近年来随着畜禽养殖业集约化、规模化的发展，畜禽粪污已经成为农业面源污染的重要来源。将高浓度的畜禽养殖粪污水进行厌氧处理产生沼气已成为粪污前期处理的主要方式，然而沼气发酵的效率受温度影响较大，低温抑制了发酵微生物的生理活性，导致产气效率急剧下降，成为畜禽养殖废水厌氧处理工程发展的障碍。耐低温高效产沼气厌氧发酵菌群的构建选育，是解决低温发酵效率低的关键技术环节。

沼气厌氧发酵体系生态结构复杂，其中大多微生物种类用传统的纯培养方法难以获得。分子生物学诸如高通量测序技术在微生物生态学方面的引入，促进了沼气厌氧发酵体系中物种、结构、功能和遗传多样性研究的迅猛发展，极大地丰富了实验研究的信息量^{[1, 2, 3, 4, 5, 6]}。

本研究从采集的样品中富集获得了耐低温厌氧发酵菌群5#，将其用猪粪污水厌氧驯化获得可在15℃产沼气的菌群Y5S。采用高通量测序技术，分析比较菌群5#、Y5S以及猪粪厌氧污水中原始菌群YJ的原核微生物群落结构，以揭示它们之间共性的菌群组分，进一步明确低温环境中菌群的状况与产沼气的关系，为构建稳定高效的低温产甲烷复合体系、优化调控微生物种群提供技术支持。

采集来自福州仓山区某农户家中已放置一年，自然干燥的干牛粪，作为富集耐低温厌氧菌群的样品。养猪污水来自福建光华农牧科技开发有限公司污水处理工程。

甲烷菌富集分离培养基，见参考文献[7]。

将采集的固体干牛粪样品，按1:5的料液比接入甲烷菌富集分离培养基厌氧培养，在室温(约25℃)下可产气后置于生化培养箱，逐渐降低温度至15℃，驯化培养至产气后，按20%接种量进行传代富集培养，获得耐低温厌氧菌群。

该菌群再接入养猪污水，在15℃生化培养箱再进行厌氧驯化培养。

养猪污水取样500 mL在15℃生化培养箱厌氧培养。

取富集培养物，8 000 r·min^-1离心15 min，倾去上清，收集菌体，用TENP缓冲液(50 mmol·L^-1 Tris，20 mmol·L^-1 EDTA，100 mmol·L^-1 NaCl，0.01 g·mL^-1 PVP，pH 10)洗涤至基本无色，去除腐殖质，再用PBS 缓冲液(8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na₂HPO₄，0.24 g KH₂PO₄，溶于1 L水，pH 7.4)洗涤菌体2次；采用CTAB/NaCl法^[8]提取菌株基因组DNA。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对提取的DNA进行PCR 扩增。将扩增后的DNA 产物送至上海锐翌生物科技有限公司采用Illumina MiSeq高通量测序技术分析微生物群落结构。

通过IlluminaMiseq平台对16S rDNA高变区V3~V4区进行测序；采用pandaseq软件利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads拼接成1条序列，得到高变区的长reads。然后对拼接后的reads进行质量控制处理：(1) 去除平均质量值低于20的reads；(2) 去除reads含N的碱基数超过3个的reads；(3) reads长度范围为220~500 nt。从而获取clean reads^[9]。

将序列完全一样的clean reads归为1种tag，把拼接的Tags中的singletons(对应reads只有1条的序列)过滤掉，利用usearch软件在97%相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物种分类的OTU，将所有clean reads比对到OTU序列上，将能比对上OTU的reads提取出来，得到最终的mapped reads。使用Qiime软件，做alpha多样性指数的稀释曲线，根据稀释曲线选择合理的参数进行抽平。

从各个OTU中挑选出丰度最高的1条序列，作为该OTU代表序列，用RDP方法，与已知物种的16S数据库(GreenGenes，http://greengenes.lbl.gov)进行比对，从而对每个OTU进行物种归类。归类后，根据每个OTU中序列的条数，从而得到OTU丰度表。

在门、纲、目、科、属水平，将每个注释上的物种或OTU在不同样品中的序列数进行整理，形成profiling柱状图及统计表。

利用QIIME软件计算样品的Alpha多样性值，并利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个(n小于测得Reads序列总数)Reads时各Alpha指数的期望值，然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列)与其相对应的Alpha指数的期望值做出稀释曲线。

干牛粪所得的样品，用甲烷菌培养基培养，经逐渐降低温度驯化25 d，在15℃产气可燃。随后用甲烷菌培养基进行继代培养富集，可稳定产气。该菌群编号为5#菌群。将5#菌群接入养猪污水，在15℃生化培养箱再进行驯化培养，培养5 d就可以产气，甲烷含量21.6%~38.6%，获得可适应养猪污水厌氧处理的驯化菌群Y5S。

养猪污水不加任何外来菌群，置于15℃生化培养箱培养，未能产生沼气，形成的菌群编号为YJ。

将5#、Y5S和YJ 3个菌群进行高通量测序，分析其菌群结构。

统计各个样品每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。3个样品共产生810个OTU，5#菌群、Y5S菌群和YJ菌群分别产生221、495、666个的OTU(表 1)。

表1(Table 1)

表 1 样品数据和OTU统计Table 1 Dataand OTU for statistical analysis on samples 样品号 标签 序列 嵌合体 嵌合体比例 /% 比对 片段数 可操作 分类单元 5 86968 1279 1.470656 71875 221 Y5S 122604 624 0.508956 77151 495 YJ 116048 219 0.188715 72166 666

表 1 样品数据和OTU统计 Table 1 Dataand OTU for statistical analysis on samples

根据3个样品的共有OTU以及OTU所代表的物种，找到核心种群(Core microbiome，覆盖100%样品的微生物组)85个，除去未知菌，均属于厚壁菌门Firmicutes的梭菌纲Clostridia，下属3个目，即梭菌目Clostridiales、拟杆菌目Bacteroidales和红蝽菌目Coriobacteriales。在属分类水平上3个菌群共有的原核微生物为：醋酸杆菌属Acetobacterium、柠檬酸杆菌属Citrobacter、梭菌属Clostridium、脱硫叶菌属Desulfobulbus、脱硫微菌Desulfomicrobium、噬氢菌属Hydrogenophaga、颤螺旋菌属Oscillospira、Parabacteroides、瘤胃球菌属Ruminococcus、Sedimentibacter、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、硫磺单胞菌属Sulfurospirillum、互营单胞菌属Syntrophomonas、明串珠菌属Trichococcus和Devosia等。

在97%的相似度下，得到了每个样品的OTU个数，Venn图展示了3个样品共有和各自特有OTU数目，直观展示样品间OTU的重叠情况。5#菌群和YJ菌群有92个共有的OTU；5#菌群和Y5S菌群有95个共有的OTU；YJ菌群和Y5S菌群有462个共有的OTU(图 1)。

图1(Figure 1)

图 1 5#、YJ和Y5S三个菌群的OTU venn分析 Fig. 1 OTU venn analysis on microflora groups of #5,YJ,and Y5S

在门分类水平中，3个菌群中均含有厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门 Bacteroidetes、互养菌门 Synergistetes、变形菌门 Proteobacteria、螺旋体门Spirochaetes和疣微菌门Verrucomicrobia。

5#菌群的Firmicutes丰度占比为83.26%，占绝对优势，Bacteroidetes丰度占比6.07%，Synergistetes占3.99%，Spirochaetes占3.58%，Proteobacteria占2.98%。YJ菌群Firmicutes丰度占比57.16%，Proteobacteria占18.83%，Bacteroidetes占10.58%，Actinobacteria占5.42%，Synergistetes占3.23%，Chloroflexi占1.47%。Y5S菌群Firmicutes丰度占比50.88%，Synergistetes占37.68%，Bacteroidetes占6.07%，Proteobacteria占3.97%。3个菌群均以厚壁菌门Firmicutes占最大优势。

5#菌群中的广古菌门Euryarchaeota在其他2个菌群中未检测到，可能甲烷菌含量较低，或应该采用古菌通用引物PCR扩增进行分析。在5#菌群中，Euryarchaeota丰度占比只达到0.05%，显示的是甲烷微菌目Methanomicrobiales甲烷粒菌科Methanocorpusculaceae Methanocorpusculum属。

在属分类水平上，5#菌群以梭菌目Clostridiales消化链球菌科Peptostreptococcaceae的未知属占绝对优势，丰度占比为66.09%。YJ菌群中的梭菌科Clostridiaceae的梭菌属Clostridium丰度占比只有7.74%，这是该菌群中最高的菌属丰度占比，梭菌目Clostridiales中的互营单胞菌科Syntrophomonadaceae中的互营单胞菌属Syntrophomonas丰度占比仅为7.36%。可是经驯化的Y5S菌群则以互养菌门Synergistetes Synergistia纲Synergistales目Synergistaceae科未知属占优势，丰度占比达到34.90%，其次是厚壁菌门Firmicutes的梭菌科Clostridiaceae、消化链球菌科Peptostreptococcaceae和肉杆菌科Carnobacteriaceae丰度占比分别为13.36%、10.30%和9.75%。YJ菌群多样性最丰富，驯化后的菌群与未驯化的菌群结构相差极大(图 2)。

图2(Figure 2)

图 2 在门、科和属分类水平中不同组的物种profiling柱状图 Fig. 2 Taxonomic classifications of phylum,class,and genus of bacteria communities of group #5,YJ,and Y5S

芮俊鹏等^[10]分析了7 个省市的13 个猪粪原料沼气工程的菌群，厚壁菌门Firmicutes是主导微生物，其次为拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria和绿弯菌门Chloroflexi。在属的分类水平上，梭菌属Clostridium sensustricto是最主要的属。冯蕾等^[11]在羊粪低温沼气发酵优势细菌结构多样性的研究中发现，经过富集培养后，微生物种群的多样性及特异性发生了很大的变化，沼气池中的优势细菌为梭菌目Clostridiales和互养菌属Syntrophus。赵光等^[12]对寒地沼气池微生物群落解析发现优势菌群有厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes及变形菌门Proteobaeteria。本试验结果与以上报道相似，未经驯化的低温状态下的养猪污水YJ菌群以厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes为优势菌群。

值得关注的是，原始污水的菌群YJ在加入5#菌群驯化后得到的Y5S菌群里互养菌门Synergistetes的丰度占比大大提高。在科分类水平上，Y5S菌群以互养菌门Synergistetes中的Synergistaceae科占优势，丰度占比达到34.9%，超过厚壁菌门Firmicutes的梭菌科Clostridiaceae、消化链球菌科Peptostreptococcaceae和肉杆菌科Carnobacteriaceae。5#和Y5S菌群均可以在低温(15℃)下产沼气，互养菌门 Synergistetes在其中起的作用应该引起注意，可能表明互养菌门的细菌是影响沼气工程系统产甲烷效率的一个重要生物因素。

孔维涛等^[13]对低温产沼气优势甲烷菌群进行了分析，推测甲烷八叠球菌属是低温环境下维持沼气池正常产气的关键菌属。但是也有研究^{[14, 15, 16, 17]}发现低温环境下运行的反应器内产甲烷微菌为优势菌属。在5#菌群中也检测到甲烷微菌目的Methanocorpusculum属。但本次试验未采用古菌通用引物PCR扩增和分析古菌的群落结构，这方面的实验研究正在进行中。

本研究分析了由牛粪采集的样品中富集驯化得到的耐低温厌氧菌群5#、养猪污水低温状态下的菌群YJ，以及由5#和YJ两者驯化培养的菌群Y5S的菌群结构，得知3个菌群中均含有厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门 Bacteroidetes、互养菌门 Synergistetes、变形菌门 Proteobacteria、螺旋体门Spirochaetes和疣微菌门Verrucomicrobia。均以厚壁菌门Firmicutes占最大优势。其共有的核心种群有85个，属厚壁菌门Firmicutes的梭菌纲Clostridia。在属分类水平上3个菌群共有的原核微生物为：醋酸杆菌属Acetobacterium、柠檬酸杆菌属Citrobacter、梭菌属Clostridium、脱硫叶菌属Desulfobulbus、脱硫微菌Desulfomicrobium、噬氢菌属Hydrogenophaga、颤螺旋菌属Oscillospira、Parabacteroides、瘤胃球菌属Ruminococcus、Sedimentibacter、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、硫磺单胞菌属Sulfurospirillum、互营单胞菌属Syntrophomonas、明串珠菌属Trichococcus和Devosia等。

在属分类水平上，经驯化可在低温(15℃)产生沼气的Y5S菌群以互养菌门Synergistetes中的Synergistaceae科未知属占优势，丰度占比达到34.69%。互养菌门Synergistete的微生物有可能是沼气生物系统中影响产甲烷效率的一个重要因素。

菌群分析是沼气发酵系统中变化评估的重要指标，它能较全面地指示系统中微生物的多样性及其功能，对于阐明各种微生物在沼气发酵生态系统中的作用具有重要指导意义。深入了解菌群间的构成及其相互作用，有助于建立基于活性菌群变化的调控手段，从而提高沼气系统的发酵效率及产甲烷量，实现对沼气发酵过程的调控。