2016, Vol. 31
2. 中兴大学食品暨应用生物科技系, 台湾 台中 402;
3. 韩山师范学院生命科学与食品科技学院, 广东 潮州 521041
2. Department of Food Science and Biotechnology, Chung Hsing Univeresity, Taizhong, Taiwan 402, China;
3. College of Life Sciences and Food Technology, Hanshan Normal University, Chaozhou, Guangdong 521041, China
植物内生真菌Endophytic fungi是指那些在其生活史中的某一段或全部时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌[1-2],对于植物的生长、抗旱性、抗涝性、抗冻性、抗病性等具有重要作用[3]。茶树根际最常见的真菌有青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、木霉属Trichoderma、根霉属Rhizopus、毛霉属Mucor、拟青霉属Paecilomyces、镰刀菌属Fusarium等[4]。植物体内存在大量有益内生真菌,并且内生真菌的代谢产物十分丰富，它们具有多种生物活性，其中抑菌活性最普遍[5]。苏经迁等[6]研究表明,茶树内生真菌长枝Trichoderma longibrachiatum CSN-18和曲霉Aspergillus sp. CSN-3的混合培养液对茶花褐斑病Phyllosticta camelliaecola有明显的抑制作用，增强抗逆性。曾如意[7]从健康茶树叶部分离的内生真菌菌株FHM和内生木霉Trichoderma sp.的代谢产物抑菌活性较强，经乙酸乙酯提取的 FHM 发酵液对茶云纹叶枯病菌Guignardia camellias、茶轮斑病菌Pestalotiopsis theae、茶炭疽病菌Colletotrichum theae、白色念珠菌Moniliaalbican和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有抑制作用。
单丛茶是广东乌龙茶的特色品种，其中以凤凰单丛、岭头单丛最为重要，以滋味浓醇鲜爽，香气似天然花果香而著称[8-10]。关于单丛茶树内生真菌的研究未见报道,本研究通过对单丛茶树不同部位内生真菌进行分离培养，以期筛选出能产生抑菌作用的内生真菌，为新型生物抑菌剂的研究开发提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器 1.1.1 材料[BF]样品采集于广东省潮州饶平县浮滨镇有机种植的凤凰单丛茶树和岭头单丛茶树，分别采集茶树的根、茎、叶，采摘后用灭菌的自封袋装好后放入加入冰袋的保温盒中，保存于4℃的冰箱中；试验指示细菌：大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、白色念珠球菌Moniliaalbican，韩山师范学院微生物实验室提供，保存于4℃的冰箱中；植物病原菌：梨果黑斑病菌Alternaria alternate、核桃叶枯病菌Sphaerulina juglandis、梨腐烂病菌Valsa ambiens Pers、红枣黑斑病菌Alternaria sp.、茄腐镰刀病菌Fusariumeggplant、瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani，新疆农业大学农学院提供，保存于4℃的冰箱中。
LD2X-30KA型立式电热压力蒸汽灭菌锅、DHP-9162型电热恒温培养箱，武汉诺贝思机械制造有限公司；TGRADIENT型PCR仪、PowerPac型电泳仪、Fluorchem Xplor型荧光-可见光凝胶成像分析系统，北京弘图科技有限公司。
1.1.2 主要培养基水琼脂：琼脂25 g、蒸馏水1 000 mL，121℃，灭菌15 min；营养琼脂培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，121℃，灭菌15 min； 马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)： 浸出粉6 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL，121℃，灭菌15 min；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)： 浸出粉6 g、葡萄糖20 g、琼脂12 g、蒸馏水1 000 mL，121℃，灭菌15 min； 孟加拉红培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂20 g、1/3000孟加拉红溶液100 mL、蒸馏水1 000 mL、氯霉素0.1 g、121℃、灭菌15 min。
1.2 方法 1.2.1 单丛茶树内生真菌分离纯化消毒方法参考刘杰凤等[11]的方法：先用75%乙醇浸泡根茎叶4 min，无菌水冲洗7次，用3.0%的双氧水浸泡3 min，再用无菌水冲洗10次。
根和茎中内生真菌的分离：采用组织块培养法。将表面消毒后的根和茎剪成0.5 cm×0.5 cm的组织块，每3个组织块为1组置于100 mLPDB培养基中，30℃下培养20 h后，取80 μL涂布于孟加拉红平板上，置于28℃培养5 d。
叶片中内生真菌的分离：采用匀浆涂布法。将表面消毒后整叶剪切成0.5 cm×0.5 cm小片，共10片，移入无菌研钵，加入少许灭菌的石英砂和3 mL无菌水，研磨，取80 μL涂布于孟加拉红平板上，置于28℃下培养5 d。
挑取单个菌落在孟加拉红平板上进行划线，置于28℃下培养5 d，提取单个菌落按此方法进行分离纯化。纯化后观察真菌菌落及个体形态特征。
1.2.2 内生拮抗真菌的筛选(1)抑制试验指示细菌内生拮抗真菌的筛选： ①试验指示细菌活化：挑取一环1.1.1中的试验指示细菌划线于营养琼脂平板，37℃下培养20 h；② 内生真菌无菌发酵液的制备：挑取1.2.1中得到的内生真菌纯菌落接种于PDA平板上，28℃培养5 d，挑取1 cm×1 cm菌块接种于100 mL PDB培养基中，37℃、110 r·min-1培养72 h,将发酵后的菌液经5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，经0.22 μm水系微孔滤膜过滤，去除菌体，制成内生真菌无菌发酵滤液；③ 双层平板法内生拮抗真菌的筛选：参考杨明琰等[12]的方法略作改动,取5 mL冷却到50℃营养琼脂培养基(内含1×104～1×105cfu ·mL-1试验指示细菌)至水琼脂平板上,凝固后用打孔器(外径8 mm)1个平板对称打4个孔，3个孔中各加入内生真菌无菌发酵滤液240 μL，1个孔中加入无菌水240 μL作对照，在4℃放置2 h使无菌发酵滤液扩散，然后37℃培养18 h，测量抑菌圈直径，3 次重复。
(2)抑制植物病原菌的内生拮抗真菌的筛选： ①植物病原菌的活化：挑取一环1.1.1中的植物病原菌划线于PDA培养基上，28℃下培养5 d； ②平板对峙法内生拮抗真菌的筛选：用直径为 5 mm 的打孔器分别切取内生真菌和病原真菌菌落的圆形菌饼，先将植物病原菌的菌饼置于PDA 平板的一侧，同时在距离病原菌4 cm 的相对位置接种内生真菌菌饼。对照为在PDA平板中间只接植物病原菌，28℃培养5 d，观察是否出现拮抗线或者拮抗带，并测量菌落直径[13-14]。
1.2.3 内生拮抗真菌形态学鉴定内生真菌的形态学鉴定依照《真菌分类学》[15]和《真菌鉴定手册》[16]。形态特征观察采用插片法,挑取纯化的内生真菌划线转接于PDA 培养基上，取3片无菌盖玻片，45°斜插至平板，28℃培养3~5 d后，取出盖玻片，显微镜观察内生真菌形态(菌落颜色、大小、表面特征、色素分泌、菌丝体、孢子等)。
1.2.4 内生拮抗真菌18SrDNA序列鉴定 [BF][JP2]采用玻璃珠-盐析法提取内生真菌的基因组 DNA[17-18]。根据已知真菌的保守序列设计特异性引物为AMV4.5F(5'-AAT TGG AGG GCA AGT CTG G-3')和AMV4.5R(5'-AGC AGG TTA AGG TCT CGT TCG T-3')。50 μL PCR扩增体系[19]：引物AMV4.5F和引物AMV4.5R各2.0 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 4 μL、10× PCR Buffer 5 μL、MgCl2 3 μL、TaqDNA聚合酶2.5 μL、模板DNA 0.5 μL、加双蒸水至50 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s,55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测，将18SrDNA扩增产物委托台湾基龙米克斯生物科技股份有限公司进行测序。把测得的序列输入NCBI，与NCBI数据库中已知序列进行比对，使用 Blast 程序对所得序列在 Genebank 中进行同源性比较，选择基因序列同源性在98%以上的真菌序列片段。采用MEGA5.0软件对序列进行ClustalW对比，Neighbor-Joining法构建系统发育树。
2 结果与分析 2.1 内生拮抗菌株的筛选结果从单丛茶树根茎叶中分离出内生真菌共8株，其中命名为F15GEN、F15YE、LB35JING的3株内生真菌至少能抑制1种或1种以上病原菌。
2.1.1 抑制试验指示细菌的内生拮抗真菌筛选结果所有内生真菌对大肠杆菌和白色念珠球菌均无抑菌作用。如图 1～2所示，F15YE对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为14.92 mm，F15GEN对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为13.36 mm。
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图 1 F15YE对枯草芽孢杆菌的抑菌效果 Figure 1 Bacteriostatic effect of F15YE against B. subtilis |
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图 2 F15GEN对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 Figure 2 Bacteriostatic effect of F15GEN against S. aureus |
所有分离出的内生真菌对梨果黑斑病菌、红枣黑斑病菌和瓜果腐霉均无抑菌作用，对其他植物病原菌的抑菌效果如下。
(1)抑制立枯丝核菌的内生拮抗真菌筛选结果： 如图 3所示，对照立枯丝核菌生长直径为85.60 mm，当LB35JING、F15GEN分别和立枯丝核菌共培养时，立枯丝核菌生长直径分别为46.99 mm和44.79 mm，均有明显的拮抗线。
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图 3 LB35JING和F15GEN对立枯丝核菌的抑菌效果 Figure 3 Bacteriostatic effect of LB35JING and F15GEN against R. solani A.左为LB35JING，右为立枯丝核菌；B.左为F15GEN，右为立枯丝核菌；C.立枯丝核菌对照(CK)。 |
(2) 抑制梨腐烂病菌的内生拮抗真菌筛选结果： 如图 4所示，对照梨腐烂病菌生长直径为85.60 mm，LB35JING、F15GEN和梨腐烂病菌共培养时，梨腐烂病菌生长直径分别为38.29 mm和36.79 mm，均有明显的拮抗线。
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图 4 LB35JING和F15GEN对梨腐烂病菌的抑菌效果 Figure 4 Bacteriostatic effect of LB35JING and F15GEN against V. ambiens Pers A.左为LB35JING，右为梨腐烂病菌；B.左为F15GEN，右为梨腐烂病菌；C.梨腐烂病对照(CK)。 |
(3)抑制核桃叶枯病菌的内生拮抗真菌筛选结果： 如图 5所示，对照核桃叶枯病菌生长直径为85.60 mm，F15YE菌株和核桃叶枯病菌共培养时，核桃叶枯病菌生长直径为30.14 mm，有明显的拮抗带。
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图 5 F15YE对核桃叶枯病菌的抑菌效果 Figure 5 Bacteriostatic effect of F15YE against S. juglandis A.左为F15YE，右为核桃叶枯病菌；B.核桃叶枯病菌对照(CK)。 |
(4)抑制茄腐镰刀病菌的内生拮抗真菌筛选结果： 如图 6所示，对照组茄腐镰刀病菌生长直径为78.60 mm，LB35JING菌株和茄腐镰刀病菌共培养时，茄腐镰刀病菌生长直径为39.29 mm，有明显的拮抗带。
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图 6 LB35JING对茄腐镰刀病菌的抑菌效果 Figure 6 Bacteriostatic effect of LB35JING against Fusarium A.左为茄腐镰刀病菌，右为LB35JING；B.茄腐镰刀病菌对照(CK)。 |
如图 7和图 8所示，F15GEN在 PDA 培养基上培养5 d 后菌落的直径为1 cm左右，菌落黑灰色，絮状，分生孢子球形。
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图 7 内生拮抗真菌的菌落形态 Figure 7 Colony morphology of antagonistic endophytic fungi |
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图 8 内生拮抗真菌的个体形态 Figure 8 ndividual morphology of antagonistic endophytic fungi |
F15YE菌落淡黄色，在 PDA 培养基上培养5 d 后菌落的直径为 2 cm左右，中心略凸，有同心环状辐射纹，中央形成的小丘较大，分生孢子梗细长，顶部扫帚状。
LB35JING菌落淡红色，在 PDA 培养基上培养5 d 后菌落的直径为 4 cm左右，分生孢子梗较细，分生孢子呈梨形或梭形。
上述3种霉菌与《中国真菌志》(第五卷)青霉属(Aspergillus)形态描述相似。
2.3 内生拮抗真菌18S rDNA序列鉴定如图 9所示，F15GEN、F15YE、LB35JING的DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳约在750~1000 bp处出现荧光条带。
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图 9 三株内生拮抗真菌DNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果 Figure 9 Agarose gel electrophoresis on amplified DNA products of three strains of antagonistic endophytic fungi |
经测定，LB35JING、F15GEN、F15YE、菌株的18SrDNA基因片段大小分别为843、781、787 bp。
综合同源性比对结果，从GenBank中选择基因序列同源性在 98%以上的真菌序列片段，用MEGA5.0软件对序列进行ClustalW对比，Neighbor-Joining法构建的系统发育树如图 10所示，F15GEN菌株与斜卧青霉菌Penicillium decumbens同源性最高，因此F15GEN菌株为斜卧青霉Penicillium decumbens。F15YE和LB35JING菌株与青霉属Penicillium sp.同属一个分支，F15YE和LB35JING菌株均属于青霉属Penicillium sp.。
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图 10 内生拮抗真菌的系统发育树 Figure 10 Phylogenetic trees of antagonistic endophytic fungi |
植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，其次级代谢中的抑菌物质具有很好的开发利用价值，能协助宿主植物抵制病原菌的侵染[20]，杨冠英[21]对从苍山山系的大理茶树中分离得到的内生真菌的代谢产物提取物做抑菌试验,筛选出的盘多毛孢属seimatcsporium、刺盘孢属柑橘刺盘孢菌Colletotrichum gloeosporioides对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌有一定的抑制作用。谢丽华[22]从茶树中分离的内生木霉Trichoderma spp.、拟盘多毛孢Pestalotiopsis spp.和青霉Penicillium spp.对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bscillus subtilis、大肠杆菌Escherichia coli、藤黄八叠球菌Sarcina Lutea Schroeter、变形杆菌Proteus vulgaris，短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、青枯菌Ralstoniasolanacearum和甘薯薯瘟病菌Fasarium oxyssporam有明显的抑菌作用。
本研究结果表明，从单丛茶树分离出的内生真菌的代谢产物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用，对供试部分农林作物的病原菌具有不同程度的抑菌作用。对有拮抗作用的内生真菌有效抑菌活性成分的组成及功效有待于进行深入研究。
从单丛茶树中筛选出的内生拮抗真菌F15GEN对金黄色葡萄球菌抑菌圈为13.36 mm，F15YE对枯草芽孢杆菌的抑菌圈可达到14.92 mm，LB35JING、F15GEN对立枯丝核病原菌和梨腐烂病原菌的生长均有抑制作用，F15YE对核桃叶枯病原菌的生长有抑制作用，LB35JING对茄腐镰刀病原菌的生长有抑制作用。经形态学和18S rDNA序列鉴定：F15GEN为斜卧青霉Penicillium decumbens，F15YE 和LB35JING均属于青霉属Penicillium sp.。
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