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  福建农业学报  2016, Vol. 31 Issue (5): 475-479  DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2016.05.007
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苏江。培养基渗透压对铁皮石斛原球茎生长和多糖含量的影响[J]. 福建农业学报, 2016, 31(5): 475-479. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2016.05.007.
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SU J. Effect of Osmotic Pressureon Growth and Polysaccharide Accumulation of Dendrobium Candidum Protocorms on Culture Medium[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2016, 31(5): 475-479. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2016.05.007.
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基金项目

广西教育厅项目(2013YB207);广西高校重点实验室桂西北特色资源研究与开发实验室资助项目(桂教科研[2006]6号);国家级大学生创新创业训练计划项目(201410605045)

作者简介

苏江(1980-),女,硕士,讲师,主要从事植物组织培养及相关的生物技术研究工作

文章历史

收稿日期:2016-03-21 初稿
2016-04-20 修改稿
培养基渗透压对铁皮石斛原球茎生长和多糖含量的影响
苏江    
河池学院化学与生物工程学院, 广西 宜州 546300
摘要: 以无菌铁皮石斛原球茎为材料,于培养液中分别添加不同浓度的甘露醇以调节其渗透压,研究不同甘露醇浓度对铁皮石斛原球茎生长及多糖含量的影响。结果表明:添加低浓度的甘露醇可促进铁皮石斛原球茎生长及增加多糖含量,添加高浓度的甘露醇能明显抑制铁皮石斛原球茎生长及降低多糖含量。在不同的培养时间,当甘露醇质量浓度为0~20 g·L-1时,原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量总体呈上升趋势,当甘露醇质量浓度超过20 g·L-1,原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量呈下降趋势。培养后35 d,各处理的原球茎干重、多糖含量和多糖产量均达最大值,且甘露醇质量浓度为20 g·L-1的处理其干重、多糖含量和多糖产量均高于对照和其他处理,分别为17.30 g·L-1、361.52 mg·g-1和6255.38 mg·L-1
关键词: 铁皮石斛    原球茎    多糖    渗透压    甘露醇    
Effect of Osmotic Pressureon Growth and Polysaccharide Accumulation of Dendrobium Candidum Protocorms on Culture Medium
SU Jiang    
School of Chemistry and Bioengineering, Hechi University, Yizhou, Guangxi 546300, China
Abstract: Effect of osmosis onthe growth of and polysaccharide accumulation in theprotocorms of Dendrobium candidum on a culture medium were studied.The liquid medium wasadded with mannitolat varied concentrations to alter theosmotic pressure for the experiment. The results showed that,at low concentrations of mannitol, the growth andpolysaccharide synthesis ofthe protocorms were enhanced,but significantly inhibited at high concentrations. During the cultivation,the vigor, growth, polysaccharidecontent, andyield of the protocormsincreased when the mannitol concentration in the medium was 0-20 g·L-1.After 35d culturein the medium with 20 g·L-1 mannitol,the dry weight, polysaccharide content, andyield ofthe protocormspeaked with the maximized values of 17.30 g·L-1, 361.52 mg·g-1, and 6255.38 mg·L-1, respectively. However,when the mannitol concentration was raised to 30-40 g·L-1,all of those indices hit a downward trend suggesting the high osmotic pressure could be detrimental to theprotocorm cultivation.
Key words: Dendrobiumcandidum    protocorm    polysaccharide    osmotic pressure    mannitol    

铁皮石斛Dendrobium Candidum,为兰科石斛属多年生附生草本植物,是我国传统中药材,主要产于四川、云南、广西以及长江流域等地。铁皮石斛的主要药效成分是多糖,具有较强的抗肿瘤、增强免疫功能活性、清胃热、助消化等重要功能。铁皮石斛的自然生长条件十分苛刻,加上长期过度开采,野生资源现已濒临灭绝。目前市场上的绝大部分铁皮石斛是应用植物组织培养技术快速繁殖试管苗并且人工栽培所得,但由于试管苗根系纤弱,移栽后对生长环境要求苛刻,生长周期较长,如果仅靠试管苗移栽的方式是很难满足市场发展的需要,因此寻找一个药效相似的全植株替代药源尤为重要,而采用原球茎大规模液体培养技术,生产中草药细胞是解决铁皮石斛全植株替代药源的最佳途径。

陈晓梅等[1]研究发现,铁皮石斛原球茎和铁皮石斛的化学成分相似,石斛多糖是二者的共有成分;何铁光等[2]的研究表明铁皮石斛原球茎多糖含量与野生铁皮石斛的相当;高建平等[3]的研究发现铁皮石斛原球茎对于机体非特异性免疫功能和细胞免疫功能的调节强度与原药材强度相似。因此,以原球茎作为铁皮石斛全植株的替代药源是可行的。关于铁皮石斛原球茎培养条件,前人进行了较多的研究,但大多集中在基本培养基成分基础上,各种植物激素和有机添加物浓度对铁皮石斛原球茎增殖、生长和多糖积累的影响[4, 5, 6],关于培养液渗透压对铁皮石斛原球茎生长及多糖合成影响的研究还鲜有报道。

本试验以甘露醇作为铁皮石斛液体培养基的渗透压调节剂,研究不同浓度的甘露醇对铁皮石斛原球茎生长及多糖合成的影响,旨在为铁皮石斛原球茎大规模液体培养生产铁皮石斛药源及多糖提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料

试验材料为铁皮石斛种子经无菌播种得到的原球茎,由河池学院微生物及植物资源开发利用实验室提供。

1.2 原球茎培养方法

以1/2MS+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖为基础培养基,按甘露醇质量浓度为0(CK)、10、20、30、40 g·L-1分别添加于液体培养基中以调节渗透压,并形成5个不同的处理,分别以10、20、30、40、50 g·L-1表示各处理。将无菌原球茎按2.0~2.5 g的接种量分别接种在装有30 mL培养基的100 mL三角瓶中,每处理接种90瓶,于温度(25±2)℃,光强1 500~2 000 lx,摇床转速为110 r·min-1的条件下进行培养。

1.3 测定项目及其方法

于培养后15、25、35、45 d每处理取15瓶,并分别测定各处理原球茎活力、鲜重、干重、多糖含量和多糖产量。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定原球茎活力,并以四氮唑还原强度[mg·(g.h)-1]表示。

原球茎鲜重和干重测定:将铁皮石斛原球茎与培养液过滤分离,再将原球茎置于三角瓶中,用自来水冲洗后过滤,反复冲洗5次,用吸水纸吸干原球茎表面上的水,称重即得鲜重,将原球茎在105℃烘30 min后调至60℃烘24 h,称得原球茎干重。分别按下式计算原球茎鲜重和干重,即

$原球茎鲜重/\left( {{\rm{g}} \cdot {{\rm{L}}^{{\rm{ - 1}}}}} \right){\rm{ = }}称量所得鲜重/培养液总体积$
$ 原球茎干重/\left( {{\rm{g}} \cdot {{\rm{L}}^{{\rm{ - 1}}}}} \right){\rm{ = }}称量所得干重/培养液总体积 $

多糖含量和多糖产量测定:用热水浸提法提取原球茎多糖,即准确称取铁皮石斛原球茎干品粗粉1.000 mg用滤纸和脱脂纱布包好,先经石油醚(60~90℃)在索氏提取器中于85℃的水浴中回流脱脂1.5 h,再用80%乙醇在95℃水浴中回流3 h,取出滤纸包置于105℃烘干箱中烘干(约30 min)。把药渣和滤纸包一起置于150 mL的三角瓶中,加入蒸馏水50 mL,于80℃水浴提取3 h,趁热过滤100 mL容量瓶,定容至刻度,摇匀,即得铁皮石斛原球茎多糖溶液。多糖含量用改良的苯酚—浓硫酸的方法进行测定,即精密吸取样品液2.5 mL于25 mL容量瓶中,定容、摇匀,取1 mL置于试管中,加蒸馏水补足至2.0 mL,加苯酚试剂1.0 mL混匀,迅速滴加浓硫酸5.0 mL,并迅速混匀,放置5 min,置沸水浴中加热15 min后,取出,流水冷却,然后在490 nm处测定吸光度。分别按下式计算多糖含量和多糖产量,即

$多糖含量\left({{\rm{mg}} \cdot {{\rm{g}}^{{\rm{ - 1}}}}} \right)=\left[{\left({C{\rm{ \times }}D{\rm{ \times }}F{\rm{ \times }}V} \right)/W} \right]{\rm{ \times }}{10^{ - 3}}$

式中,C为样品溶液中葡萄糖的浓度(μg·mL-1),D为样品溶液的稀释倍数,V为样品溶液的体积(mL),F为换算因子,W为样品的质量(g)。

$多糖含量\left({{\rm{mg}} \cdot {{\rm{L}}^{{\rm{ - 1}}}}} \right){\rm{=}}干重量\left({{\rm{g}} \cdot {{\rm{L}}^{{\rm{ - 1}}}}} \right){\rm{ \times多糖含量}}\left({{\rm{mg}} \cdot {{\rm{g}}^{{\rm{ - 1}}}}} \right)$
1.4 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 19.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析 2.1 不同甘露醇质量浓度对铁皮石斛原球茎活力的影响

图 1可以看出,不同甘露醇浓度处理的铁皮石斛原球茎活力在培养后15~25 d时呈上升趋势;培养后25 d各处理分别达到最大值,其中20 g·L-1的处理原球茎活力最强,为196.46 mg·g-1·h-1,其次是10 g·L-1的处理,为184.92 mg·g-1·h-1,40 g·L-1的处理原球茎活力最弱。培养后25~45 d各处理原球茎活力逐渐下降。此外,在不同的培养时间,不处理原球茎活力均有较大差异。当甘露醇质量浓度为0~20 g·L-1时,随着甘露醇质量浓度的增加,原球茎活力逐渐增强,当甘露醇质量浓度超过20 g·L-1,原球茎活力呈下降趋势,且在整个培养周期中40 g·L-1处理原球茎活力均低于对照,而40 g·L-1除了在培养后15 d外其他培养时间均高于对照,说明适当添加甘露醇,调节培养液渗透压,有利于增强铁皮石斛原球茎活力,但当甘露醇浓度过高时对原球茎活力可能产生抑制作用。

图 1 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎活力变化 Fig. 1 Vigor of protocormsin medium with various mannitol concentrations 注:图中不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)和差异极显著(P<0.01)。下图同。

方差分析表明,除了培养后15 d,各处理原球茎活力与对照差异极显著。此外,在培养后15 d,甘露醇质量浓度为10 、20和30 g·L-1的处理原球茎活力两两间差异不显著,三者与40 g·L-1的处理和对照间的差异极显著,40 g·L-1处理与对照间的差异不显著;在培养后25 d,甘露醇浓度为20、30和40 g·L-1的处理两两间差异极显著,三者与10 g·L-1的处理和对照间的差异极显著,10 g·L-1的处理和对照间的差异不显著;在培养后35 d,10、20和40 g·L-1的处理两两间差异极显著,且与对照间差异极显著,30 g·L-1的处理与对照差异不显著,30与40 g·L-1处理间差异显著,但与甘露醇浓度为20、30和40 g·L-1的处理差异极显著;在培养后45 d,20、30和40 g·L-1的处理两两间差异极显著,且与对照和10 g·L-1的处理间差异极显著,10 g·L-1的处理与对照间差异显著。

2.2 不同甘露醇质量浓度对铁皮石斛原球茎的生长的影响

图 2可知,培养后15~35 d各处理原球茎鲜重呈上升趋势,且在培养后35 d达最大值,培养后45 d原球茎鲜重降低。在整个培养期,10和20 g·L-1处理的原球茎鲜重均高于对照,40 g·L-1的处理原球茎鲜重均比对照低;培养后25~45 d,甘露醇浓度为30 g·L-1的处理原球茎鲜重均低于对照。在不同的培养时间,当甘露醇浓度为0~20 g·L-1时,随着甘露醇浓度的增加,原球茎鲜重逐渐增强,当甘露醇浓度超过20 g·L-1,原球茎鲜重呈下降趋势,说明在一定范围内增加甘露醇浓度,可促进铁皮石斛原球的生长,但高渗透压的培养液对铁皮石斛原球的生长具有较明显的抑制作用。

图 2 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎的鲜重动态变化 Fig. 2 Fresh weight of protocormsin medium with various mannitol concentrations

方差分析表明,培养后15 d,各处理与对照间的差异极显著,20和30 g·L-1的处理间差异不显著,二者与10、40 g·L-1的处理间差异极显著,10与40 g·L-1的处理间差异极显著;培养后25 d,20 g·L-1的处理与对照、30和40 g·L-1的处理间差异极显著,与10 g·L-1的处理间差异不显著,10 g·L-1处理与对照差异不显著,30与40 g·L-1处理间差异极显著,且二者对照间差异分别为显著和极显著;培养后35和45 d,除10 g·L-1处理外,其他各处理之间差异均极显著。

图 3表明,培养后35 d,各处理的干重达最大值。培养后15~45 d,40 g·L-1的处理原球茎干重均为最低且低于对照,而30 g·L-1的处理除了培养后15 d干重高于对照外,其他各培养时间其干重低于对照。说明高浓度的甘露醇,不仅抑制原球茎的生长,对原球茎干物质的积累也有抑制作用。

图 3 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎干重动态变化 Fig. 3 Dry weight of protocormsin medium with various mannitol concentrations

方差分析表明,培养后15 d,20和30 g·L-1的处理与对照间的差异极显著,10和40 g·L-1的处理与对照间差异不显著;培养后25 d,40 g·L-1的处理与对照和其他处理差间异极显著,10 、20和30 g·L-1的处理差与对照间异不显著;培养后35 d,20 g·L-1的处理与对照和其他处理间差异均极显著,10 g·L-1的处理差与对照间异不显著,30和40 g·L-1的处理差与对照间异显著;培养后45 d,20 g·L-1的处理与对照和10 g·L-1处理间差异不显著,与30和40 g·L-1的处理与对照间差异极显著。

2.3 不同甘露醇质量浓度对铁皮石斛原球茎多糖积累的影响

图 4可知,从培养后15~35 d,各处理的多糖含量均呈上升趋势;培养后35~45 d,呈下降趋势;培养后35 d,各处理的多糖含量均达最大值,其中10 g·L-1的处理为317.38 mg·g、20 g·L-1的处理为361.52 mg·g-1、30 g·L-1的处理为230.95 mg·g-1、40 g·L-1的处理为204.61 mg·g-1、对照为276.89 mg·g-1,且各处理间的差异极显著。在不同的培养时间,20 g·L-1的处理多糖含量均为最高,且与对照和其他处理的差异都达极显著水平。此外,当甘露醇质量浓度为0~20 g·L-1时,随着甘露醇质量浓度的增加,原球茎多糖含量逐渐提高,当甘露醇质量浓度超过20 g·L-1,多糖含量呈下降趋势,说明甘露醇拨云见日一浓度较低时,可促进铁皮石斛原茎球多糖的积累,而高浓度的甘露醇对铁皮石斛原球茎多糖的积累具有较明显的抑制作用。

图 4 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎多糖含量的动态变化 Fig. 4 Polysaccharide content of protocormsin medium with various mannitol concentrations
2.4 不同甘露醇质量浓度下铁皮石斛原球茎的多糖产量

图 5表明,各处理多糖产量的变化趋势与多糖含量的变化一致,即从培养后15~35 d,各处理的多糖产量均呈上升趋势;培养后35~45 d,各处理的多糖产量均呈下降趋势;培养后35 d,各处理的多糖产量均达最大值,分别为4 080.60、4 713.09、6 255.38、2 972.33和2 647.96 mg·L-1。在不同的培养时间,20 g·L-1处理多糖产量均高于其他处理,且与对照和其他处理间的差异均极显著,而40 g·L-1处理多糖产量均最低,但其与对照间的差异均极显著;培养后15 d和25 d,10、30和40 g·L-1处理两两间的差异均极显著;培养后35和45 d,30和40 g·L-1处理间的差异显著,二者与10 g·L-1处理间的差异极显著。

图 5 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎的多糖产量变化 Fig. 5 Polysaccharide yield of protocorm in medium with various mannitol concentrations
3 讨论与结论

随着野生铁皮石斛的过度开采及市场上的大量需求,利用组织培养技术进行原球茎的快速繁殖被认为是解决铁皮石斛药源的有效途径。在铁皮石斛原球茎的培养过程中,其生长量、干物质积累量、多糖含量和多糖产量等常作为培养质量的评价指标,铁皮石斛原球茎的生长及其多糖的积累受到培养方式、植物生长调节剂、培养基渗透压等诸多因素的影响。苏江等[7]研究表明,在培养第20 d添加5 g·L-1蔗糖有利于铁皮石斛原球茎干物质形成和多糖积累,多糖含量和多糖产量分别为300、4 805.85 mg·L-1;研究还发现以植物生长调节剂配比NAA0.6 mg·L-1+BA0.5 mg·L-1+KT1.5 mg·L-1最有利于原球茎干物质形成,NAA0.4 mg·L-1+BA0 mg·L-1+KT1.5 mg·L-1是促进原球茎多糖合成的植物生长调节剂配比最佳组合;摇床转速120 r·min-1,初始pH 6.0,接种量90 g·L-1是有利于铁皮石斛原球茎的干物质形成和多糖合成的最佳组合。何铁光等[8]等研究发现,相对于乳糖和果糖,蔗糖和葡萄糖对原球茎生长和多糖积累更有利,且发现蔗糖起始浓度为30 g·L-1有利于原球茎生长,在培养40 d时其多糖最高含量为208.7 mg·g-1,多糖产量为3 679.6 mg·L-1

甘露醇是一种蔗糖乙醇,与蔗糖分子结构相似,但在植物代谢中不活泼,不能被植物吸收作为碳源。在植物组织培养中常通过添加甘露醇来调节培养基渗透压,造成培养基水势降低,阻碍培养物对水分和养分的吸收,同时减少营养物质的消耗。目前,在植物组织培养中甘露醇主要用于种质的资源保存和生长调节等[9, 10, 11, 12]。收获多糖是铁皮石斛原球茎培养的主要目标,而原球茎的生长决定了多糖积累量和产量。本研究表明,于培养液中添加不同浓度的甘露醇形成的不同渗透压对铁皮石斛原球茎的生长及其多糖的积累均有明显的影响。当甘露醇质量浓度为0~20 g·L-1时,随着甘露醇浓度的增加,原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量总体呈上升趋势,当甘露醇质量浓度超过20 g·L-1,原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量呈下降趋势,说明甘露醇浓度较低时,可促进铁皮石斛原球茎生长和多糖的积累,高浓度的甘露醇对铁皮石斛原球茎生长和多糖的积累具有较明显的抑制作用,且随着培养时间的延长其抑制作用亦加明显。笔者认为,这可能是由于培养液中添加低浓度的甘露醇后形成一定的渗透压,更有利于原球茎对水分和养分的吸收,同时提高了原球茎细胞内与代谢相关酶的生理活性及效应,从而促进原球茎的生长和多糖的积累;而高浓度的甘露醇添加于培养液后其渗透压大幅上升,对原球茎形成水分逆境,阻碍原球茎对水分和养分的吸收,原球茎细胞内酶的活性减弱,从而使原球茎的生长和多糖积累受到明显的抑制。

本研究于培养液中分别添加0、10、20、30、40 g·L-1的甘露醇,旨在探讨不同培养液参透压对铁皮石斛原球茎的生长和多糖积累的影响,从考核的指标来看,添加甘露醇质量浓度为10~20 g·L-1可促进原球茎的生长和多糖积累,其原球茎活力、鲜重、干重、多糖含量和多糖产量都高于对照,而添加甘露醇质量浓度为30~40 g·L-1的处理原球茎活力、鲜重、干重、多糖含量和多糖产量都比对照低。因此,生产中可考虑在培养液中添加低浓度的甘露醇以调节合适的渗透压。此外,在培养后35 d,各处理的原球茎干重、多糖含量和多糖产量均达最大值,且甘露醇质量浓度为20 g·L-1的处理其干重、多糖含量和多糖产量均高于对照和其他处理,分别为17.30 g·L-1、361.52 mg·g-1和6 255.38 mg·L-1,比前人的研究结果稍高。

本研究首次探讨了不同浓度的甘露醇作为渗透压调节剂对铁皮石斛原球茎的生长和多糖积累的影响,研究结果对大规模生铁皮石斛原球茎获取铁皮石斛多糖具有一定的参考价值。

参考文献
[1] 陈晓梅,王春兰,王爱荣,等.铁皮石斛原球茎多糖的研究[J].植物分类学报,1980,18(4);427-449.(1)
[2] 何铁光,杨丽涛,李杨瑞,等.铁皮石斛原球茎多糖DCPP1a-1的理化性质及抗肿瘤活性[J]. 天然产物研究与开发,2007,(19):578-583.(1)
[3] 高建平,金若敏,吴耀平,等.铁皮石斛原球茎与原药材免疫调节作用的比较研究[J].中药材,2002, 25(7):487-489.(1)
[4] 杨柳平,刘畅庆,赵仁发,等.铁皮石斛种子诱导原球茎组培快繁体系的研究[J].广东农业科学,2012,(7):54-57.(1)
[5] 徐迎亚,王艳,刘宏源,等.铁皮石斛原球茎增殖与分化影响因素研究[J].广州中医药大学学报,2015,32(6):1091-1097.(1)
[6] 王增利,史昊,张宗申.铁皮石斛原球茎悬浮培养及其多糖积累的研究[J].河南农业科学,2012,41(2):129-131.(1)
[7] 苏江,岑忠用,邓晰朝. 基于正交试验法的铁皮石斛原球茎生长和多糖合成研究[J]. 作物杂志,2013,(2):84-90.(1)
[8] 何铁光,杨丽涛,李杨瑞,等.蔗糖对铁皮石斛原球茎生长与多糖积累的影响[J].安徽农业科学, 2007,35(13):3817-3819.(1)
[9] 徐志微,杨丽丽,杜国强,等.培养基渗透压和生长调节剂对葡萄种质离体保存的效应[J]. 分子植物育种,2014,12(4):720-725.(1)
[10] 叶秀仙,黄敏玲,吴建设,等.甘露醇和生长抑制剂对文心兰离体保存的影响[J].福建农业学报, 2011,26(1):76-82.(1)
[11] 黄萍,马朝宏,颜谦.甘露醇对马铃薯试管苗生长和有效保存期的影响[J].西南农业学报,2011,24(6):2446-2448.(1)
[12] 温睿婷,王汉宁,杨如涛,等.降低玉米成熟胚愈伤组织褐化的初步研究[J].分子植物育种,2010,8(3):483-487.(1)