鳗鲡Anguilla anguilla是我国水产养殖业的重要生产品种，具有特殊的摄食习性和饲料特性。鳗鲡属于肉食性鱼类，对蛋白质需求量高，对蛋白质品质和适口性也具有很高的要求^[1]。鳗鲡配合饲料营养标准(SC/T1004-2004)规定鳗鲡配合饲料中的蛋白质水平在40%以上^[2]。在实用鳗鲡饲料配方中通常采用蛋白质含量高、鲜度好的超级蒸汽鱼粉，用量占到60%~70%^[1]，但鳗鲡对这些优质蛋白质的表观消化率并不高，仅74%，其饲料系数多在2.0以上^[3]。饲料系数过高表明饲料转化效率过低，意味着饲料中的营养物质没有被充分利用，增加了养殖成本，给环境带来压力^{[4, 5]}。

水生动物吸收营养物质的主要部位是肠道，肠道内共附生着大量的已知和未知的微生物，形成一个特定的微生物群落，在宿主的生长、发育、免疫调节、营养吸收等方面发挥着极其重要的作用^[6]。肠道菌群不仅参与宿主的代谢，更能帮助代谢宿主自身不能代谢的物质，与宿主发生共代谢关系，提高饲料的利用率，诱导内源酶的分泌，为宿主提供能量及细菌生长与繁殖所需的营养物质^[7]。研究鳗鲡肠道菌群与宿主整体代谢的相关性，探寻影响鳗鲡代谢变化的重要功能成员，对益生菌微生态制剂及鳗鲡饲料的开发具有重要的意义。为此，本研究首次以鱼粉为底物，从健康欧洲鳗鲡肠道内分离筛选出产蛋白酶的益生菌，对其进行16SrRNA基因鉴定和酶学特性分析，为鳗鲡产酶益生菌的研发以及鳗鲡饲料的合理配制使用奠定基础。

来自福建省连江县某养鳗场，平均体重约为100 g。

分离平板培养基(g·L^-1)：胰酪蛋白胨20.0，氯化钠5.0，L-胱氨酸0.4，葡萄糖10.0，硫代乙醇酸钠2.0，甲醛合次硫酸氢钠1.0，美蓝0.002，琼脂20.0，pH 7.3~7.5。初筛平板培养基(g·L^-1):酪蛋白10.0，胰酪蛋白胨20.0，氯化钠5.0，L-胱氨酸0.4，葡萄糖10.0，硫代乙醇酸钠2.0，甲醛合次硫酸氢钠1.0，美蓝0.002，琼脂20.0，pH 7.3~7.5。发酵培养基(g·L^-1):磷酸氢二钾0.293，磷酸二氢钾0.176，氯化钠0.443，硫酸铵0.45，氯化钙0.045，硫酸镁0.094，刃天青0.001，L-半胱氨酸0.5，L-抗坏血酸0.5，碳酸钠4.0，牛胆盐1.0，蛋白胨1.0，琼脂1.0，pH 7.5~8.0。所用试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

蛋白酶活力测定采用Folin-酚试剂法：取发酵上清液1 mL，加入1 mL 25℃预热保温的1%鱼粉底物缓冲液(pH7.2)，迅速混匀，于25℃水浴保温10 min，立即加入2 mL 0.4 mol·L^-1三氯乙酸终止反应。离心，取1 mL上清液，加入5 mL 0.4 mol·L^-1的碳酸钠溶液和1 mL Folin-酚试剂，40℃显色20 min，波长660 nm处测定吸光值，对照标准曲线，计算酪氨酸含量，空白为灭活酶液的反应系统。蛋白酶活力定义：在pH 7.2和25℃条件下，1 mL酶液每分钟生产1 μg酪氨酸所需酶量定义为1个蛋白酶活力单位，记为U·mL^-1。其计算公式为：

式中：A为对照标准曲线得出的酪氨酸释放量(μg)；4为反应试剂总体积(mL)；N为稀释倍数；10为反应时间10(min)。

将活鳗鲡解剖，无菌取其肠道，纵向剪开肠道，使用磷酸盐缓冲液冲洗肠道内部数次，去除肠道中的粪便污水等内容物；用无菌剪刀将清洗的肠道剪碎，加入少量生理盐水淹没，得到菌液原液，将原液稀释成10^-6、10^-7浓度梯度，分别涂布于分离平板培养基上，于25℃厌氧培养3 d，挑取单菌落，稀释划线培养于分离平板培养基上，得到纯的单菌落。采用三菱AnaeroPack^TM-Anaero厌氧产气袋进行厌氧培养。

将分离纯化的单菌落分别点种于初筛平板培养基上，25℃厌氧培养3 d，观察记录各菌株产透明圈情况。

将产透明圈的菌株接种于发酵培养液中，于25℃厌氧培养3 d，离心取上清液，以鱼粉为底物，测定上清液的蛋白酶活力，筛选产蛋白酶活力最高的菌株，作为出发菌株。

肉眼观察细菌在分离培养基上的菌落形态、颜色等；通过革兰氏染色后，在光学显微镜下观察和拍照；取少量菌液进行常规磷钨酸负染色透射电镜标本制作，置于日立HT7700电子透射电镜下观察并拍照。

按照Biolog GP2微生物鉴定微孔板使用手册和Biolog微生物自动分析系统操作规程所述的操作步骤对所筛菌株进行Biolog鉴定^{[8, 9]}。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取所筛菌株的基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增菌株的16S rRNA基因序列，采用16S rRNA基因的通用引物27F和1492R^[10]。PCR反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。测序结果利用GenBank上BLAST程序进行同源性比较，选取相似性高且为有效发表的典型菌株序列，应用ClustalX软件进行多序列比对分析，再运用MEGA 5.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。

将出发菌株在于25℃进行厌氧液体发酵3 d，发酵液在4℃、6 000 r·min^-1条件下离心15 min，去除菌体得到上清液，即为粗酶液。

以1%鱼粉溶液为底物，将粗酶液分别置于15、25、35、45、55、65、75℃下测定蛋白酶活性，确定其最适反应温度。再将粗酶液分别在15～75℃条件下保温60 min，在最适温度条件下测定蛋白酶活力，分析酶的温度稳定性。以试验组最大酶活力记为100%，其余以相对酶活力表示。

将粗酶液分别与不同pH(4.0、4.5、5.0、5.8、6.8、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的缓冲液等体积混合，其中pH 4.0～5.8缓冲液采用0.2 mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲体系，pH 6.8~10.0缓冲液采用0.2 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲体系，测定蛋白酶活性，确定其最适反应pH。再将粗酶液分别与pH4.0～10.0的缓冲液等体积混合，4℃放置60 min，在最适pH条件下测定蛋白酶活力；分析酶的酸碱稳定性。以试验组最大酶活力记为100%，其余以相对酶活力表示。

在蛋白酶活力的测定体系中，分别加入KCl、NaCl、MgCl₂、CaCl₂、CuSO₄、ZnSO₄、FeSO₄等，使其终浓度为10 mmol·L^-1，测定加入各金属离子后的蛋白酶活力。再以同样的方法加入EDTA、PMSF、Pepstatin A，使其终浓度分别为1 mg·mL^-1、100 μg·mL^-1、1 μg·mL^-1，测定加入修饰剂后的蛋白酶活力。以未添加金属离子和抑制剂的酶活力为对照，记为100%。

在蛋白酶活力测定体系中，改变鱼粉底物的质量浓度，测定鱼粉底物质量浓度分别为2.5、5、10、15、20、25、30、35 mg·mL^-1时的酶活力，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法求取蛋白酶的米氏常数(K_m)和最大反应速度(V_max)。

选取不同浓度的肠道细菌菌悬液涂布于分离平板培养基上，于恒温箱25℃条件下培养3 d，根据菌落形态特征及部分菌株的革兰氏染色结果，分离得到31株株菌。依据初筛平板培养基上D/d值，初筛得到16株形态不同、D/d比值较大的细菌菌株(表 1)。将初筛菌株进一步厌氧发酵培养，以鱼粉为底物测定所产蛋白酶的酶活力，复筛得到高产蛋白酶降解鱼粉的功能菌株MJ15(表 1)。由表 1可见，M15菌株在平板培养基上测定的D/d比值为1.91，在发酵液测定的蛋白酶活力最高为26.2 U·mL^-1，与其他菌株相比存在显著差异(P<0.05)。综合以上结果，选择MJ15为本研究出发菌株，进一步对该菌株进行鉴定并对其所产蛋白酶性质开展初步研究。

表 1(Table 1)

表 1 鳗鲡肠道产蛋白酶功能菌株的筛选Table 1 Screening protease-producing bacteria from intestines of A. anguilla 菌株 水解圈直径D /mm 菌落直径d /mm D/d 蛋白酶酶活/ (U·mL-1) MJ3 6.1 3.0 2.03 16.2±0.5 d MJ4 2.5 1.7 1.47 11.8±0.8 gh MJ8 3.6 2.5 1.44 8.3±0.4 j MJ9 3.2 1.8 1.78 18.1±0.7 c MJ10 1.6 1.1 1.45 12.0±0.2 fg MJ13 3.9 3.2 1.22 10.9±0.2 h MJ15 4.2 2.2 1.91 26.2±0.3 a MJ16 3.4 2.1 1.62 12.7±0.4 f MJ17 3.6 2.5 1.44 9.8±0.3 i MJ20 5 3.3 1.52 13.6±0.2 e MJ21 4.9 2.1 2.33 20.6±0.5 b MJ24 4.2 3.3 1.27 10.2±0.1 i MJ25 3 1.9 1.58 11.2±0.2 h MJ27 4.5 2.1 2.14 21.0±0.2 b MJ29 5.1 3.5 1.46 13.5±0.4 e MJ31 3 2.2 1.36 12.0±0.2 fg

表 1 鳗鲡肠道产蛋白酶功能菌株的筛选 Table 1 Screening protease-producing bacteria from intestines of A. anguilla

菌株MJ15菌落呈乳白色圆形小菌落，表面湿润光滑凸起，边缘整齐(图 1)；光学显微镜观察为G⁺性菌，菌体细胞多为圆形或卵圆形，大多数成对，也可见短链(图 2)；透射电镜观察菌体细胞呈圆形或卵圆形，直径约为0.8 μm，裂殖方式为二等分裂殖(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 1 菌株MJ15菌落形态 Fig. 1 Morphology of MJ15 colonies on petri dish

图 2(Fig. 2)

图 2 菌株MJ15革兰氏染色(100×) Fig. 2 Gram-stained MJ15(100×)

图 3(Fig. 3)

图 3 菌株MJ15的电镜观察 Fig. 3 Transmission electron microscopy of MJ15

Biolog微生物鉴定系统是根据测试微生物对鉴定板中95种不同碳源的利用情况组成的“代谢指纹”进行鉴定^[11]。表 2为菌株MJ15厌氧培养24 h后Biolog的测定结果。从表中可以看出，菌株MJ15与乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis相似性(SIM)=0.76>0.5。SIM值越接近1.0鉴定结果越可靠，位距(DIS)=3.36<5.0、可能性(PROB)=99%，表明鉴定结果准确，与数据库有很好的匹配。

表 2(Table 2)

表 2 菌株MJ15的Biolog系统鉴定结果Table 2 Identification of MJ15 by biolog system 鉴定板型号 可能性 PROB/% 相似性 SIM 位距 DIS 菌种 Biolog GP2 99 0.76 3.36 Lactococcus lactis subsp. Lactis

表 2 菌株MJ15的Biolog系统鉴定结果 Table 2 Identification of MJ15 by biolog system

提取菌株MJ15的全基因组DNA，采用PCR技术扩增其16S rRNA片段，获得1 451 bp的16S rRNA序列。将测序结果录入NCBI进行BLAST比对，结果显示，该序列与已知菌株Lactococcus lactis subsp.Lactis(KT278846.1)的同源性达到99%以上。选取相似性高且已定名的菌株序列信息，用ClustalX软件进行多序列比对分析，再运用MEGA 5.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，结果见图 4。从图中可以看出，菌株MJ15与Lactococcus lactis subsp.Lactis的遗传进化距离最近。结合形态学、biolog鉴定以及16S rRNA序列比对结果，确定菌株MJ15为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis。

图 4(Fig. 4)

图 4 菌株MJ15的16S rRNA序列系统发育树 Fig. 4 The phylogenetic tree of strain MJ15 based on 16S rRNA sequences

菌株MJ15产蛋白酶在10~70℃均能催化水解鱼粉，在温度较低时，蛋白酶活性随温度的升高而升高，并于40℃时活性达到峰值，之后酶活力则随温度升高而迅速下降(图 5)。进一步研究蛋白酶在不同温度下处理60 min后的酶活力，结果表明，在10~40℃保温处理60 min，相对酶活力可以保持在87%以上，表明菌株MJ15蛋白酶在此温度区间具有较好的热稳定性；但在50℃下处理60 min后，相对酶活力仅为62.56%，说明菌株MJ15蛋白酶对热较敏感。

图 5(Fig. 5)

图 5 温度对蛋白酶活力及其稳定性的影响 Fig. 5 Effect of temperature on crude protease activity and stability

菌株MJ15产蛋白酶在pH 4.5~7.5区域内对鱼粉具有较强的催化活性，最适pH 5.0，这表明该蛋白酶为偏酸性蛋白酶(图 6)。进一步分析该蛋白酶的酸碱稳定性，将其在不同pH下处理60 min后测定其蛋白酶活性，结果表明，该蛋白酶在pH 4.5~7.5范围内稳定性较高，能保持83%以上的活性，而经pH 10.0缓冲液处理后的蛋白酶相对酶活力仅为16.6％，表明该蛋白酶对碱较敏感。

图 6(Fig. 6)

图 6 pH对蛋白酶活力及其稳定性的影响 Fig. 6 Effect of pH on crude protease activity and stability

在粗酶反应体系中加入各金属离子及抑制剂，测定其对蛋白酶活性的影响，结果(表 3)表明，与空白对照相比，添加10 mmol·L^-1的K⁺、Na⁺、Cu²⁺、Fe²⁺分别使蛋白酶活力提高11.9%、15.8%、44.6%、22.1%；Mg²⁺、Ca²⁺对蛋白酶活力影响较小；Zn²⁺对蛋白酶活性有抑制作用，可使蛋白酶活力丧失16.5%。表 3还显示，金属蛋白酶抑制剂EDTA和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对蛋白酶活力几乎没有影响，表明该酶活性中心不含金属离子和丝氨酸；而胃蛋白酶抑制剂Pepstatin A对蛋白酶活性有一定的抑制作用，表明该酶的活性中心位点可能含有天冬氨酸。

表 3(Table 3)

表 3 金属离子和抑制剂对粗酶蛋白酶活力的影响Table 3 Effects of metal ions and inhibitor on crude protease activity 生化试剂 浓度 相对酶活力 /% Control - 100.0 KCl 10 mmol·L-1 111.9±1.1 NaCl 10 mmol·L-1 115.8±0.5 MgCl2 10 mmol·L-1 101.8±2.4 CaCl2 10 mmol·L-1 102.9±1.1 CuSO4 10 mmol·L-1 144.6±0.9 ZnSO4 10 mmol·L-1 83.5±1.6 FeSO4 10 mmol·L-1 122.1±1.4 EDTA 1 g·L-1 101.8±1.3 PMSF 100 mg·L-1 105.2±1.4 Pepstatin A 1 mg·L-1 91.5±3.3

表 3 金属离子和抑制剂对粗酶蛋白酶活力的影响 Table 3 Effects of metal ions and inhibitor on crude protease activity

在pH7.2和25℃下，测定不同底物鱼粉质量浓度的蛋白酶活力。结果采用Lineweaver-Burk双倒数作图法作图(图 7)。经线性拟合得到线性方程为：y＝0.1641x+0.0187，从方程得出该酶催化底物鱼粉反应的米氏常数K_m＝8.77 mg·mL^-1，最大反应速度V_max＝53.48 μg·min^-1·mL^-1。

图 7(Fig. 7)

图 7 粗酶液的Lineweaver-Burk图 Fig. 7 Line weaver-Burk plots of crude protease

本研究在筛选鳗鲡肠道具有强消化蛋白能力菌株时，采用了酪蛋白平板透明圈法和以鱼粉为底物进行酶活力测定方法，但两者结果略有差异。王福强等^[12]在筛选牙鲆肠道产蛋白酶菌时，采用了酪蛋白酶试验法和脱脂乳产酶试验法，两者结果存在较大差异。许禔森^[13]在筛选鲈鱼肠道产蛋白酶菌时发现菌株的脱脂乳溶蛋白圈直径与以酪蛋白为底物测定的酶活力不呈相关性。分析原因可能是2种方法所采用的底物不同造成的一些偏差。酪蛋白平板透明圈法主要针对产碱性蛋白酶的菌株，对其他酸碱性的蛋白酶的菌株效果不明显^[12]。陈超^[14]认为酪蛋白琼脂平板培养基只适合进行产蛋白酶菌株的初步筛选，并不能精确地反映各个菌种所产目的蛋白酶能力的高低。鱼粉占鳗鲡配合饲料的60%以上，本研究采用鱼粉为底物测定蛋白酶活力以确定最佳的候选益生菌株，具有更大的实践价值。

产蛋白酶性能优良的菌株能否作为益生菌使用，还需要进一步确定其能否在肠道定殖以及温度、pH值等对其酶活性的影响。菌株MJ15来源于鳗鲡肠道，从某种程度上更易在鳗鲡肠道中定殖。对菌株MJ15进行鉴定确认其属于乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis，其所产蛋白酶最适反应温度40℃，最适反应pH 5.0。鳗鲡生长的适宜水温为13~30℃^[15]，适宜生长的pH为4.0~9.0^[16]，鱼蛋白酶的最适温度一般较鱼栖息水域的温度高，因此，菌株MJ15在鳗鲡养殖系统中能更好地适应环境，较易形成优势菌，可作为鳗鲡养殖潜在益生菌源。

本试验研究了K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺等7种无机离子以及EDTA、PMSF、Pepstatin A等3种蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的影响，结果显示，K⁺、Na⁺、Cu²⁺、Fe²⁺对蛋白酶有不同程度的激活作用，Mg²⁺、Ca²⁺对蛋白酶活性影响较小，而Zn²⁺对该酶表现出抑制作用，这表明养殖用水中的金属离子以及配合饲料中的矿物质均可对鳗鲡肠道消化酶活力产生影响，在鳗鲡养殖过程中应予以重视。林建城等^[17]认为Mg²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺等金属离子对鳗鲡肠道蛋白酶有抑制作用，而叶玫等^[18]则发现Mg²⁺、Ca²⁺对鳗鲡蛋白酶有激活作用。上述研究结果表明，金属离子对蛋白酶的效应极为复杂多样。

本研究从欧洲鳗鲡肠道中分离筛选出1株高产强降解鱼粉蛋白酶的菌株MJ15，经形态、Biolog、分子生物学鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis。对其所产蛋白酶的酶学特性进行初步研究，结果显示，该酶最适作用温度为40℃，热稳定性较差；最适pH 5.0，对碱较敏感；K⁺、Na⁺、Cu²⁺、Fe²⁺对蛋白酶均有不同程度的激活作用，而Zn²⁺对该酶表现出抑制作用，蛋白酶抑制剂Pepstatin A对蛋白酶活力有一定的抑制作用，说明该酶可能属于天冬氨酸蛋白酶；动力学分析显示该酶的米氏常数K_m＝8.77 mg·mL^-1。