茶树育种过程漫长而枯燥，选育一个新品种一般需要20年左右时间，甚至更长^[1-7]。造成茶树育种周期长的一个主要原因是无法进行早期鉴定^[8-9]。育种者们为了鉴定茶树早期单株品质，尝试通过生化成分，生理指标或性状指标等方法来指导单株鉴定与筛选，但直到目前为止还没有成功应用的报道。传统乌龙茶品质鉴定一般通过小样制作来完成。从一粒杂交种子到完成品质鉴定一般需要10年左右的时间。同时由于周期长，工作量大，还容易造成混杂。本试验通过改进乌龙茶小样制作工艺^[8]，采用单株微量法制作乌龙茶小样，使茶树早期单株品质鉴定成为可能，从而缩短育种周期，提高工作效率。

分子标记辅助筛选是现代作物育种的一个有力而高效的工具，但从未在茶树育种中应用，同时近年来福建省选育的茶树品种存在亲本来源较窄，遗传多样性不够丰富的问题，本研究利用SSR分子标记鉴定候选单株的遗传多样性，避免新选育品种遗传背景过于狭窄的问题^[10]。

金牡丹由福建省农业科学院茶叶研究所选育，2010年被鉴定为国家级茶树品种(国品鉴茶2010024)，以铁观音为母本，黄棪为父本，采用人工杂交选育而成^[11-12]。为无性系，早生种，叶色黄绿，嫩芽带紫红色。其制作闽南乌龙茶香气馥郁悠长，滋味醇厚甘爽，“韵味”显，酷似铁观音；制闽北乌龙，香高味醇，耐冲泡，品种特征显著；制红茶品质优异，花果香显著，滋味醇厚，汤中含香，茶汤橙红透亮，叶底鲜红明亮。由于金牡丹品质优异，制优率高，适制茶类广，现已成为闽东地区和闽北地区的主栽茶树新品种，在外省也得到大面积的推广^[13-19]，为茶农和茶企带来了可观的经济效益。但金牡丹也存在一些缺点：不耐贫瘠，容易早衰，需要较精细栽培管理，需肥量大；抗旱性与抗病虫害均较弱；同时由于叶色黄绿其制成的闽南乌龙茶不够鲜绿，造成在闽南地区不易推广。本研究拟通过杂交方法改良金牡丹的以上性状，且保持或提升其花果香浓郁和品质优异的特性，以及通过与不同香型品种杂交而产生更多香型变异的茶树新品种。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

国家级乌龙茶品种金牡丹自然杂交后代。

1.2   茶树栽培管理

正常的茶园栽培管理。

1.3   单株微量法制作乌龙茶小样

(1) 鲜叶采摘：晴天午后，进入茶园分单株采摘鲜叶，1个网袋装1株鲜叶，采摘结束后运回制茶车间摊晾。

(2) 晒青：17：00开始晒青，装有茶青的网袋平铺于晒青场，约5 min后，网袋翻面继续晒青5~10 min即可，茶青运回车间后继续摊晾。

(3) 一摇：19：00开始第1次摇青，将装有茶青的网袋放入摇青筒，每筒装40个网袋，不超过滚筒体积的2/3，摇青时间3 min(转速20 r·min^-1)，摇青完毕，取出网袋摊晾。

(4) 二摇：1 h后开始第2次摇青，摇青时间4 min(转速20 r·min^-1)，摇青完毕，取出网袋摊晾。

(5) 三摇：1.5 h后开始第3次摇青，摇青时间2~10 min(转速20 r·min^-1)，本次摇青是最后一摇，摇青时间视茶青状态而定，红边和走水已到位的茶样即可取出，摇青程度不足的茶样继续摇，最长不超过10 min，摇青结束取出网袋摊晾、静置、等待第2 d杀青。

(6) 杀青：第2 d 11:00开始杀青，使用小滚筒杀青，温度约200~250℃，杀青时间30~60 s，以手抓叶片稍有刺手感为宜，下锅散热，温度降至室温后等待包揉。

(7) 包揉：每一个茶样用小包揉布包裹，再将30~50个小样用大包揉布包裹成大包，使用速包机或者压揉机进行压揉，然后对每个小样进行手工解块(包揉、解块重复5~10次)，直到叶片包揉成颗粒状结束。

(8) 烘干保存：包揉造型完毕的小样，放入烘箱烘焙，65℃烘焙2~3 h，烘干后捡梗，装袋保存，备用。

1.4   茶样审评

按照国家乌龙茶审评标准进行

1.5   农艺性状调查

按茶树农艺性状调查规范进行。

1.6   SSR分子标记技术

SSR引物来自文献[20-21]。茶树基因组DNA提取采用CTAB法。SSR反应体系、扩增程序及PAGE胶电泳检测参考张成才等^[20-22]的方法。

2.   结果与分析

2.1   金牡丹自然杂交群体的创建与种植管理

前期在不同茶园考查与金牡丹(母本)相邻种植的茶树品种，选定临近品种为优异的乌龙茶品种(父本)的茶园，然后于当年(2011年)11月从5个不同的茶园采集金牡丹自然杂交种子500多颗。茶树属异花授粉植物，不同茶园中与金牡丹相邻种植的茶树品种各不相同，所以作为父本的品种类型多样，杂交种子的遗传多样性也更加丰富。采集种子后进行剥壳、浸泡、播种。2012年2月开始陆续发芽，共获得300多棵茶苗。2013年1月，对已生长约1年的实生苗进行移栽，分单株种植，株距0.4 m，行距1.3 m(图 1-a)。2013年底对移栽后死苗的位置进行补苗与调整，保证茶苗种植的连续性，排除因死苗造成位置对应的错误，同时进行编号，调整后正好剩余300棵单株。从2014年秋季开始，每个单株生物量已达到进行单株微量法制作乌龙茶小样的要求(图 1-b、c)。

图  1  金牡丹自然杂交后代种植情况

注：a为移栽不久的茶苗；b为移栽第2年的茶苗；c为移栽第3年的茶苗。

Figure  1.  Growth of Jinmudan natural hybrid progeny

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2.2   乌龙茶单株小样制作、品质鉴定与筛选

2014年秋季，对每个单株进行乌龙茶小样制作(图 2-a~e)。小样制作完成后进行感官审评(图 2-f~g)，按乌龙茶审评国标进行。单株筛选阶段以茶叶内质为主，无关外形，所以审评以香气和滋味为主，其他项目不计。每个小样称取5 g，投入乌龙茶审评杯，加入沸水，第1泡2 min，第2泡3 min，审评以前两泡为主，感官审评结果如图 3-a所示。以对照种黄棪(国家区试对照种)作为参照，黄棪审评得分为92，首先淘汰分数为92分及以下的单株，保留审评分超过92分的单株，最终从300棵单株中初步筛选出100棵品质较优良的单株。2015年春季继续对这100棵单株重复进行乌龙茶小样制作及品质鉴定，感官审评结果如图 3-b所示，此次提高了筛选标准，对照种改为金牡丹，其得分为94分，从100棵单株中筛选出制茶品质接近或超过金牡丹的优良单株50棵。2015年秋季，进一步对50棵单株进行乌龙茶品质鉴定(图 3-c)，此次金牡丹得分为95分，继续淘汰低于95分(不含95分)的单株，共获得30份制茶品质优异单株。经过两年3次制茶品质的重复鉴定，获得制茶品质优异、可重复且稳定的单株30份。

图  2  乌龙茶单株小样制作及感官审评过程

注：a为晒青现场，每个网袋一个单株鲜叶；b为3次摇青后叶片呈现绿叶红镶边；c~d为小样包揉造型的过程；e为完成包揉造型后的小样；f~g为乌龙茶小样审评过程。

Figure  2.  Oolong tea made with individual plant and its sensory evaluation

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图  3  金牡丹杂交后代乌龙茶小样感官审评结果

注：a、b、c分别为2014年秋季、2015年春季、2015年秋季单株乌龙茶品质感官审评结果。

Figure  3.  Sensory evaluation on oolong tea made from Jinmudan natural hybrid progeny

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2.3   农艺性状调查与筛选

单株筛选以品质鉴定作为前提条件，同时在品质鉴定过程中进行萌芽期，生长势，抗寒抗旱性，抗虫性等农艺性状调查，淘汰劣势单株，筛选出农艺性状优良单株。经过两年性状调查，进一步淘汰农艺性状较差的单株，最终从30份制茶品质优异单株中筛选获得20份没有明显农艺性状缺陷的单株。20棵单株农艺性状调查结果如表 1所示。

表  1  20份优质乌龙茶单株农艺性状调查结果

Table  1.  Agronomic characteristics of 20 high-quality oolong tea plants

单株编号	萌芽期	生长势	抗寒性	抗旱性	抗虫性
WLC1	早生	中	中	中	中
WLC2	中生	中	中	中	中
WLC3	中生	强	中	中	中
WLC4	中生	中	强	中	中
WLC5	晚生	中	中	中	中
WLC6	早生	中	强	较强	中
WLC7	中生	强	中	中	中
WLC8	中生	中	中	中	中
WLC9	中生	中	中	中	中
WLC10	中生	中	中	中	中
WLC11	晚生	强	中	中	中
WLC12	早生	强	中	中	中
WLC13	中生	中	较强	中	中
WLC14	中生	中	中	中	中
WLC15	中生	中	中	中	中
WLC16	中生	中	中	中	中
WLC17	早生	中	强	较强	中
WLC18	中生	中	中	中	中
WLC19	中生	中	中	中	中
WLC20	晚生	强	中	中	中

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2.4   SSR分子标记辅助筛选

300份单株经过两年多次鉴定及淘汰，最终获得20份优异单株。尽管在育种过程中淘汰了大量单株，但20份单株对于区试推广来说，数量仍然庞大。同时为了提高选育品种的遗传多样性，试验进一步通过30对SSR引物，对20份单株进行遗传多样性分析，从中筛选出遗传多样性高的单株。图 4-a展示引物CsFM1594扩增结果。通过对分子标记实验数据的聚类分析(图 4-b)，发现20份单株可以明显地聚合成5个类群，这可能与杂交种子从多个地点采集而来有关，因为每个地点与金牡丹杂交的父本各不相同，所以后代的遗传背景差异较大，多样性较丰富。其中第1组里只含1个单株(WLC20)，而且与其他单株遗传距离都较远；第2组中有4个单株(WLC15、19、12、18)；第3组含5个单株(WLC9、11、13、17、10)；第4组含3个单株(WLC8、14、16)；第5组最多，含7个单株(WLC1、3、4、2、5、6、7)。根据聚类结果，并结合前期的品质及农艺性状鉴定结果，从5个类群中各筛选出1个单株，最终获得5个遗传多样性较丰富的优异单株：WLC6、WLC12、WLC14、WLC17、WLC20。

图  4  SSR分子标记辅助筛选

注：a为SSR引物CsFM1594对20份优良单株的PCR电泳图，M为marker，1~20泳道分别代表20个单株样品；b为20份优良单株SSR分子标记遗传多样性聚类图。

Figure  4.  SSR molecular marker-assisted selection process

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进一步对筛选获得的遗传多样性高，品质优异，综合农艺性状优良的5份单株进行扦插扩繁(图 5)，分单株剪穗扦插，每个单株扩繁后可获得约600株茶苗。此5个新株系茶苗将被用于区域试验。

图  5  筛选获得的优异单株进行扦插扩繁

注：a为扦插苗地；b为刚扦插的短穗；c为扦插短穗萌芽情况。

Figure  5.  Propagation of cuttings from selected plants after screening

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3.   讨论

茶树育种是个漫长而枯燥的过程，同时存在失败的风险，所以能够坚持从事茶树育种的科研人员少之又少。造成茶树育种周期长的原因是无法进行早期鉴定。传统乌龙茶小样制作需要的鲜叶量较大。早期每个育种材料只是一颗种子，需要3~4年时间让1粒种子无性扩繁到足够多的苗木，移栽后又需3~4年时间长大成行，然后进行2~3年的品质及农艺性状鉴定。同时每颗种子无性扩繁工作量大，需要的土地多，大量扩繁极易造成混杂或错误。本研究通过改进茶树早期单株乌龙茶品质鉴定的工艺，采用单株微量法制作乌龙茶小样，使茶树早期品质鉴定效率快速提高，工作量急剧减少，节约用地，减少错误，大大缩短育种周期。本研究通过4年时间完成了从种子到优良株系的筛选鉴定过程，最终获得5份品质优异、综合性状优良的新株系。

本研究所用的茶树早期单株鉴定方法快速而高效，从而能够实现在较大的群体中筛选出优异单株，此方法尤其适合自然杂交育种法，充分发挥茶树自然杂交育种的优势。人工杂交和自然杂交相比有其优势，因其亲本来源明确，所以对亲本的加工品质和农艺性状有较清晰的认识，对杂交后代的表现也有较高的预判，育种目标明确。缺点是茶树人工杂交种子不易获得，数量较少，同时人工杂交组合少，遗传多样性不够丰富。而茶树自然杂交优点是极易获得数量庞大的种子，同时杂交亲本更为多样，一个母本可以与多个性状优异的父本进行杂交，后代的遗传变异更为丰富。通过对大量自然杂交后代的筛选，往往可以获得更多性状优异的单株。本研究通过乌龙茶品种金牡丹与多个性状优异的父本自然杂交，获得大量种子，产生各种香型和农艺性状变异的单株。在感官品质审评过程中发现多个单株保持了母本金牡丹高香优质的特性，还发现了多个比母本香气更浓郁的含花果香单株，同时还筛选出多个与母本香型不同的单株，获得了多种香型变异单株。另外由于与金牡丹自然杂交的父本来源广泛，其后代的农艺性状变异更为多样化，为杂交育种提供了更多的选择材料，从中筛选获得了多个综合农艺性状优良的单株。

本研究在茶树育种中首次开展分子标记辅助筛选，利用SSR分子标记鉴定候选单株的遗传多样性，从而在较多的优良单株中筛选出相互间遗传距离更远的单株。此方法特别有助于从同一杂交组合后代中筛选遗传多样性高的单株，能够有效避免新选育品种遗传背景过于狭窄的问题^[10]。由于分子标记辅助筛选目标明确，能大大减少工作量和提高工作效率，已在多种作物育种中快速地应用与发展。但在茶树育种中分子标记辅助筛选却进展缓慢，造成这种现状是由诸多原因导致的，如优异性状连锁的分子标记知之甚少，控制重要性状的基因或QTL研究还处于初级阶段，茶树全基因组测序还未完成等等原因，加之茶树生育周期长等缺点，所以开展茶树分子标记辅助育种还有很长的路要走^[23]。近几年随着茶树科研经费的增加和从事茶树分子生物学的科研人员越来越多，相关科研成果也陆续增加^{[20-21, 24]}，相信在不久的将来茶树分子育种会得到快速的发展。