaCl溶液、100 μmol·L−1脱落酸（ABA）溶液中及42 ℃、4 ℃环境中分别模拟渗透、盐胁迫等非生物胁迫处理0、6、12、24、48 h，剪取第二片叶快速置于液氮中冷冻后用于后续RNA提取检测ZmGPAT13基因的表达变化。每个处理设置3次重复。
（2）玉米总RNA提取及cDNA合成。将上述收取的根、胚芽鞘、叶片等材料进行总RNA的提取，方法参照宝生物（Takara）公司RNAiso Reagent （Total RNA提取试剂）产品说明书。基因组DNA去除和cDNA反转录方法参照全式金（Transgene）公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（一步去除基因组DNA和cDNA合成转录试剂盒）说明书进行。cDNA样品置于−20 ℃保存，用于后续qRT-PCR分析。
（3）玉米ZmGPAT13基因表达分析。以玉米ZmActin2基因为内参，依据引物设计原则采用软件Primer 5.0并结合NCBI blastn设计ZmGPAT13特异性引物用于qRT-PCR（表1）。qRT-PCR反应体系：2×buffer 5.0 μL ， dNTP （2.5 mmol·L−1）2.0 μL，上下游引物（10 μmol·L−1）各0.5 μL ， Taq酶（5 U·μL−1）0.2 μL， cDNA0.5 μL， ddH2O 1.3 μL，共10 μL 。反应条件：94 ℃ 2 min， 98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，循环35次，68 ℃ 4 min。qRT-PCR荧光试剂为购自上海生工生物工程有限公司的SGExcel Fast SYBR qPCR预混液，荧光定量PCR仪型号为Bio-Rad CFX connet，每个样品设置3个技术重复，采用2−△△Ct法计算ZmGPAT13相对基因表达量。
表 1 实时荧光定量PCR引物序列Table 1. Primer pairs for qRT-PCR verification基因
Gene引物
Primer引物序列（5′-3′）
Primer sequence(5′-3′)ZmGPAT13 ZmGPAT13-qF CGATCAGGGAGGCGTTGTTA ZmGPAT13 ZmGPAT13-qR CCTTGCAGTAGGGGACGAAG ZmActin2 ZmActin2-qF GCCATCCATGATCGGTATGG ZmActin2 ZmActin2-qR GTCGCACTTCATGATGGAGTTG 2. 结果与分析
2.1 ZmGPAT13编码氨基酸理化性质及结构预测分析
利用ExPASy-ProtParam对ZmGPAT13氨基酸数量、相对分子质量、等电点、分子式、总平均亲水性进行预测。结果显示ZmGPAT13共编码557个氨基酸，包含22种氨基酸，其中丙氨酸（Ala）和亮氨酸（Leu）占比最多，分别为13.6%和12.0%。分子式为C2769H4408N772O749S22，相对分子质量为61203.50，理论等电点 （pI）为9.80，总平均亲水性0.146，介于−0.5～0.5，属于两性氨基酸。
利用TMHMM Server v.2.0 对ZmGPAT13的跨膜结构域预测结果显示，ZmGPAT13含有两个明显的跨膜结构区，表明ZmGPAT13是一个跨膜蛋白（图1A）。利用SOPMA在线软件预测ZmGPAT13蛋白二级结构， ZmGPAT13蛋白含有α-螺旋（42.19%）、延伸链（19.21%）、β-转角（5.39%）、无规则卷曲（33.21%） 4种二级结构（图1B）。对ZmGPAT13蛋白的三级结构预测结果显示，该蛋白的三级构象主要由α-螺旋和β-折叠及无规则卷曲相互盘绕折叠构成（图1C）。
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图 1 ZmGPAT13跨膜结构域（A）、蛋白二级结构（B）和蛋白三级结构（C）分析Figure 1. Transmembrane domain (A), secondary structure (B), and tertiary structure (C) of ZmGPAT13通过Tair和MaizeGDB分别下载拟南芥和玉米中的GPAT序列，共查找到30个GPAT家族蛋白，其中拟南芥10个、玉米20个。利用Cell-PLoc在线网站预测了30个GPAT蛋白的亚细胞定位。GPAT蛋白主要定位于线粒体、叶绿体和内质网，其中定位于线粒体的最多，占比47%；定位于内质网的次之，占比21%；定位于叶绿体的占比11%。另外，同时定位于内质网和线粒体的占比16%，同时定位于叶绿体和线粒体的占比5%。对ZmGPAT13的亚细胞定位预测结果显示其定位于线粒体。
2.2 GPAT家族成员的保守基序分析
利用MEME对GPAT家族成员的保守基序（motif） 进行预测分析，由图2可知GPAT家族蛋白的基序分布表现出序列的保守性。ZmGPAT13与玉米中ZmGPAT1（Zm00001eb147550）、ZmGPAT2（Zm00001eb056370）、ZmGPAT7（Zm00001eb048150）、ZmGPAT8、ZmGPAT10（Zm00001eb229800）、ZmGPAT16（Zm00001eb005110）及拟南芥中AtGPAT4（At1G01610）、AtGPAT6（At2G38110）、AtGPAT8（At1G00400）等9个家族成员均含有15个motif，且从5′端到3′端motif的排列有相同的规律性，均按motif 6、motif 13、motif 10、motif 8、motif 11、motif 5、motif 15、motif 2、motif 12、motif 9、motif 1、motif 7、motif 4、motif 3、motif 18进行分布。
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图 2 拟南芥和玉米中GPAT家族成员保守基序分析（A）及蛋白保守基序的氨基酸序列（B）Figure 2. Conserved motifs of GPATs from arabidopsis and maize (A), and amino acid sequences of conserved motifs (B)2.3 GPAT家族成员进化树分析
利用MEGA11.0构建拟南芥和玉米中的GPAT家族成员的系统进化树，结果表明玉米ZmGPAT13与ZmGPAT8（Zm00001eb159140）和拟南芥AtGPAT1（At1G06520）在同一分支，亲缘关系相近（图3）。
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图 3 拟南芥和玉米中GPAT家族成员进化树分析Figure 3. Phylogenetic tree of GPATs from arabidopsis and maize2.4 ZmGPAT13磷酸化位点和互作蛋白预测分析
通过NetPhos 3.1对ZmGPAT13的磷酸化位点进行预测分析，如表2所示，ZmGPAT13氨基酸序列中可能发生磷酸化的位点共有62个，包含丝氨酸磷酸化位点30个、苏氨酸磷酸化位点27个、酪氨酸磷酸化位点5个；预测分析发现，可能磷酸化ZmGPAT13的蛋白激酶类型主要包括蛋白激酶C（PKC），占比29%；细胞周期依赖性蛋白激酶（cdc2），占比12%；酪氨酸蛋白激酶（CKII），占比5%；另外还包括核糖体S6蛋白激酶（RSK）、蛋白激酶G（PKG）、蛋白激酶A（PKA）、受体酪氨酸蛋白激酶（INSR）等激酶家族成员。这些结果表明ZmGPAT13可能主要通过被PKC和cdc2激酶磷酸化丝氨酸/苏氨酸位点来调控该蛋白的活性从而在调控植物生长发育、胁迫耐性等过程中发挥作用。
表 2 ZmGPAT13磷酸化位点预测分析Table 2. Predicted phosphorylation sites of ZmGPAT13氨基酸
Amino acid磷酸化位点
Phosphorylation sites激酶类型
Kinase groups丝氨酸 Serine 43(2)，187(2)，222(2)，279(2)，286(2)，353(2)，451(2)，496(2)，540(2) cdc2，PKC，PKG，RSK 51，104，168，221，223，257，258，276，324，397，402，479 DNAPK，cdc2，PKA，UNSP，CKII，PKC 苏氨酸 Threonine 37(2)，217(2)，227(2)，414(2)，472(2)，510(2)，516(2) PKC，UNSP，PKB，CKII，cdc2，PKG 17，38，55，60，65，89，180，385，440，441， 384，410，423 PKC，cdc2，UNSP 酪氨酸 Tyrosine 273，290，370，474，545 INSR，UNSP cdc2：细胞周期依赖性蛋白激酶；CKII：酪蛋白激酶II；DNAPK：DNA依赖性激酶；INSR：受体酪氨酸蛋白激酶；PKA：蛋白激酶A； PKC：蛋白激酶C；PKG：蛋白激酶G；RSK：核糖体S6蛋白激酶；PKB：蛋白激酶B；UNSP：无特异性蛋白激酶。括号内数字为所含氨基酸磷酸化位点个数。
cdc2: Cyclin-dependent kinase; CKII: Casein protein kinase II; DNAPK: DNA-dependent protein kinase; INSR: Insulin receptor tyrosine protein kinase; PKA: Protein kinase A; PKC: Protein kinase C; PKG: Protein kinase G; RSK: Ribosomal protein S6 kinases; PKB: Protein kinase B; UNSP: Unknown specific protein kinase. Number in brackets indicates count of amino acid sites contained.为探究ZmGPAT13基因可能存在的网络作用机制，利用STRING在线软件预测ZmGPAT13互作蛋白。结果发现10个与ZmGPAT13互作系数较高的蛋白（表3）。结构分析发现，除GRMZM2G071076外，其他互作蛋白均含有磷酸酰基转移酶结构域（PlsC），编码蛋白在磷脂生物合成中起作用；ZmGPAT15（GRMZM2G159890）含有GPAT_N domain，是影响植物耐低温能力的重要因素；Choline transptr-like（GRMZM2G071076）含有Choline_transpo domain，参与质膜转运过程；而含有Acyltransf_C domain的基因编码的蛋白具有溶血磷脂酰转移酶活性。ZmGPAT13蛋白可能与互作蛋白形成调控网络，通过参与脂质合成、转运进而在生长发育和胁迫抗性过程中发挥作用。
表 3 ZmGPAT13功能互作蛋白预测分析Table 3. Predicted functional interaction proteins of ZmGPAT13基因编号
Gene ID功能结构域
Function domain氨基酸
Amino
acid互作系数
Interaction
coefficientGRMZM2G123987 PlsC 371 0.954 GRMZM2G159890 PlsC，GPAT_N domain 477 0.940 GRMZM2G165681 PlsC 371 0.936 GRMZM2G135027 PlsC，Acyltransf_C domain 399 0.783 GRMZM2G014981 PlsC，Acyltransf_C domain 403 0.783 GRMZM2G037104 PlsC，Acyltransf_C domain 374 0.763 GRMZM2G878139 PlsC，Acyltransf_C domain 374 0.763 GRMZM2G071076 Choline_transpo domain 537 0.721 GRMZM2G075295 PlsC，HAD domain 486 0.698 GRMZM2G083195 PlsC，HAD domain 502 0.682 2.5 玉米中ZmGPAT13的顺式作用元件分析
对玉米ZmGPAT13起始密码子上游2 kb序列进行启动子顺式作用元件分析，结果显示ZmGPAT13基因主要含有脱落酸响应元件、低温响应顺式元件、茉莉酸甲酯响应元件等（表4）。根据这一结果推测，ZmGPAT13可能参与了玉米中激素响应和非生物胁迫响应过程。
表 4 ZmGPAT13基因启动子顺式作用元件分析Table 4. Cis-acting elements of ZmGPAT13 promoter序号
No.元件名称
Element序列
Sequence功能预测
Predicted function1 ABRE ACGTG 脱落酸响应
Abscisic acid responsive2 LTR CCGAAA 低温响应
Low temperature responsive3 TGACG-motif TGACG 茉莉酸甲酯响应
MeJA responsive4 CGTCA-motif CGTCA 茉莉酸甲酯响应
MeJA responsive5 Sp1 GGGCGG 光响应
Light responsive6 O2-site GATGATGTGG 玉米醇溶蛋白代谢
Zein metabolism7 GCN4_motif TGAGTCA 胚乳表达
Endosperm expression8 GC-motif CCCCCG 厌氧诱导
Anaerobic induction9 AuxRR-core GGTCCAT 生长素响应
Auxin responsive10 CCAAT-box CAACGG MYBHv1结合位点
MYBHv1 binding site2.6 玉米中ZmGPAT13组织表达模式分析
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析ZmGPAT13在玉米不同组织部位（根、胚芽鞘、叶）的表达模式。结果显示，ZmGPAT13在胚芽鞘中的表达量最高，根中次之，在叶片中相对表达量最低（图4A）。
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图 4 玉米中ZmGPAT13在不同组织及不同外源非生物胁迫处理下的表达A：不同玉米组织；B：200 mmol·L−1 甘露醇处理；C：200 mmol·L−1 NaCl处理；D：100 μmol·L−1 ABA处理；E：42 ℃高温处理；F：4 ℃低温处理。不同小写字母表示不同处理间差异显著（P ＜ 0.05）。Figure 4. Relative expressions of ZmGPAT13 in tissues under abiotic stressesA: Different tissues; B: Mannitol treatment at 200 mmol·L−1; C: NaCl treatment at 200 mmol·L−1; D: ABA treatment at 100 μmol·L−1; E: High-temperature treatment at 42 ℃; F: Low temperature treatment at 4 ℃. Data with different lowercase letters indicate significant differences at P＜0.05.2.7 不同非生物胁迫处理下玉米中ZmGPAT13的基因表达
为研究ZmGPAT13在转录水平是否响应非生物胁迫诱导，对玉米幼苗分别外源施加甘露醇（Mannitol）、NaCl、脱落酸（ABA）及进行高温和低温处理后检测ZmGPAT13的基因表达变化。qRT-PCR定量分析结果如图4所示，ZmGPAT13相对基因表达量在甘露醇处理下于12 h达到最大值，约为对照的20倍（图4B）。ZmGPAT13在NaCl模拟盐胁迫处理下表达量总体升高，呈现缓慢上升的趋势，在48 h时相对基因表达量达到最高，约为对照的6倍（图4C）。ZmGPAT13在ABA处理下表达量上调明显，在6 h达到最高，为对照的150多倍（图4D）。ZmGPAT13在高温处理下表达量呈上调趋势，并在24 h时达到最高值，约为对照的14倍（图4E）。ZmGPAT13在低温处理下表达量在12 h时达到最高值，约为对照的13倍（图4F）。上述结果表明ZmGPAT13的相对基因表达受甘露醇、NaCl、ABA、高温和低温等外源非生物胁迫处理的明显诱导，且ZmGPAT13对ABA的响应更加强烈，说明ZmGPAT13可能在转录水平参与非生物胁迫响应过程。
3. 讨论与结论
GPAT作为脂质生物合成途径的关键限速酶，已被发现在植物脂质合成、育性、种子发育、胁迫抗性等方面发挥重要作用[5]。迄今，研究报道了拟南芥中的10个AtGPAT基因，玉米基因组中共鉴定到20个GPAT基因家族成员[11]。本研究发现的ZmGPAT13基因编码557个氨基酸，基因表达受到干旱胁迫诱导[18]。对拟南芥和玉米中GPATs进行序列保守基序分析，发现ZmGPAT13与部分GPAT家族蛋白均含有排序相同的15个保守motif，这表明GPAT家族成员在序列进化上具有很强的保守性。拟南芥中的GPATs分为3个亚家族，其中ATS1定位于叶绿体/质体，属于第I进化分支；AtGPAT9定位于内质网，属于第II进化分支；AtGPAT1～AtGPAT8属于第III进化分支，同时又可分为3个亚支，分别定位于线粒体（III-1亚支）和内质网（III-2亚支和III-3亚支）[4]。本研究通过进化关系分析发现ZmGPAT13与拟南芥AtGPAT1具有最近的亲缘关系。蛋白的功能往往与其亚细胞定位相关，亚细胞定位预测结果显示ZmGPAT13可能定位于线粒体，亲缘关系相近的AtGPAT1亚细胞定位具有双重性，位于内质网与线粒体[8]，且拟南芥和玉米中定位于线粒体的GPAT占比47%。这些结果预示ZmGPAT13与其他物种中GPAT家族成员在进化上具有高度保守性，可能具有相似的功能。
已有研究发现GPAT家族成员在胁迫响应过程中发挥了重要作用，过表达碱蓬GPAT（SsGPAT）增强了拟南芥的耐盐性[12]，过表达油菜中的BnATS1增强植株耐冷性[13]，油菜中的BnGPAT19、BnGPAT21，烟草中NbGPAT6a和番茄中SlGPAT6均参与抵御病原体[16, 17]。玉米中GPAT家族蛋白的研究相对较少，是否参与响应胁迫过程尚需探索。课题组发现的ZmGPAT13是一个具有跨膜结构域的蛋白，在玉米中可能与其他蛋白存在相互作用关系。ZmGPAT13蛋白存在多个磷酸化位点，可能主要通过被蛋白激酶C和细胞周期依赖性蛋白激酶等激酶磷酸化丝氨酸/苏氨酸位点来调控该蛋白的活性，调节脂质生物合成进而参与调控植物生长发育及对非生物胁迫的响应过程。顺式作用元件分析发现ZmGPAT13基因启动子含有低温、ABA响应等元件，表明ZmGPAT13可能响应非生物胁迫。ZmGPAT13的相对表达量在胚芽鞘中相对较高，而在叶片中相对较低，表明ZmGPAT13的表达具有组织特异性。进一步发现甘露醇、NaCl、ABA及高温和低温等5种非生物胁迫处理均能显著诱导ZmGPAT13的表达，且对ABA的响应尤为强烈，这表明ZmGPAT13可能在抵御非生物胁迫和响应激素调控方面具有重要作用。虽然对ZmGPAT13的具体功能和调控机制还未深入研究，但对其功能预测及表达模式分析可为深入研究GPAT基因家族在响应非生物胁迫等生物学过程中的作用提供参考。
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图 1 ZmGPAT13跨膜结构域（A）、蛋白二级结构（B）和蛋白三级结构（C）分析
Figure 1. Transmembrane domain (A), secondary structure (B), and tertiary structure (C) of ZmGPAT13
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图 2 拟南芥和玉米中GPAT家族成员保守基序分析（A）及蛋白保守基序的氨基酸序列（B）
Figure 2. Conserved motifs of GPATs from arabidopsis and maize (A), and amino acid sequences of conserved motifs (B)
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图 3 拟南芥和玉米中GPAT家族成员进化树分析
Figure 3. Phylogenetic tree of GPATs from arabidopsis and maize
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图 4 玉米中ZmGPAT13在不同组织及不同外源非生物胁迫处理下的表达
A：不同玉米组织；B：200 mmol·L−1 甘露醇处理；C：200 mmol·L−1 NaCl处理；D：100 μmol·L−1 ABA处理；E：42 ℃高温处理；F：4 ℃低温处理。不同小写字母表示不同处理间差异显著（P ＜ 0.05）。
Figure 4. Relative expressions of ZmGPAT13 in tissues under abiotic stresses
A: Different tissues; B: Mannitol treatment at 200 mmol·L−1; C: NaCl treatment at 200 mmol·L−1; D: ABA treatment at 100 μmol·L−1; E: High-temperature treatment at 42 ℃; F: Low temperature treatment at 4 ℃. Data with different lowercase letters indicate significant differences at P＜0.05.
表 1 实时荧光定量PCR引物序列
Table 1 Primer pairs for qRT-PCR verification
基因
Gene引物
Primer引物序列（5′-3′）
Primer sequence(5′-3′)ZmGPAT13 ZmGPAT13-qF CGATCAGGGAGGCGTTGTTA ZmGPAT13 ZmGPAT13-qR CCTTGCAGTAGGGGACGAAG ZmActin2 ZmActin2-qF GCCATCCATGATCGGTATGG ZmActin2 ZmActin2-qR GTCGCACTTCATGATGGAGTTG 
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表 2 ZmGPAT13磷酸化位点预测分析
Table 2 Predicted phosphorylation sites of ZmGPAT13
氨基酸
Amino acid磷酸化位点
Phosphorylation sites激酶类型
Kinase groups丝氨酸 Serine 43(2)，187(2)，222(2)，279(2)，286(2)，353(2)，451(2)，496(2)，540(2) cdc2，PKC，PKG，RSK 51，104，168，221，223，257，258，276，324，397，402，479 DNAPK，cdc2，PKA，UNSP，CKII，PKC 苏氨酸 Threonine 37(2)，217(2)，227(2)，414(2)，472(2)，510(2)，516(2) PKC，UNSP，PKB，CKII，cdc2，PKG 17，38，55，60，65，89，180，385，440，441， 384，410，423 PKC，cdc2，UNSP 酪氨酸 Tyrosine 273，290，370，474，545 INSR，UNSP cdc2：细胞周期依赖性蛋白激酶；CKII：酪蛋白激酶II；DNAPK：DNA依赖性激酶；INSR：受体酪氨酸蛋白激酶；PKA：蛋白激酶A； PKC：蛋白激酶C；PKG：蛋白激酶G；RSK：核糖体S6蛋白激酶；PKB：蛋白激酶B；UNSP：无特异性蛋白激酶。括号内数字为所含氨基酸磷酸化位点个数。
cdc2: Cyclin-dependent kinase; CKII: Casein protein kinase II; DNAPK: DNA-dependent protein kinase; INSR: Insulin receptor tyrosine protein kinase; PKA: Protein kinase A; PKC: Protein kinase C; PKG: Protein kinase G; RSK: Ribosomal protein S6 kinases; PKB: Protein kinase B; UNSP: Unknown specific protein kinase. Number in brackets indicates count of amino acid sites contained.
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表 3 ZmGPAT13功能互作蛋白预测分析
Table 3 Predicted functional interaction proteins of ZmGPAT13
基因编号
Gene ID功能结构域
Function domain氨基酸
Amino
acid互作系数
Interaction
coefficientGRMZM2G123987 PlsC 371 0.954 GRMZM2G159890 PlsC，GPAT_N domain 477 0.940 GRMZM2G165681 PlsC 371 0.936 GRMZM2G135027 PlsC，Acyltransf_C domain 399 0.783 GRMZM2G014981 PlsC，Acyltransf_C domain 403 0.783 GRMZM2G037104 PlsC，Acyltransf_C domain 374 0.763 GRMZM2G878139 PlsC，Acyltransf_C domain 374 0.763 GRMZM2G071076 Choline_transpo domain 537 0.721 GRMZM2G075295 PlsC，HAD domain 486 0.698 GRMZM2G083195 PlsC，HAD domain 502 0.682
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表 4 ZmGPAT13基因启动子顺式作用元件分析
Table 4 Cis-acting elements of ZmGPAT13 promoter
序号
No.元件名称
Element序列
Sequence功能预测
Predicted function1 ABRE ACGTG 脱落酸响应
Abscisic acid responsive2 LTR CCGAAA 低温响应
Low temperature responsive3 TGACG-motif TGACG 茉莉酸甲酯响应
MeJA responsive4 CGTCA-motif CGTCA 茉莉酸甲酯响应
MeJA responsive5 Sp1 GGGCGG 光响应
Light responsive6 O2-site GATGATGTGG 玉米醇溶蛋白代谢
Zein metabolism7 GCN4_motif TGAGTCA 胚乳表达
Endosperm expression8 GC-motif CCCCCG 厌氧诱导
Anaerobic induction9 AuxRR-core GGTCCAT 生长素响应
Auxin responsive10 CCAAT-box CAACGG MYBHv1结合位点
MYBHv1 binding site
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期刊类型引用(1)
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