Re-identification of Tomato AP2/ERF Transcription Factors and Screening of Genes Related to Stress Resistance
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摘要:目的
本研究深入理解番茄AP2/ERF转录因子的组学特征及生物胁迫响应，促进其在番茄抗病育种中的应用。
方法利用最新公共数据进行AP2/ERF鉴定，结合番茄自交系在青枯菌侵染下的转录测序数据，挖掘青枯病抗性相关AP2/ERF。
结果173个番茄AP2/ERF转录因子家族成员被鉴定，主要成簇分布在染色体端部，50.3%的AP2/ERF具有共线性，尤其是3和8号染色体。基于系统进化关系，AP2亚家族包含22个（12.7%）成员，主要分为两类；ERF亚家族包含93个（53.8%）成员，可进一步分为六类；DREB亚家族包含49个（28.3%）成员，可进一步分为两类；RAV亚家族仅有3个成员。71对AP2/ERF同源基因的Ka/Ks值均小于1。26.8%的AP2/ERF主要在根中表达，几种生物胁迫下，ERF_4-6和DREB_2基因转录表达水平较高，尤其是Solyc03g005500.1（ERF_6）和Solyc08g078170.1（ERF_5）。青枯菌侵染下，在抗、感材料间筛选到10个差异表达AP2/ERF（分属AP2和ERF），其中Solyc06g068570.4（AP2）为正调控基因，其他9个为负调控基因。50.9%的AP2/ERF形成193对互作关系，尤其是Solyc01g096860.3（AP2_2）与Solyc08g078190.2（ERF_5），而Solyc06g068570.4（AP2）与Solyc03g093560.1（ERF_5）正负互作在番茄青枯病响应中可能发挥重要作用。
结论综合基因组分析和转录表达鉴定了番茄AP2/ERF转录因子，获得若干青枯病响应基因，丰富了番茄抗病育种基础理论和基因资源。
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关键词:
- 番茄 /
- AP2/ERF转录因子 /
- 基因组特征 /
- 生物胁迫 /
- 转录表达
Abstract:ObjectiveTo promote the germplasm application in tomato resistance breeding by gaining better insights on the genomic characteristics and biotic stress response of AP2/ERF transcription factors (TFs).
MethodAP2/ERF TFs were identified building on the recent release of genome data and genes related to bacterial wilt resistance were excavated, combined with the transcriptome sequencing of tomato inbred lines with Ralstonia solanacearum infection (RsI).
ResultA total of 173 AP2/ERF TFs were identified in tomato, which were mainly distributed in clusters at the ends of chromosomes, and 50.3% of them had collinearity, especially on chromosomes 3 and 8. Based on phylogenetic relationship, the AP2 subfamily contained 22 (12.7%) genes, which could be divided into two main categories; the ERF subfamily contained 93 (53.8%) genes and were further divided into six categories; the DREB subfamily contained 49 (28.3%) genes and were divided into two categories; and the RAV subfamily had only three genes. The Ka/Ks values of 71 pairs of tomato AP2/ERF homologs were all less than 1. 26.8% of AP2/ERF TFs were mainly expressed in roots, and the expression levels of genes in ERF_4-6 and DREB_2 categories were higher under several biotic stresses, especially Solyc03g005500.1 (ERF_6) and Solyc08g078170.1 (ERF_5). Ten differentially expressed AP2/ERF TFs (belonging to AP2 and ERF) were screened between resistant and susceptible tomato lines with RsI, of which Solyc06g068570.4 (AP2) was a positively regulated gene and the other nine were negatively regulated genes. 50.9% of tomato AP2/ERF TFs formed 193 pairs of interactions, of which the interaction between Solyc01g096860.3 (AP2_2) and Solyc08g078190.2 (ERF_5) was the most reliable, whereas the positive and negative interaction between Solyc06g068570.4 (AP2) and Solyc03g093560.1 (ERF_5) may play an important role in tomato response to bacterial wilt.
ConclusionTomato AP2/ERF TFs were comprehensively identified using genomic information and transcriptional expression, and several bacterial wilt response genes were obtained, which enriched the basic theory and genetic resources for tomato resistance breeding.
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0. 引言
【研究意义】兔出血症2型（rabbit hemorrhagic disease Type 2, RHD-2）是由兔出血症病毒2型（rabbit hemorrhagic disease virus serum type 2, RHdV-2）引起的一种新型高度接触传染性、急性致死性传染病。新型毒株的RHdV-2的感染性更强，感染范围更广，不同日龄和品种的家兔、野兔均可被感染[1−3]。RHD-2具有较高发病率和致死率[4]，且国内尚未研制出可靠的商品化疫苗供生产使用，一旦发病将严重影响养兔业的健康发展。当前，我国养兔规模化程度仍然十分低，散养户是养兔业的主力。散养户普遍存在技术力量弱、不会操作检测仪器等问题。RHdV-2感染已对我国养兔也造成了巨大经济损失，如何在养殖场特别是散养户进行快速准确的诊断对于科学防控该病具有十分重要的意义。通过建立快速且准确的检测方法，可以有效识别并控制传染源，从而防止疫情的进一步扩散。【前人研究进展】目前，重组酶介导的核酸等温扩增（recombinase aided amplification, RAA）与CRISPR/Cas13a技术联用在病原检测领域已逐渐展现出其巨大的应用潜力。该法先对目标序列进行RAA扩增以获得大量的检测模板，再利用CRISPR系统对其进行特异性识别以激活Cas13a蛋白来剪切反应体系中的荧光探针，从而实现对低载量样品的快速准确检测[5−6]。作为病原检测研究领域的一个热门方向，RAA-CRISPR/Cas13a检测方法通过结合RAA法和CRISPR/Cas13a技术，在灵敏度和特异性方面实现了显著提升。一些学者已经利用这种方法开发出了快速检测动物疫病病原微生物的新方法，如禽腺病毒 4 型[7]、猪流行性腹泻病毒[8]、口蹄疫病毒[9]和禽流感病毒[10]。虽然国内已经建立多种针对RHdV-2的诊断技术，但是均需要一定的专业知识和仪器设备，难以在养殖场一线应用。有研究根据RHdV-2的保守序列VP60，建立了实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）检测方法[11]，酶联免疫吸附技术（enzyme Linked Immunosorbent assay, ELISA）也可用于检测RHdV-2抗原或抗体[12]，这些方法虽然其灵敏度和特异性也较好，但它们均需较为昂贵的配备仪器和过长的反应时间。【本研究切入点】本实验室前期建立了基于RAA的侧流层析试纸（lateral flow device, LFD）方法[13]，用于RHdV-2的特异性检测，然而RAA的扩增效率易受引物设计、模板序列及其他因素的制约，限制了其检测灵敏度和稳定性。近年来，CRISPR-Cas核酸酶的精准切割特性为核酸检测提供了新的技术突破，多项研究[14−15]通过联合RAA与CRISPR-Cas系统，显著提升了检测的灵敏度和特异性，并结合LFD实现了检测结果的可视化。基于此，本研究创新性地整合了RAA与CRISPR/Cas13a技术，首次建立了一种兔出血症病毒2型可视化诊断方法RAA-CRISPR/Cas13a(cpf1)-LFD。【拟解决的关键问题】本研究在本实验室前期研究的重组酶等温扩增结合侧流层析试纸条方法[13]的基础上，结合CRISPR/Cas13a技术，建立了新的RHdV-2检测方法，这种方法具备高度的灵敏度和特异性，操作简单，可实现在实验室和基层养殖场现场的快速检测，同时利用LFD实现结果可视化，为RHdV-2的诊断提供高效准确的检测方法。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 重组质粒与临床样本
RHdV-2（KU991797.1）VP60重组质粒、RHdV-1（DQ205345.1）VP60重组质粒均由擎科股份有限公司进行合成。31份临床样本由本实验室保存，来自闽侯、武平、大田、连江等多个兔场，病兔主要表现急性死亡，实质器官有出血，采集脾脏淋巴结等实质器官。
1.1.2 主要试验试剂
总RNA提取试剂盒（ER501-01）（北京全式金生物有限公司）；RAA核酸扩增试剂盒，RAA核酸扩增试剂盒（试纸条法）（T00R01)（江苏奇天基因生物科技有限公司）；一次性核酸检测试纸条（JY0301，北京宝盈同汇生物技术有限公司）；1xPBS（兰杰柯科技有限公司）；LwaCas13a蛋白（C2C2）（广州美格生物有限公司）；HiScribeT7快速高效 RNA 合成试剂盒（New England Biolabs）；重组RNase抑制剂（荷瑞生物）；RNA纯化试剂盒（DP412，天根生物有限公司）；LwaCas13a 10×reaction buffer：200 mmol·L−1 HEPES-NaOH（pH6.8），600 mmol·L−1 NaCl，60 mmol·L−1 MgCl2，10 mmol·L−1 DTT。
1.2 试验方法
1.2.1 RAA引物、crRNA设计与合成
RAA特异性引物和RAA-LFD探针按照文献[13]报道的序列合成。在已扩增的特异且保守序列范围内，首先识别符合条件的PAM序列，继而设计长度为20～23 nt的间隔区序列构成LwaCas13a-crRNA，间隔区序列位于PAM序列之后，同时确保LwaCas13a-crRNA目标序列内3'端的PFS序列由A、C、U组成，且目标序列不与RAA引物重叠，最终，将间隔区序列进行Blast分析比对确定其保守特异性。crRNA的单链DNA（即ssDNA）由擎科股份有限公司进行合成。
Lwacas13a-crRNA合成步骤：将crRNA的单链DNA作为模板与相应引物通过PCR扩增获得大量crRNA的双链DNA（即dsDNA），使用琼脂凝胶回收试剂盒回收目的条带进行纯化，纯化产物通过T7 HiScribe T7高效RNA合成试剂盒37 ℃过夜转录，转录产物使用RNA纯化试剂盒纯化后通过nanodrop 2000测定RNA浓度置于−80 ℃保存。CRISPR-Cas13a相关序列见表1。
表 1 CRISPR-Cas13a crRNA及相关引物Table 1. CRISPR-Cas13a crRNA and related primers基因
Genes序列5'-3'
Sequences (5’-3’)Cas13a crRNA1 TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACACTCATAAGCCTGCATGGTCGTGACGTA Cas13a crRNA2 TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGGTGGTGGTGGGTTGGGGGTTGCTCGGT 斜体为T7启动子序列，下划线碱基为重复序列区。
The italicized sequence represents the T7 promoter, and the underlined bases indicate the repetitive sequence region.PCR 25 μL反应体系：2×San Taq PCR Master Mix （含蓝色染料）12.5 μL，crRNA-dsDNA 1 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol·L−1），ddH2O 9.5 μL。PCR反应过程：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。
转录体系：T7 mix 2 μL，NTP mix 10 μL，模板1 μg，ddH2O补齐至20 μL。
1.2.2 RAA-LFD反应体系
根据RAA核酸扩增试剂盒说明书，选择50 μL体系进行扩增。反应体系为：缓冲液25 μL，纯水15.7 μL，正向与反向引物各取2.1 μL，探针取0.6 μL，乙酸镁（280 mmol·L−1）2.5 μL，模板3 μL。
1.2.3 Cas13a试纸条法反应条件的确立
（1） RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD体系优化。1.5 μL crRNA（300 ng·μL−1）与50 nmol·L−1 Cas13a蛋白进行反应，选择反应效果最佳体系为CRISPR-Cas13a反应体系。该体系的总体积为50 µL，包括以下成分：10×反应缓冲液5 µL，crRNA（浓度为300 ng·µL−1）1.5 µL，探针（浓度为10 μmol·L−1）2 µL，模板2.5 µL，LwaCAS13a蛋白（浓度为1 μmol·L−1）3.5 µL，NTP混合物2.5 µL，RNA酶（浓度为300U·µL−1）5 µL，T7混合物0.5 µL，以及双蒸水27.5 µL。
（2）RAA-CRISPR/Cas13a-LFD反应时间优化。基于上述Cas13a体系对RAA-CRISPR/Cas13a-LFD反应时间进行优化，每5 min一个间隔，设置反应时间为10～25 min，Cas13a试纸条法通过试纸条观察结果。
1.2.4 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD试纸条法检测敏感性的评价
RHdV-2 VP60重组质粒经检测其质粒浓度为6.7×103 copies·μL−1，用1×PBS梯度稀释得到6.7×103、6.7×102、6.7×101、6.7×10−1、6.7×10−2 copies·μL−1 5个浓度梯度，以不同浓度的重组质粒为模板进行扩增，扩增产物与Cas13a蛋白以及crRNA等试剂再进行一定时间恒温反应，反应产物经LFD显示，分析敏感性试验结果。
1.2.5 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD检测RHdV-2特异性评价
RHdV-2 VP60重组质粒（6.7×105 ng·μL−1）、RHdV-1 VP60重组质粒（6.7×105 ng·μL−1）为模板进行RAA扩增，产物与Cas13a蛋白以及crRNA再进行一定时间恒温反应，反应产物经LFD显示。
1.2.6 RNA的提取
根据总RNA提取试剂盒说明进行操作提取，具体步骤：将单份临床兔病料75 mg与1 mL Trans Zol混合并研磨裂解样品，后加入200 μL RNA Extraction Agent，振荡混匀5 min后放于4 ℃高速离心机10 000 r·min−1离心15 min；吸取无色水相部分与同体积无水乙醇混合后加入离心柱后离心；重复加入CB9（500 μL）并离心；重复加入WB9（500 μL）并离心；离心去除剩余乙醇，使用75 μL纯水洗脱后，将提取的RNA保存于-80 ℃保存。
1.2.7 临床样品的检测
提取31份临床样本病料的总RNA，应用建立的RAA-CRISPR/Cas13a(Cpf1)-LFD 法分别对31份临床样品进行RAA扩增反应，扩增产物经LFD显示结果。
2. 结果与分析
2.1 Cas13-crRNA筛选结果
分别以crRNA1和crRNA2为探针对同一阳性样本进行检测，结果如图1A和图1B所示，crRNA1显示出更明显的检测线（T线），并且Image J定量分析（图1C）可见crRNA1与crRNA2之间的信号强度差异显著（P＜0.05），说明crRNA1具有更高的信号强度。综上后续选择crRNA1进行试验。
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图 1 Cas13a-crRNA筛选结果A：试纸条；B：Image J定量图；C：样品条带定量柱状图。1：crRNA 1；2: crRNA 2；N：阴性对照。C：质控线；T：检测线；* 表示与对照相比差异显著 P ＜ 0.05。Figure 1. Cas13-crRNA screening resultsA: test strip image; B: image J quantification graph; C: sample band quantification bar chart. 1: crRNA1; 2: crRNA2; N: negative control. C: quality control Line; T:test line; * indicates a statistically significant difference with control (P ＜ 0.05).2.2 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD反应时间优化
从图2中可以看出，在RAA基础反应30 min后，仅再需10 min，RAA-CRISPR/Cas13a(Cpf1)-LFD即可检测出RHdV-2，且显色明显，从量化柱状图可知，反应时间为10 min时，数值最高（P＜0.05），综合分析可知10 min时即可达到较佳检测效果，故后续反应时间均釆用10 min。
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图 2 不同反应时间RAA-CRISPR/Cas13a(Cpf1)-LFD扩增产物A：试纸条图；B：Image J定量图；C：样品条带定量柱状图。10、15、20、25分别为 10、15、20、25 min 扩增产物； N阴性对。C：质控线；T：检测线；*表示与对照相比差异显著（P ＜ 0.05）。Figure 2. Analysis of RAA-CRISPR/Cas13a(Cpf1)-LFD amplification products at different reaction timeA: test strip image; B: image J quantification graph; C: sample band quantification bar chart. 10, 15, 20, 25: amplification products for 10, 15, 20, 25 min with the standard plasmid as template; N: negative control. C: quality control line; T: test line; * indicates significant difference with control (P ＜ 0.05).2.3 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD敏感性
Cas13a试纸条法对RHdV-2 RNA最低可检值可达6.7×101 copies·μL−1，结合量化结果（图3）综合分析在质粒浓度为6.7×101 ng·μL−1时阳性结果最亮且数值最高（P＜0.05），阴性对照结果为阴性。
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图 3 Cas13a敏感性试验结果A：试纸条图；B：Image J定量图;B：样品条带定量柱状图。1：6.7×103 copies·μL−1；2：6.7×102 copies·μL−1；3：6.7×101 copies·μL−1；4：6.7×10−1 copies·μL−1；5：6.7×10−2 copies·μL−1；N：阴性；* 表示与对照相比差异显著（P ＜ 0.05）。Figure 3. Sensitivity test results about Cas13aA: test strip image; B: image J quantification graph; C: sample band quantification bar chart. 1: 6.7×103 copies·μL−1; 2: 6.7×102 copies·μL−1; 3: 6.7×101 copies·μL−1; 4: 6.7×10−1 copies·μL−1; 5: 6.7×10−2 copies·μL−1; N: negative control; * indicates significant difference with control (P ＜ 0.05).2.4 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD特异性试验结果
如图4可知，RHdV-1结果为阴性，RHdV-2在试纸条检测中呈现强阳性，因此所建立的方法特异性优异。
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图 4 Cas13特异性检测结果A：试纸条图；B：Image J定量图； B：样品条带定量柱状图。1：RHdV-2；2：RHdV-1；N：阴性对照；*表示与对照相比差异显著（P ＜ 0.05）。Figure 4. Cas13a specific test resultsA: test strip image; B: image J quantification graph; C: sample band quantification bar chart. 1: RHdV-2; 2: RHdV-1; N: negative control; * indicates significant difference with control (P ＜ 0.05).2.5 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD法检测结果
对31份不同兔场收集的病死兔脾脏组织进行RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD试纸条检测，如图5可知，所有样品在C位置均有条带，表明所有样品均合格，样品4、10、13、15、18、19、22、24、27、29在T位置出现了较为明显的条带，并且Image J定量分析（图5C）可见样品4、10、13、15、18、19、22、24、27、29的条带强度与其他样品相比差异显著（P＜0.05），表明样品4、10、13、15、18、19、22、24、27、29均为阳性样品，RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD法的阳性检出率为30.3%。
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图 5 RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD临床样品检测结果A：试纸条图；B：Image J定量图；C：样品条带定量柱状图。1～31分别为样品编号； N为阴性对照；*表示与对照相比差异显著（P ＜ 0.05）。Figure 5. Clinical samples detected by RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFDA: test strip image; B: image J quantification graph; C: sample band quantification bar chart. 1—31 are sample numbers; N: negative control; * indicates significant difference with control (P ＜ 0.05).3. 讨论与结论
自2010年在法国首次发现RHdV-2以来[4]，该病毒已在全球范围内流行。2020年，中国四川省首次报告了RHD2病例[16]。RHdV-2对养兔业构成严重威胁，但目前缺乏有效的商业疫苗。因此，开发可靠的病原学检测技术对于控制RHdV-2传播、减轻其对养兔业和生态系统的影响至关重要。
王波[17]在其研究中建立的检测RHdV-2的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测限度达到68个拷贝数，而本研究中我们构建的RHdV-2核酸试纸条检测方法对兔出血症病毒RNA的最低检测限为6.7×101 copies·μL−1，说明本研究建立的方法灵敏度与实时荧光定量RT-PCR方法相当。同时，应用该方法进行检测，结果显示RHdV-1结果为阴性，RHdV-2则呈现强阳性，说明该方法特异性良好，与RHdV-1血清型核酸无交叉反应。本研究使用新建立的RAA-CRISPR/Cas13a (Cpf1)-LFD方法对本实验室前期研究中保存的31份疑似阳性临床样品[13]进行检测后，阳性率从19.2%提高到了30.3%，说明新方法在检测RHdV-2方面具有更高的有效性和准确性。近年来，关于RHdV-2检测方法的研究主要集中在RT-PCR技术上。尽管部分研究[18−19]开发的检测方法能够达到1×101 copies·μL−1的高灵敏度，但这些方法通常需要较长的反应时间，并且依赖于专业设备来判读结果，这限制了它们在临床快速检测RHDV-2中的应用。相比之下，本研究建立的检测方法在40 min内即可完成，并且通过试纸条直接显示结果，使得结果判读变得快速且直观。但本研究建立的方法也存在不足之处，反应过程中需要开盖转移RAA反应产物作为体系中的模板，易产生气溶胶污染。目前已有RAA-CAS一管反应法，将RAA反应试剂与Cas相关试剂一次性加入一个管内，反应时间相应缩短，减少气溶胶污染。然而，一管法灵敏性较低，这可能与RAA中反应蛋白酶接触Cas相关试剂影响了蛋白酶的活性，后期是否可以通过改变体系内试剂浓度进行一管反应还需进一步研究。
本研究前期通过RHdV两种血清型基因组对比，发现RHdV-2的VP60基因最为保守，将其设定为检测靶序列，合成特异性引物，建立了RAA-CRISPR/Cas13a(cpf1)-LFD检测方法。该方法具有敏感性强、特异性高、操作简易等优点，可实现对RHdV-2快速检测，可为RHdV-2的预防与早期诊断、控制提供便捷技术，规避兔养殖业面临巨大疫病风险，助力养兔业蓬勃发展。
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图 1 番茄AP2/ERF转录因子的理化特征(A)和亚细胞定位(B)
Figure 1. Physicochemical characteristics (A) and subcellular localization (B) of AP2/ERF TFs in tomato
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图 4 番茄AP2/ERF在不同组织部位(A)和病菌侵染下(B)的相对表达
A. 栽培番茄Heinz1706芽、花、叶、根和不同发育阶段果实(1-3 cm、绿熟期、破色期和破色后10 d)中基因的表达。B. flgII-28 6 h: 细菌鞭毛蛋白侵染. 不同丁香假单胞菌菌株侵染.荧光假单胞菌侵染.恶臭假单胞菌侵染.根癌农杆菌侵染.
Figure 4. Expression profile of AP2/ERF TFs in different tissues (A) and with pathogen infection (B) in tomato
A.The expression of genes in the buds, flowers, leaves, roots, and fruits at different developmental stages (1-3 cm, green maturity stage, color break stage, and 10 days after color break) of cultivated tomato Heinz1706. B.flgII-28 6 h: Bacterial flagellar protein infection. Infection of different strains of P. syringae. Infection by P. fluorescens. Infection by odorous pseudomonas. Infection of A. tumefaciens.
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图 5 番茄青枯菌侵染下差异表达AP2/ERF
R和S分别代表抗、感番茄自交系，Mock和RsI分别表示对照和青枯菌侵染。*、**和***分别表示FDR＜0.05、FDR＜0.01和FDR＜0.001，不同大、小写字母分别表示P＜0.01和P＜0.05水平上的差异显著性。
Figure 5. Transcriptionally DE AP2/ERF TFs with RsI in tomato
R and S represent resistant and susceptible tomato inbred lines, Mock and RsI represent a control and R. solanacearum infection, respectively. *, **, and *** indicate FDR＜0.05, FDR＜0.01, and FDR＜0.001, respectively. Different uppercase and lowercase letters indicate significant differences at P＜0.01 and P＜0.05 levels, respectively.
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