2015, Vol. 30
2. 福建农林大学教育部重点实验室农业生态研究所, 福建 福州 350002
2. Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology of Fujian Universities, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
水稻作为我国最重要的粮食作物之一，其播种面积占整个粮食播种面积的26%~28%[1]。我国不少稻区农民为了追求高产而盲目施肥，造成了生产成本提高、肥料浪费和氮肥利用率低等问题[2]。以往研究多从营养性状、遗传与分子生理特性出发来探讨水稻营养高效利用、高产和优质形成的过程与机制[3]，然而，水稻要实现产量品质高与资源利用高效，不仅需要有良好的地上部“叶光合系统”，而且也需要有健康的“根际土壤系统”。根际作为水分和矿质养分进入植物根系、参与生物循环的门户，同时也是微生物活动和植物根系自身活动与代谢过程影响最直接、最强烈的区域[4]。氮肥的施用，必然是先通过影响水稻根际土壤生态系统功能，进而影响地上部水稻的生长发育。因此，要明确水稻氮肥高效利用的机制，就必须明确其对根际生态系统的调控机制。基于上述研究背景，本研究结合水稻产量变化，以水稻根际土壤为研究对象，分析不同氮肥运筹方式下水稻根际土壤理化指标及土壤酶活的变化，采用本实验室前期优化建立的土壤代谢组学方法，即采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析水稻根际土壤物质成分与含量变化，探讨水稻根际土壤代谢物质类型，以期为揭示水稻氮肥高效利用的根际分子生态学过程与机制提供科学依据和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 材料种植本研究选取大穗型水稻品种(Oryza sativa L. ssp. indica)‘金恢809’为材料。大田种植，插植规格为15 cm×15 cm。试验地土壤理化性质：沙壤土，pH值6.2，全氮2.20 g·kg-1、速效氮40.6 mg·kg-1、全磷0.65 g·kg-1、速效磷26.6 mg·kg-1、全钾1.05 g·kg-1、速效钾30.16 mg·kg-1。施氮量按每667 m2施纯氮15 kg。在保持总施氮量不变的前提下，设2种氮肥比例，即传统栽培管理的施肥方式，作为对照组(NT，基肥∶分蘖肥∶穗肥=6∶3∶1)和前氮后移的高产施肥方式(NP，基肥∶分蘖肥∶穗肥∶粒肥=3∶3∶3∶1)。供试肥料为肥料尿素(含46%的N)，钾肥为氯化钾(含60%的K2O)，磷肥为过磷酸钙(含12%的P2O5)。
1.2 水稻产量及其构成因素测定水稻成穗率考查从移栽至抽穗期每间隔5 d调查1次茎蘖数，每个处理各20穴。成熟期田间考查有效穗数，每小区随机取10丛，将穗烘干后考查总粒数、结实率、千粒重。同时测定每区理论产量和实际产量。
1.3 土壤取样及测定本实验于水稻孕穗期和灌浆期分别收集两个不同处理的水稻根际土壤样品，共4份样品。土壤在去除表面植物残体后，过1 mm筛。参照伍俊艺等[5]的方法，使用3,5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶；苯酚-次氯酸钠比色法测定脲酶。酶的活性以单位干土质量在单位时间内所生成的特定产物的质量表示(μg·g-1·h-1)。速效氮测定采用碱解扩散法；速效磷测定采用钼锑抗比色法；速效钾采用醋酸铵—火焰光度计法；土壤pH 值测定采用电位法(水土比为2.5∶1)。
1.4 土壤代谢物质的提取参照Weckwerth等[6]的代谢物质提取法略作修改。具体如下：取5 g水稻根际土壤样品，加入5 mL甲醇，超声提取30 min；4℃ 11 000 r·min-1离心，取2 mL上清液；加入750 μL氯仿和1 400 μL双蒸水，混匀；2 200 r·min-1离心15 min，取300 μL上清冻干；加入10 μL 10 mg·mL-1核糖醇溶液(内标)以及40 μL甲氧氨基化试剂(20 mg·mL-1吡啶溶液)；37℃反应2 h，持续震荡；加入70 μL MSTFA(硅烷化试剂)；37℃反应30 min，持续震荡。离心取上清存放于-20℃备用。
1.5 气相质谱鉴定(GC-MS)气相质谱仪为varinaic 240GC-450MS，色谱柱为：Fac-torFourTM:capillary column VF-5 ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm。GC-MS条件：程序升温: 初始温度70℃,以5℃·min-1升至280℃，保持2 min，再以20℃·min-1升至300℃，保持20 min。总运行时间49 min。进样口温度220℃，载气为氦(He)，流量1 mL·L-1，进样量为1 μL。质谱条件: EI电离方式，电子能量70 eV，阱温200℃，阱外套温度50℃，传输线温度280℃；扫描范围50~1000 amu。用谱图库(NIST98 & WILEY)检索确定各种化合物。
1.6 数据统计分析数据利用DPS 7.05、Excel和SIMCA-P+12.01软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析 2.1 不同氮肥运筹对水稻产量及构成因素的影响由表 1可知，前氮后移的高产施肥方式(NP)与传统施肥方式(NT)相比，水稻最高茎蘖数显著减少，分蘖成穗率明显提高14.24%，有效穗差异虽不显著，但每穗粒数、结实率及千粒重明显增加，进而提高实际产量达7.7%。
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表 1 不同氮肥运筹下水稻产量及构成因素 Table 1 The grain yield and its components under different nitrogen ratios |
从表 2中可知，与NT相比，NP处理在孕穗期时土壤速效氮与速效磷含量显著下降，然而在灌浆期时呈现相反的趋势；NP处理与NT对照的土壤速效钾在孕穗期差异不显著，但是到了灌浆期时NP处理的速效钾含量显著增加。说明在水稻生育后期适当增加氮肥的供应量能够提高土壤养分的有效性。
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表 2 不同氮肥运筹对水稻根际土壤理化指标及酶活的影响 Table 2 The physico-chemical properties and enzyme activity of the soil under different nitrogen ratios |
同时，从表 2中可知，2种酶活性从孕穗期到灌浆期，都呈下降的趋势，但在NP处理下，脲酶和蔗糖酶活性都比NT对照组高，尤其在孕穗期差异更加明显，表明水稻生育后期适当增加氮肥的供应量能够提高稻田根际土壤的脲酶和蔗糖酶的活性。
2.3 不同氮肥运筹下水稻根际土壤差异物质分析本研究共鉴定到93个土壤代谢物质(表 3)，其中在水稻孕穗期，NT处理下鉴定到物质80个，NP处理下有88个。进一步对这些代谢物质进行分类，结果表明，在不同氮肥比例处理下的水稻根际土壤的代谢物质主要有16 大类，如羧酸类、酯类、酮类、酚类等。其中羧酸类物质15种，酯类物质13种，酮类物质19种，酚类物质7种等(表 3)。
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表 3 不同氮肥运筹下的土壤代谢物质 Table 3 metabolites of the soil under different nitrogen ratios |
本研究运用SIMCA-P+12.01软件来分析不同氮肥运筹对土壤代谢物质的影响。采用了内部验证的方法，通过模型拟合的Q2值来表示模型的预测能力。通常情况下，Q2大于0.9代表模型的预测能力很强；Q2大于0.5代表模型的预测能力一般；Q2值很小时则代表模型的预测能力很差。如图 1A和图 1B所示，不同时期不同的氮肥处理之间模型拟合的Q2值大于0.9，说明了2组不同处理的模型预测能力很强。而且R2与Q2值的差别不大，由此可以推断模型质量较好，拟合处理能够有效地找出样品分类的最大差异，适合做后续分析。
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图 1 不同氮肥运筹下土壤物质的拟合模型不同氮肥运筹下土壤物质的拟合模型 注：A为孕穗期，B为灌浆期。 Fig. 1 Fitted model of soil metabolite during booting and filling stage under different nitrogen ratios |
本研究应用PCA方法对观测数据的组间分离趋势以及是否存在异常数据进行分析。如图 2A和图 2B所示，通过PCA方法的3-D图可知，2组别之间具有明显的分异趋势，说明氮肥处理对不同生长时期的水稻根际土壤样本的物质代谢模式均有显著影响。
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图 2 不同氮肥运筹下根际土壤物质主成分3D分析 注：A为孕穗期，B为灌浆期。 Fig. 2 3D PCA of soil metabolite during booting and filling stage under different nitrogen ratios |
按照PLS-DA结果中的VIP值排列，当VIP值大于1时，则认为是差异明显的物质。据此，本研究发现在水稻4份根际土壤中，响应氮肥调控出现变化的代谢物质主要有7大类，共20种物质(表 4，5)。其中，在NP处理下，土壤物质里的有机酸含量在孕穗期(间羟基苯甲酸、油酸)以及在灌浆期(间羟基苯甲酸、油酸、脱氢胆酸)均呈现上升趋势。
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表 4 孕穗期不同氮肥运筹下土壤差异物质 Table 4 Differentially regulated metabolites of the soil during booting stage under different nitrogen ratios |
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表 5 灌浆期不同氮肥运筹下土壤差异物质 Table 5 Differentially regulated metabolites of the soil during grain filling stage under different nitrogen ratios |
本研究发现，在总施氮量不变的情况下，适当增加水稻生育后期氮肥的施用量(NP处理)，能显著地减少无效分蘖，提高成穗率，最终促成水稻高产。这与李忠等[7]和张志兴等[8]关于不同氮肥运筹的研究结果相一致。
3.2 不同氮肥运筹对土壤理化性质及酶活性的影响土壤对pH 值的变化有一定的缓冲能力[9]。本研究发现，不同施氮处理对土壤pH值产生显著影响。有研究表明尿素的水解过程会使土壤pH上升，但由于铵态氮被硝化时会产生质子，尿素的施加最终会使土壤pH值下降[10]。本研究发现在孕穗期时，NP处理的pH 值低于对照，这可能是因为NT对照组前期重施氮肥，因此土壤硝化作用较弱，施氮后土壤pH 值的变化以尿素水解作用为主导，尿素水解形成铵态氮，过多的铵态氮易引起氨的挥发，从而造成氮肥浪费。Allison等[11]施氮试验也发现了类似现象。但是到了灌浆期，NP处理的pH 值仍然低于对照，这可能施氮后土壤pH 值的变化以铵态氮转硝态氮为主导，从而造成pH值的下降。有研究表明，施氮可以有效增加土壤的全氮和碱解氮含量[12]。在本研究中，孕穗期时由于NT对照重施氮肥，所以土壤速效氮含量上升；灌浆期时NP处理追施氮肥施氮，从而增加土壤速效氮的含量。同时，本研究发现，NP处理能够有效提高水稻孕穗期及灌浆期土壤蔗糖酶和脲酶活性。土壤酶活在土壤生态系统受很多因素的影响，其产生的主体是微生物。随着氮肥的施用，必然会对根系和根际微生物产生影响，从而进一步影响微生物多样性、微生物群落结构以及土壤酶活等[13]。脲酶是与植物和微生物的氮获取相关的一种酶，其活性的增加可以使土壤有机氮矿化速率加快[14, 15]。
3.3 不同氮肥运筹对土壤代谢物质的影响本研究通过土壤代谢组学策略，探讨了氮肥对水稻根际土壤物质代谢的影响及其作用机制。结果表明，在不同氮肥运筹方式下，在孕穗期和灌浆期，分别鉴定到11个和13个差异代谢物质，这些物质在水稻根际土壤生态系统中参与氮素对根际生态系统的调节。本研究发现，在NP处理下，土壤物质里的有机酸含量在孕穗期(间羟基苯甲酸、油酸)以及在灌浆期(间羟基苯甲酸、油酸、脱氢胆酸)呈现上升趋势，说明在NP处理下，即前氮后移的施肥方式下，有助于水稻土壤里酸类物质含量的积累，但对于土壤的含氮化合物(如氨基酸等物资)影响不大。可见，后期土壤的物质代谢以碳代谢为主，因此适当前氮后移有利于维持土壤以碳代谢为主，碳氮代谢协调发展的根际生物学机能。
有大量研究表明，当土壤里面的有机酸含量增加时，能显著提高土壤脲酶、蔗糖酶的活性[16, 17]。袁光林等[18]研究也指出，当酚酸类物质添加进土壤时，其对土壤脲酶存在显著的刺激作用。马云华等[19]认为，适当浓度酚酸类物质会刺激细菌繁殖和生长，尤其是硝化细菌的数量，约提高了4～9倍。朱静平等[20]的研究也认为植物根系分泌物中的有机酸对氨化细菌的生长具有促进作用。由此可见，高产氮肥运筹方式(NP)能够促进水稻根系分泌大量有机酸，刺激营养元素转化相关细菌的生长，导致营养循环相关酶活性的上升，提高土壤养分有效性，促进水稻对养分的吸收，达到提高氮素利用率，实现水稻高产优质安全生产的目的。
综上所述，在总施氮量不变的情况下，适当增加水稻生育后期的氮肥施用，能够有效地提高氮肥的利用率及水稻的产量。后期增加氮素的供应能够促进水稻根际土壤中有机酸的积累，提高土壤养分的有效性，从而促进了水稻对养分的吸收，实现高产优质高效的目的。本研究首次从代谢组学的水平上研究了氮肥对稻田根际生态系统调控的机制，深化了传统的作物栽培学理论，为后续水稻高产生态栽培提供依据。但是，后续研究需进一步分析不同氮肥运筹方式对水稻根际土壤微生物群落结构与功能多样性的影响，以及探索土壤差异代谢物质与特定关键菌群(如硝化细菌、氨化细菌等)的根际互作过程与作用。
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