菜用豌豆豆荚质嫩清香、富含营养，含有人体必需的氨基酸，蛋白质含量达24.8 %，比小麦、玉米高2~3倍^[1]，且富含烟酸和维生素B1、B2^[2]，在很多发展中国家，豌豆还是重要的粮食作物^[3]。在我国各地均有栽培，主产地有四川、河南、湖北、江苏、青海等10多个省区。随着人们对食荚豌豆需求量的提高，通过缩短上市期，以满足人们对食荚豌豆的需求有着现实的意义，春化时期的长短影响着食荚豌豆的上市期；因此，通过研究春化处理对豌豆生理生化指标的影响，探索对食荚豌豆新的处理技术具有重要意义。

春化作用(Vernalization)是植物适应季节变化，在一定低温(一般为4℃)处理2~8周后，表现出对越冬植物成花的诱导和促进作用。如果这些植物不经低温处理，开花过程可能推迟几周甚至几个月^[4]，国内、外对种子春化植物小麦和拟南芥研究较多^[5]，春化作用的具体效应取决于植物所处的发育阶段、低温处理时间长短和温度等几个因素^[6]。一定时期的低温春化处理有利于促进豌豆开花，提早上市，缩短生育期。在低温条件下植物细胞内氧代谢失衡积累活性氧自由基，积累的自由基对植物的膜系统造成伤害，使膜脂产生过氧化作用，最终分解的产物丙二醛(MDA)含量也会增加,加大膜脂透性^[7]，导致细胞膜结构和功能受到破坏^[8]。植物体对于产生的活性氧自由基存在2种抗氧化系统，一种是抗氧化酶类物质，如超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)等；另一种是非酶类化合物，如脯氨酸(Pro)以及低温诱导产生的一系列蛋白质等。它们能在一定范围内及时清除过多的活性氧，维持体内自由基代谢的动态平衡，降低膜脂过氧化，并保护膜系统的稳定性^{[9, 10, 11]}。本研究以4种基因型不同的豌豆为材料，对发芽后的豌豆种子进行不同春化时间处理，研究不同春化时间对豌豆叶片保护酶及MDA和可溶性蛋白含量的影响，以期为豌豆春化生理研究提供依据。

供试植物材料为江苏省农业科学院蔬菜研究所豆类作物研究室提供的4个菜用型豌豆品种：半无叶6609、成都167XW11-116、苏豌9117、西宁7462。

试验于2015年6~9月在江苏省农业科学院蔬菜研究所进行。选取大小一致、颗粒饱满、表面无虫眼的豌豆种子，在室温20℃浸种12 h，浸种液加入多菌灵消毒，浸种完成后将种子用水冲洗干净，在室温20℃的环境中进行催芽，待豌豆幼芽长到1~2 cm时，将长出幼芽的豌豆种子分别放入4℃的人工气候培养箱中进行春化处理，试验共设4个处理，春化时间为0、6、12、18 d，每个处理重复3次，整个处理过程保持豌豆表面湿润，处理结束后进行播种，取播种后10 d豌豆叶片，迅速将所取叶片置于液氮中快速冷冻，然后转移至-80℃冰箱保存，当取样全部结束时进行保护酶活性及MDA和可溶性蛋白含量的检测。

POD活性：愈创木酚法测定^[12];SOD活性：NBT光化学还原法测定^[13];CAT活性：紫外吸收法测定;MDA含量：巴比妥酸法测定^[13]；可溶性蛋白质含量：考马斯亮蓝G-250染色法^[14]。

采用Excel 2010软件处理试验数据，并用SPSS 18.0软件对试验数据进行两因素的方差分析，处理间均值的多重比较用Duncan's新复极差法，试验结果是3次重复的平均值，不同字母表示在0.05水平下差异显著。

如图 1所示：4个豌豆品种叶中过氧化物酶活性随着春化时间增加而上升，在春化时间12 d时达到最高水平，与对照组有显著差异(P<0.05)，随着春化时间继续增加，过氧化物酶活性降低。春化处理6 d后，西宁7462和成都167XW11-116 POD活性与对照组差异显著(P<0.05)；春化处理12 d后，4个豌豆品种POD活性达到峰值，并均与对照组差异显著(P<0.05)；春化处理18 d后，半无叶6609 POD活性与对照组差异显著(P<0.05)，其余品种与对照组差异不显著(P>0.05)。在春化处理12 d时，4个豌豆品种受春化时间影响叶片中POD活性变化速率：成都167XW11-116>苏豌9117>半无6609>西宁7462。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同春化处理对过氧化物酶活性的影响 Fig. 1 Effect of vernalization duration on peroxidase activity in leaves 注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图 2~5同。

如图 2所示：4个豌豆品种叶中超氧化物歧化酶活性随着春化时间增加而上升，在春化时间12 d时达到最高水平，与对照组有显著差异，随着春化时间继续增加，超氧化物歧化酶活性降低。春化处理6 d后，半无叶6609和成都167XW11-116 SOD活性与对照组差异显著(P<0.05)；春化处理12 d后，4个豌豆品种SOD活性达到峰值，并与对照组和春化处理6 d组差异显著(P<0.05)；春化处理18 d后，西宁7462、半无叶6609和苏豌9117 SOD活性与对照组差异显著(P<0.05)；其余品种与对照组差异不显著(P>0.05)。在春化处理12d时，4个豌豆品种受春化时间影响叶片中SOD活性变化速率：苏豌9117>成都167XW11-116>西宁7462>半无叶6609。

图 2(Fig. 2)

图 2 不同春化处理对超氧化物歧化酶活性的影响 Fig. 2 Effect of vernalization duration on superoxide dismutase activity in leaves

如图 3所示：与对照组相比，4个豌豆品种叶中过氧化氢酶活性随着春化时间增加先上升后下降；西宁7462在春化6 d时CAT活性达到最大，与对照组有显著差异(P<0.05)，随着春化时间继续增加CAT活性降低，春化处理12、18 d与对照组差异不显著(P>0.05)；半无叶6609、苏豌9117和成都167XW11-116 CAT活性在春化处理6 d后与对照组差异显著(P<0.05)，在春化时间12 d时达到最高水平，与对照组有显著差异(P<0.05)，春化处理18 d后，半无叶6609和苏豌9117 CAT活性与对照组差异显著(P<0.05)，其余品种与对照组差异不显著(P>0.05)。4个豌豆品种受春化时间影响叶片中CAT活性变化速率：成都167XW11-116>苏豌9117>西宁7462>半无叶6609。

图 3(Fig. 3)

图 3 不同春化处理对过氧化氢酶活性的影响 Fig. 3 Effect of vernalization duration on catalase activity in leaves

如图 4所示：与对照组相比，4个豌豆品种叶中MDA含量随着春化时间增加而升高，在春化时间12 d后，随着春化时间继续增加MDA含量迅速升高。春化处理6 d后，西宁7462 MDA含量与对照组差异不显著(P>0.05)，春化处理12、18 d MDA含量与对照组差异显著(P<0.05)，春化处理6、12 d MDA含量差异不显著(P>0.05)；半无叶6609、苏豌9117和成都167XW11-116在春化处理6、12、18 d后，MDA含量与对照组差异显著(P<0.05)，且各处理间差异均显著(P<0.05)。在春化处理过程中，4个豌豆品种受春化时间影响叶片中MDA含量变化速率：成都167XW11-116>苏豌9117>半无叶6609>西宁7462。

图 4(Fig. 4)

图 4 不同春化处理对丙醛含量的影响 Fig. 4 Effect of vernalization duration on MDA content in leaves

如图 5所示：与对照组相比，4个豌豆品种叶中可溶性蛋白含量随着春化时间增加而升高，在春化处理12 d后，可溶性蛋白含量变化趋势不同，西宁7462、半无叶6609和苏豌9117可溶性蛋白含量降低，成都167XW11-116可溶性蛋白含量升高，春化处理12、18 d可溶性蛋白含量差异均不显著(P>0.05)。春化处理6 d后，西宁7462、苏豌9117和成都167XW11-116可溶性蛋白含量与对照组差异显著(P<0.05);春化处理12、18 d后，4个豌豆品种可溶性蛋白含量与对照组差异显著(P<0.05)。在春化处理12 d时，4个豌豆品种受春化时间影响叶片中可溶性蛋白含量变化速率：苏豌9117>半无叶6609>成都167XW11-116>西宁7462。

图 5(Fig. 5)

图 5 不同春化处理对可溶性蛋白含量的影响 Fig. 5 Effect of vernalization duration on soluble protein content in leaves

植物细胞在生命活动中不断地产生自由基，正常情况下，机体内存在着清除自由基的各种酶使自由基水平处于一种相对的动态平衡状态，在低温条件下植物细胞内氧代谢失衡积累活性氧自由基，积累的自由基对植物的膜系统造成伤害。POD、SOD、CAT是在防御活性氧自由基对细胞膜系统伤害重要的酶系统，POD可降解H₂O₂产生O^2-，CAT酶可促使H₂O₂分解为分子氧和水使细胞免于遭受H₂O₂的伤害，SOD直接控制植物体内O^2-和H₂O₂的浓度^{[15, 16]}，三者协调对植物起到保护作用。本试验中4种豌豆在春化处理时，植物体内的活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除系统被激活，表现为POD、SOD、CAT抗氧化酶活性升高，在春化时间12 d时达到最大，但保护酶系统随春化时间延长逐渐受到抑制，表现为POD、SOD、CAT抗氧化酶活性在春化18 d时降低。SOD在植物中的过量表达能够提高植物对多种氧的耐受性，不过当胁迫因子的强度超过一定的范围时，则会引起SOD活性的下降^[16]，这与本试验结果一致。

植物在逆境胁迫下常发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是主要的膜脂过氧化产物，常作为衡量细胞膜脂过氧化的水平和膜受伤害的程度。本试验中4种豌豆幼苗叶子中的MDA含量先缓慢上升，可能是由于低温春化处理的影响使植物体内的抗氧化系统被打破，导致ROS积累，膜脂过氧化作用增强，使得MDA含量上升，由于保护酶的活性也有所上升，所以MDA含量先呈现缓慢上升趋势，当春化时间为18 ｄ时MDA含量迅速升高，可能是由于植物体内的保护酶活性的下降，导致ROS的积累速度突然变快，使得MDA含量大幅度上升。

低温胁迫下,植物体失水产生渗透胁迫,渗透胁迫使植物产生脱水胁变，植物为了消除胁迫所造成的伤害，通常主动积累一些渗透调节物质来维持渗透平衡和体内的水分，可溶性蛋白具有较强的亲水性，它能明显增强细胞的持水力，而可溶性蛋白含量的增加可以束缚更多的水分，减少低温条件下原生质因结冰而受伤害致死的机会^[17]。本试验中4种豌豆幼苗叶子中的可溶性蛋白含量随着低温春化时间的延长而升高，提高了豌豆对低温的耐受性，降低低温对植物的伤害，当低温春化12 d后，不同基因型的豌豆可溶性蛋白含量无差异性变化，可能是豌豆对低温产生了适应性或细胞受到损伤，导致可溶性蛋白含量无明显变化。

综上研究可知，低温春化处理对豌豆幼苗叶中保护酶活性、MDA含量和可溶性蛋白含量有明显影响。随着低温春化时间的延长豌豆幼苗叶中保护酶活性升高，在春化时间12 d时，保护酶活性升到最高，MDA含量缓慢升高，可溶性蛋白含量升高，随着春化时间继续增加保护酶活性降低，MDA含量迅速升高，可溶性蛋白含量无明显变化，植物细胞对长时间低温春化处理的保护性降低，细胞可能受到损伤。来自不同地区的豌豆受到低温春化处理的影响类似，但对低温春化处理的响应速度存在差异，从以上各项生理生化指标判断豌豆幼芽在4℃低温的最佳春化时间为12 d左右。本实验仅从生理生化方面研究了春化时间对菜用豌豆幼苗的影响，为菜用豌豆的春化处理技术提供了生理生化指标的理论支持，而春化时间对菜用豌豆花芽分化、开花结荚特性的影响还需进一步的研究。