短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis是从芽胞杆菌属分立出的一个独立的属，该属细菌细胞呈杆状，(0.7~0.9)μm×(3~5)μm，革兰氏阳性或可变，以周生鞭毛运动，在膨大孢囊内含椭圆形芽孢，菌落平整、光滑，无可溶色素^{[1, 2]}。短短芽胞杆菌具有分泌蛋白能力强、胞外蛋白酶活性低等优点，是分泌表达蛋白较理想的宿主^{[3, 4]}。另外，其在环保、生防、化工、食品等方面也得到了很好的应用。如可作用于原油，通过氧化过程将高碳原油烃降解成低碳烃，提高原油的采收率^[5]；可抑制尖孢镰刀菌、香蕉枯萎病菌、棉花立枯病菌、黄萎病菌、炭疽病等的生长^{[6, 7, 8]}；可诱导烟草的系统抗性，增强烟草的抗病能力^[9]。随着短短芽胞杆菌功能的发掘，其应用范围也越来越广。

微生物代谢组学是指全面分析细胞生长或生产周期某一时刻细胞内和细胞外的所有低分子量代谢物，它在发酵控制、代谢控制及菌种改良方面的应用取得较好的效果^{[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]}。胞内代谢物的分析不仅在代谢组学研究，如内在酶动力学或代谢调节中起到关键的作用，而且对代谢工程研究也非常重要^{[11, 12, 14]}。细胞壁破碎方法对胞内代谢物质的获取至关重要，目前广泛采用的细胞壁破碎方法有高速珠磨法、高速匀浆法、化学渗透法、酶学法、微波细胞破碎、超声波细胞破碎等，各种方法都有其适用范围和优缺点^[17]。超声波通过对介质的空化作用及力学、热学和生物学等特殊效应，能显著提高提取量或浸出速度2-10倍，且副产物较少^[18]，从而利于细胞破碎。超声波破碎法在大肠杆菌^[19]、蜡样芽胞杆菌^[20]、瑞士乳杆菌^[21]等胞内蛋白或酶提取方面应用广泛。短短芽胞杆菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁较厚，肽聚糖网状结构较致密，破碎具有一定的难度，关于短短芽胞杆菌胞内代谢物质提取方法的优化目前尚未见报道。

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX是本课题组自行分离的生物防治菌株，该菌对大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、真菌轮枝霉、胶孢炭疽菌、桃褐腐丛梗孢和青枯雷尔氏菌等多种病原菌显示出较强的拮抗活性^[6]。本研究探讨短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX细胞壁破碎条件优化，对超声波功率、超声时间及料液比等单因素条件进行摸索，利用design-expert软件进行响应面的设计，以所得胞内代谢物质重量为响应值，所得数据利用相关软件进行分析，得出回归方程系数及最优破碎条件，以期为短短芽胞杆菌胞内代谢物质的获得和分析奠定基础。

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX由本课题组自行分离并保存。LB液体培养基：1%胰蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5% NaCl，pH7.0-7.2。JY92-2D超声波细胞破碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

将活化后的短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX转接到20 mL LB液体培养基中，30℃ 170 r·min^-1过夜培养，制备种子液；将种子液按1%接种量转接到发酵罐中，30℃，发酵48 h，6 000 r·min^-1离心15 min，弃上清，收集菌体；采用蒸馏水洗涤菌体4次，离心后获得的菌体用于超声波破碎试验。

(1)超声破碎时间对胞内代谢物质提取的影响。菌体和水(料液比)1∶15(g∶mL)，超声功率为500 W，超声破碎总时间分别设置为10、20、30、40、50 min。试验重复3次。

(2)超声功率对胞内代谢物质提取的影响。料液比1∶15(g∶mL)，超声破碎时间30 min，超声波功率分别是100 、300 、500 、700 、900 W。试验重复3次。

(3)料液比对胞内代谢物质提取的影响。超声破碎时间30 min，超声功率为500 W，料液比(g∶mL)设置为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25。试验重复3次。

依据以上设置的条件进行细胞破碎，利用10 mL等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，40℃旋转蒸发，获得胞内代谢物质。胞内代谢物质重量=旋转蒸发瓶总重量-旋转蒸发瓶空瓶重量。

以获得的胞内代谢物质重量为选择标准，选出较优单因素条件进行响应面设计，进而获得最优破碎条件。

数值采用平均值±标准差表示，所有数据采用Microsoft Excel 2003 和 SPSS进行统计分析，差异显著性则用Duncan氏法进行多重比较。

超声时间长短对胞内代谢物质的获取影响不显著。从获取量来说，当超声时间为30 min时，获得的胞内代谢物质较多，胞内代谢物质得率为11 mg·g^-1，超声时间为10～30 min时，胞内代谢物质得率随超声时间的增加而增加，即随超声时间的延长，细胞破碎越充分，致使较多胞内代谢物质释放；而超声时间为30～50 min时，胞内代谢物质得率随超声时间的增加而减少，说明超声波功率过大，对胞内代谢物质的获得反而不利(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同超声时间对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内代谢物质得率的影响 注：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。 Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment time on yield of intracellular metabolites of Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX

超声波功率对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内代谢物质提取影响不显著。超声波功率为100 W时，所得胞内代谢物质得率最高，为9.33 mg·g^-1；超声波功率大于等于300 W时，所提取胞内代谢物质得率相差不大，分别为8.56、8.44、8.78、8.11 mg·g^-1(图 2)。

图 2(Fig. 2)

图 2 不同超声波功率对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内代谢物质得率的影响 Fig. 2 Effect of ultrasound power on yield of intracellular metabolites of Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内代谢物质得率随料液比的降低而增加(图 3)，料液比1∶10时，胞内代谢物质得率最低，料液比1∶25时所得胞内代谢物质得率最高，为12.22 mg·g^-1。料液比1∶15和1∶20时，胞内代谢物质得率基本相同，即料液比为1∶15和1∶20时，细胞壁破碎效果比较稳定。由此推断，料液比1∶25为胞内代谢物质提取的适当浓度。

图 3(Fig. 3)

图 3 不同料液比对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内代谢物质得率的影响 Fig. 3 Effect of cell/liquid ratio on yield of intracellular metabolites of Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX

以单因素试验结果为基础，进行响应面试验设计，选取超声破碎时间、超声波功率和料液比作为3个主要影响因素，采用3因素3水平响应面分析法(表 1)，应用统计软件Design-expert设计试验并进行结果分析(表 2)。

表 1(Table 1)

表 1 3因素和3水平的取值Table 1 Three factors and 3 level values 因子 水平 -1 0 1 超声时间/min 10 30 50 超声功率/W 100 500 900 料液比/(g∶mL) 1∶25 1∶20 1∶15

表 1 3因素和3水平的取值 Table 1 Three factors and 3 level values

表 2(Table 2)

表 2 试验矩阵及结果Table 2 Test sheet and result 试验号 超声时间/min 超声功率/W 料液比/(g∶mL) 得率/(mg·g-1) 1 30 500 1∶20 11.30 2 50 500 1∶25 4.02 3 10 100 1∶20 1.83 4 10 500 1∶15 4.92 5 30 500 1∶20 11.30 6 30 500 1∶20 11.30 7 50 500 1∶15 6.53 8 50 900 1∶20 2.89 9 50 900 1∶20 2.89 10 30 900 1∶15 4.74 11 30 100 1∶15 4.13 12 10 500 1∶25 15.57 13 30 500 1∶20 11.30 14 30 100 1∶25 15.59 15 10 900 1∶20 5.77 16 30 500 1∶20 11.30 17 50 100 1∶20 2.50

表 2 试验矩阵及结果 Table 2 Test sheet and result

利用Design-Expert软件对表 2中的数据进行多元回归拟合，以短短芽胞杆菌胞内代谢物质得率(Y)为响应值，超声波功率(A)、超声破碎时间(B)和料液比(C)为试验因子，进行二次多项回归模型的拟合，二次多项回归模型为：

Y=11.30-1.33A-1.52B-1.86C-4.85A²-3.20B²-0.34C²-0.89AB+4.05AC+3.29BC

式中，Y为胞内代谢物质得率；A、B、C分别代表超声波功率、超声时间和料液比。该模型R² =0.9724，表明该模型的拟合程度较好，可以解释97.24%响应值变化。

回归模型的方差分析结果显示，超声时间、超声功率、料液比3个因素在细胞破碎过程中均起作用，对胞内代谢物质得率的影响程度依次为：料液比>超声破碎时间>超声功率，超声功率与料液比间的交互作用较明显，超声破碎时间与料液比的交互作用较显著，仅超声功率与超声破碎时间的交互作用不显著(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis for regression model 方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 324.40 9 36.04 4.64 0.0276 A 14.18 1 14.18 1.83 0.2186 B 18.45 1 18.45 2.38 0.1670 C 27.60 1 27.60 3.56 0.1013 A2 98.99 1 98.99 12.75 0.0091 B2 43.22 1 43.22 5.57 0.0504 C2 0.48 1 0.48 0.061 0.8115 AB 3.15 1 3.15 0.41 0.5443 AC 65.61 1 65.61 8.45 0.0227 BC 43.30 1 43.30 5.58 0.0502 残差 54.33 7 7.76 - - 失拟项 54.33 3 18.11 - - 纯误差 0.000 4 0.000 - - 总和 378.73 16 - - -

表 3 回归模型的方差分析 Table 3 Variance analysis for regression model

通过拟合方程所作的响应面立体分析图显示，料液比与超声时间、料液比与超声功率的交互作用较显著(图 4)，而超声破碎时间与超声功率的交互作用不显著。以单因素条件摸索为基础，应用响应面试验设计软件，设计并分析得到最优细胞破碎条件为：超声功率为318.68 W，超声时间为10 min，料液比为1∶25，理论预测得率为13.358 6 mg·g^-1，根据预测最优条件进行验证，得率为12.987 8 mg·g^-1，仅偏差0.370 7 mg·g^-1，模拟程度较好。

图 4(Fig. 4)

图 4 试验因素交互影响胞内代谢物质得率的响应曲面图 Fig. 4 3D response surface diagram on metabolite yields by interacted experimental factors

细胞破碎手段很多，主要可分为机械法和非机械法^[22]。机械法包括匀浆法、研磨法、超声波法等；非机械法包括渗透法、酶溶法和冻溶法等。超声波具有成本低、操作简单、不需要太高的输出功率且不要求精良的设备和技术培训，十分适合实验室规模的细胞破碎^{[23, 24]}。超声波有强烈的生物学效应，进行超声波处理时，超声波的高频震动与微生物细胞的振动不协调，造成细胞周围环境局部真空，使细胞膜产生空穴作用，从而使之破碎^{[25, 26]}。超声波破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。超声波破碎时间、功率和料液比对细胞壁破碎的效果均具有一定的影响。

石荣莲等^[27]通过单因素试验和正交试验得出重组大肠杆菌的最佳破碎条件为：菌液浓度40 mg·mL^-1，菌液体积50 mL，超声波工作时间4 s，间歇时间8 s，超声波破碎强度50%，总工作时间6 min，NaCl浓度为0.15 mol·L ^-1。在该条件下获得褐藻胶裂解酶粗酶液的酶活为21 U·mL^-1。李聚海等^[28]系统研究了利用超声波法提取时输出功率、工作总时间、水添加量等因素对根癌土壤杆菌细胞破碎和辅酶Q10提取效果的影响。超声波提取辅酶Q10的最佳工艺条件为：输出功率500 W，工作总时间12 min，水添加量45 mL· g ^-1。本研究探讨了不同超声波功率、不同超声时间和不同料液比单因素对短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX细胞壁破碎的影响，结果表明，当超声波功率为100 W、超声时间为30 min、料液比为1∶25时，胞内代谢物质得率最高。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX细胞壁破碎超声波功率低于蜡样芽胞杆菌(超声波功率为600 W)和大肠杆菌(超声波功率为480 W)，超声波总时间和料液比则高于蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌^{[19, 20]}，因此推测，不同菌株超声波破碎条件不同，很可能与菌株细胞壁厚度不同有很大关系。

响应面是一种统计学软件，在优化生物过程中应用广泛，本研究利用该软件进行合理的试验设计，利用试验所得数据，建立多元二次回归方程，以拟合因素与响应值间的函数关系，建立连续变量曲面模型，以评价因素间的相互作用，进而确定最佳水平范围。该方法在发酵工艺研究中应用广泛，如徐慧等^[29]利用该方法优化枯草芽胞杆菌3-羟基丁酮发酵培养基；张宇光等^[30]用于优化短杆菌素的发酵；王海平等^[31]用于优化樱桃果酒的发酵。响应面优化也已广泛应用于细胞破碎及胞内物的提取的工艺优化中^{[32, 33, 34]}；如李芳亮等^[35]利用该方法优化沙棘叶中水溶性多糖提的取条件；于帅等^[36]优化板栗仁中多酚物质提取条件。张强等^[37]为提取醋酸钙不动杆菌的PAHs降解酶。在对超声输出功率、工作/间隔时间、菌体稀释倍数以及超声时间进行单因素试验的基础上，利用Box-Behnke中心组合试验设计，响应面法优化得到多环芳烃降解酶的最佳提取工艺。

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX胞内代谢物质提取对于后续的生理生化分析影响巨大，但关于短短芽胞杆菌细胞破碎条件优化的研究未见报道。本研究采用响应面法对细胞破碎条件进行优化，发现对胞内代谢物质得率的影响程度依次为：料液比>超声破碎时间>超声功率。获得最优细胞破碎最优条件是：超声功率318.68 W，超声时间10 min，料液比1∶25，预测得率为13.358 6 mg·g ^-1，根据预测最优条件进行验证，得率为12.987 8 mg·g ^-1，仅偏差0.370 7 mg·g ^-1，拟合程度较好。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX细胞壁破碎条件优化结果与利用超声波破碎醋酸钙不动杆菌细胞提取多环芳烃降解酶结果相似，张强等^[37]利用Box-Behnke中心组合实验设计，响应面法优化得到多环芳烃降解酶的最佳提取工艺为：工作/间隔时间为2 s/2 s、超声功率320 W、总超声时间17 min、稀释倍数12.5，在此条件下提取的酶活力为190.48 U·g ^-1。

随着生物工程技术的发展，短短芽胞杆菌的应用变得越来越广，而找到其有效的破碎方法，具有非常重要的理论和实践意义。本研究优化得出的超声波破碎条件对其他革兰氏阳性菌细胞内代谢物质的提取有一定的指导意义，在低功率、短时超声条件下能得到较多的胞内代谢物质，但材料以及试验目的的改变，比如革兰氏阴性菌及动植物细胞的提取，将会导致破碎最佳参数的较大差异。