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  福建农业学报  2015, Vol. 30 Issue (11): 1064-1070  
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郑学立, 刘生财, 谢礼洋, 等.苋菜AmaDOPA5-GT基因的启动子克隆、亚细胞定位及表达分析[J].福建农业学报, 2015, 30(11): 1064-1070.
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ZHENG X-L, LIU S-C, XIE L-Y, et al.Promoter-cloning, Protein Subcellular Localization, and Expression Analysis for AmaDOPA5-GT Gene of Amaranth tricolor[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2015, 30(11): 1064-1070.
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基金项目

高等学校博士学科点专项新教师类科研基金项目(20123515120009);福建省自然科学基金项目(2013j05045);福建省教育厅a 类项目(ja12098)

通信作者

赖钟雄(1966-),男,研究员,主要从事园艺植物生物技术及分子生物学研究(E-mail:laizx01@163.com)

作者简介

郑学立(1975-),男,博士生,助理研究员,主要从事蔬菜育种及园艺植物生物技术研究(E-mail:99345054@qq.com)

文章历史

收稿日期:2015-09-28初稿;
2015-10-25修改稿
苋菜AmaDOPA5-GT基因的启动子克隆、亚细胞定位及表达分析
郑学立1, 2, 刘生财1, 谢礼洋1, 程春振1, 赖钟雄1     
1. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所, 福建 福州 350002;
2. 福州市蔬菜科学研究所, 福建 福州 350111
摘要: 对获得的苋菜环多巴5-糖基转移酶基因(AmaDOPA5-GT)进行生物信息学和蛋白亚细胞定位分析,并利用染色体步移技术克隆该基因的启动子。亚细胞定位结果表明,AmaDOPA5-GT定位于细胞膜。启动子分析结果表明AmaDOPA5-GT启动子中植物光响应元件多达8个,说明光对该基因的表达影响较大。色素含量测定及实时定量PCR结果显示:暗处理抑制苋菜苷合成和AmaDOPA5-GT表达;黄光和绿光抑制苋菜苷合成但对AmaDOPA5-GT表达影响不大;红光显著抑制苋菜苷合成但却显著诱导AmaDOPA5-GT表达;蓝光显著促进苋菜苷合成和AmaDOPA5-GT表达。本研究可为揭示AmaDOPA5-GT基因在苋菜苷的作用奠定基础并为富含甜菜红色素苋菜苷的苋菜育种提供线索。
关键词: 苋菜    DOPA5-GT    启动子    光质    甜菜红色素合成    
Promoter-cloning, Protein Subcellular Localization, and Expression Analysis for AmaDOPA5-GT Gene of Amaranth tricolor
ZHENG Xue-li1, 2, LIU Sheng-cai1, XIE Li-yang1, CHENG Chun-zhen1, LAI Zhong-xiong1     
1. Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
2. Institute of Vegetable Science of Fuzhou, Fuzhou, Fujian 350111, China
Abstract: Bioinformatic characteristics and protein subcellular localization of AmaDOPA5-GT gene in Amaranth tricolor were studied. The chromosome walking technique was applied to clone the gene promoter. The protein was found to be located in the cytomembrane. Eight light-responsive elements were identified in the promoter, suggesting that light might be associated with the regulation of the gene expression. The amaranthin content and quantitative real time PCR showed that darkness suppressed both betalain biosynthesis and AmaDOPA5-GT gene expression; red light also suppressed betalain biosynthesis, but significantly enhanced the gene expression; yellow and green light showed no effect on the gene expression, but suppressed the betalain biosynthesis; and, blue light induced both betalain biosynthesis and the gene expression. The results obtained provided a basis for further exploring the function of AmaDOPA5-GT in betalain biosynthesis, as well as a guideline for breeding betalain-rich amarnath.
Key words: amaranth    DOPA5-GT    promoter    light    betalain biosynthesis    

苋菜种类繁多,营养丰富,适应性强,种植广泛[1, 2, 3, 4]。近些年,食品安全问题日益严峻,人们对天然色素的关注越来越多。苋菜富含甜菜红色素,其取材方及色素的提取较为方便,使得它渐渐替代甜菜作为一种重要的天然色素提取资源的地位。

在苋菜中,甜菜红色素主要以苋菜苷和异形苋菜苷形式存在[5]。甜菜红色素合成途径目前逐渐清晰,其中涉及的主要酶和基因主要有酪氨酸酶、双加氧酶、多巴脱羧酶和糖基转移酶。糖基转移酶分为两类,一类是甜菜苷5-氧-糖基转移酶和甜菜苷6-氧-糖基转移酶,分别利用UDP-葡萄糖形成糖苷甜菜苷5-氧-糖甙和甜菜苷6-氧-糖甙;另一类只有一个是4,5环多巴5-氧-糖基转移酶,环多巴葡萄糖苷通过其他路径进行的糖基化[6, 7, 8]。Wyler等[9]发现在甜菜的幼根和老根中环多巴糖甙的含量占总甜菜红素含量的46%和12%,认为环多巴糖甙参与或涉及甜菜碱的合成途径。Sasaki等[10, 11, 12]在鸡冠花花朵的粗提物中观察到cyclo-DOPA5-O-glucosyltransferase的活性,并认为催化cyclo-DOPA glucoside直接完成糖基化,而不是在甜菜苷进行,它导致一条新的基于酪氨的甜菜红素生物合成途径。DOPA5-GT编码的基因在籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)[13]、鸡冠花(Celosia cristata)和紫茉莉(Mirabilis jalapa)[14]等多种石竹目植物中得到克隆。甜菜红素的合成受多种因素的影响,其中光对色素的累积影响较大。Zhao等[15]通过试验表明光质和光强影响盐地碱蓬甜菜红色素的合成。光质也影响甜菜毛状根甜菜红色素的累积[16]。在不同光质中,蓝光比红光更有利于甜菜红色素的积累[17]

在本课题组之前的研究中,以苋菜转录组测序结果作为参考[18],利用RT-PCR结合RACE技术成功克隆到苋菜AmaDOPA5-GT基因(GenBank登录号:KP174811)。DOPA5-GT是甜菜红色合成途径中关键基因[6, 7, 8, 9],为进一步挖掘该基因在苋菜苷合成过程中的作用,本研究中对AmaDOPA5-GT基因进行了生物信息学分析,并通过构建AmaDOPA5-GT-GFP表达载体研究该基因编码的蛋白的亚细胞定位情况。另外,本试验利用交错式热不对称PCR染色体步移(Tail-PCR)技术对AmaDOPA5-GT启动子进行克隆并对其进行在线功能预测,根据预测的结果,对苋菜进行不同光质处理,研究不同光质对AmaDOPA5-GT的表达量及苋菜苷含量的影响。

1 材料和方法 1.1 材料

供试红色苋菜品种为“大红苋菜”,购于福州种子市场。

1.2 方法 1.2.1 生物信息学分析

根据前期获得的AmaDOPA5-GT基因序列(KP174811)利用在线软件对其进行生物信息学分析[19]:利用ExPASy Prot-param软件(http://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白理化性质分析;利用Plant-mPLoc软件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)预测蛋白的亚细胞定位情况;利用ProtScale软件(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白亲水性;利用NetPhos 2.0 Serve软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测蛋白磷酸化位点;利用SignaIP 4.1 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白信号肽;利用TMpred Server软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测蛋白跨膜结构;利用PSIPRED软件(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测蛋白的二级结构;利用DNAMAN6.0对AmaDOPA5-GT和其他植物糖基转移酶家族的氨基酸序列进行多重比对;利用Mega 5构建进化树。

1.2.2 AmaDOPA5-GT亚细胞定位分析

利用DNAMAN 6.0软件分析该基因ORF区序列和载体PCAMBIA1302-GFP中的酶切位点并设计引物(表 1),以苋菜cDNA为模板克隆目的片段,送测验证正确后进行载体构建和转化农杆菌。蛋白亚细胞定位参照林丽霞等[20]的方法:将1 cm2左右大小的洋葱在MS培养基上预培养1 d后,在准备好的农杆菌悬浮液中浸泡20 min。然后取出洋葱表皮,内表皮朝下平铺于MS培养基上,25℃共培养2 d。用无菌MS液体培养基清洗2~3次后在荧光共聚焦显微镜(A1 Nikon)观察绿色荧光蛋白信号。为区分定位结果是在细胞膜还是在细胞壁,还需将洋葱表皮置于30%的蔗糖溶液中质壁分离后再观察。

1.2.3 AmaDOPA5-GT基因启动子克隆与分析

以苋菜子叶为材料进行DNA的提取。根据TaKaRa Genome Walking Kit引物设计原则设计Tail-PCR引物(表 1),采用交错式热不对称PCR染色体步移(Tail-PCR)进行启动子扩增。以Genome Walking Kit(TaKaRa)自带上游引物(AP1、AP2、AP3和AP4)与设计的AmaDOPA5-GT基因特异引物为下游引物进行三轮热不对称PCR扩增,获得该基因上游启动子序列。利用在线软件Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)预测AmaDOPA5-GT启动子可能的转录起始位点;利用在线软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)软件预测启动子顺式作用元件。

表 1 PCR引物序列 Table 1 Primers used in PCR
1.2.4 苋菜幼苗培养与处理

取“大红苋菜”种子0.25 g,用75%的酒精消毒30 s,均匀地撒播在直径12.4 cm平铺有四层无菌滤纸(含15 mL无菌水)的培养皿中。在不同颜色冷光源下进行培养,培养温度为25℃,光照时间16 h·d-1。不同光质处理为:白、暖白、蓝、绿、红(电压:220 V,功率:18 W)和暗6个处理。培养7 d后,取幼苗用于甜菜红素测定和RNA提取,每个试验重复3次。

1.2.5 实时定量PCR(qRT-PCR)分析

qRT-PCR采用TaKaRa公司生产M-MLV反转录试剂盒,参照说明的20 μL标准反转录体系进行反转录合成cDNA 第一链。以反转录产物为模板,以EF1a基因作为内参基因,进行实时定量RT-PCR 验证。所使用荧光定量PCR仪为罗氏LightCycler480。目的基因相对表达量的计算公式如下:基因的相对表达量=(内参基因ECp)/(目的基因ECp),其中E为扩增效率,△Cp为各个时期Cp值与参照时期Cp值的差值。

1.2.6 苋菜甜菜红色素的提取与测定

称取0.5 g苋菜新鲜组织,液氮中进行研磨,研磨完迅速加入7 mL预冷甲醇,剧烈振荡混匀,于4℃放置30 min,12 000 r·min-1离心10 min,去上清,用双蒸水重悬沉淀,4℃ 30 min,12 000 r·min-1离心取上清水相,用紫外分光光度计在536 nm下测吸光值。根据甜菜红素的摩尔消光系数5.66×104计算甜菜红素的绝对含量[13,15]

2 结果与分析 2.1 AmaDOPA5-GT基因生物信息学分析

根据获得的AmaDOPA5-GT (Kp174811)基因的cDNA序列进行生物信息学分析,该基因cDNA全长1 680 bp,开放阅读框(ORF)长1 434 bp,编码477个氨基酸,5′-UTR 54 bp,3′-UTR 192 bp,Ploy A尾巴长31 bp。由于PCR扩增的AmaDOPA5-GT基因的gDNA序列与cDNA序列完全相同,推测该基因没有内含子。理化性质分析结果表明:该基因所编码的蛋白分子量为54 084.0,分子式为C2433H3770N656O696S23,等电点(PI)为6.05,不稳定系数为51.96,带负电氨基酸数为50个,带正电氨基酸数为57个,亲水系数为-0.231;Plant-mPLoc在线软件预测表明:AmaDOPA5-GT定位在细胞膜上。ProtScale分析结果显示这个基因为亲水性蛋白;NetPhos 2.0 Serve软件预测显示AmaDOPA5-GT蛋白磷酸化位点有12个(Ser:8 Thr:1 Tyr:3);采用SignaIP 4.1 Server蛋白质信号肽预测结果显示这个基因不具有信号肽;用TMpred Server软件进行跨膜结构预测显示是AmaDOPA5-GT跨膜蛋白。用PSIPRED软件预测蛋白质的二级结构,AmaDOPA5-GT由40.38%的α螺旋、14.44%的延伸链和45.19%自由折叠组成。使用DNAMAN6.0软件对AmaDOPA5-GT和其他植物糖基转移酶家族的氨基酸序列进行多重比对,发现在碳端有1个44个氨基酸残基组成的保守UDP结合位点(PSPG-box,图 1),还有1个所有糖基转移酶的保守序列[19,20],证明该基因属于糖基转移酶家族成员。

图 1 AmaDOPA5-GT氨基酸序列与其他物种DOPA5-GT蛋白氨基酸序列多重比对结果 注:下划线表示糖基转移酶的特征序列(PSPG box),方框区域为UGT的保守区。 Fig. 1 Multiple alignment of deduced amino acid of AmaDOPA5-GT and DOPA5-GTs from other species

进化树分析结果表明AmaDOPA5-GT与其他几个植物的5-GT聚在一个分枝上(图 2),其中与同属的籽粒苋的DOPA5-GT覆盖率和相似度最高,分别高达100%和95%,与鸡冠花、三角梅和紫茉莉的亲缘关系依次降低,与亲缘关系最远的紫茉莉的DOPA5-GT的覆盖率和相似度也分别高达98%和57%,AmaDOPA5-GT次分支和Betanidin 5-GT的次分支相邻,都聚到石竹目的1个主要分支上,和Casique-Arroyo等[13]的研究结果一致。

图 2 AmaDOPA5-GT与其他植物GT氨基酸序列的进化树 注:图中分支点的数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度的百分比(%)。 Fig. 2 Phylogenetic tree of amino acid sequences of AmaDOPA5-GT and GTs from other plants
2.2 AmaDOPA5-GT亚细胞定位

亚细胞定位结果表明AmaDOPA5-GT定位于细胞膜上,与在线软件预测一致。空载体融合蛋白在洋葱表皮细胞细胞膜、细胞质和细胞核等部位都有表达(图 3)。

图 3 35S::AmaDOPA5-GT-GFP蛋白亚细胞定位结果 注:A~C为细胞质壁分离前;D~F为细胞质壁分离后;G~I为空载体定位结果,A、D和G为荧光图,B、E和H为白场图,C、F和I为叠加图。 Fig. 3 Subcellular localization of 35S::AmaDOPA5-GT-GFP protein
2.3 AmaDOPA5-GT基因的启动子克隆

通过测序获得1 393 bp的序列,其中与AmaDOPA5-GT基因的gDNA序列重叠71 bp,证实该片段为AmaDOPA5-GT基因5′端调控序列(图 4)。Promoter 2.0分析结果表明AmaDOPA5-GT启动子可能的转录起始位点在起始密码子上游500 bp位置,可信度值为1.050; PlantCARE分析共预测到29个顺式作用元件,有多个与植物响应的作用元件(图 4),其中植物光响应元件有8个;茉莉酸甲酯相应元件2个;水杨酸相应元件1个;乙烯响应元件1个;赤霉素响应元件1个。AmaDOPA5-GT基因启动子中植物光响应元件数目较多,说明光对该基因的表达影响较大。

图 4 AmaDOPA5-GT 基因启动子分析结果 注:红框内碱基代表AmaDOPA5-GT 基因起始密码子,红箭头部分为与AmaDOPA5-GT基因重叠序列 Fig. 4 Analysis on AmaDOPA5-GT promoter
2.4 不同光质处理对苋菜小苗甜菜红素含量和AmaDOPA5-GT表达的影响

在不同的光处理下,蓝光处理中苋菜幼苗甜菜苷含量最高,是暗处下幼苗中苋菜苷含量的8倍左右,其次是白光和复合光也出现类似情况,绿光和红光更少,但也比暗处理条件下的多,最少的是暗处理(图 5A)。

图 5 不同光照处理对苋菜幼苗苋菜苷含量(A)和AmaDOPA5-GT(B)表达的影响 注:*表示差异显著(P-value≤0.05);**表示差异极显著(P-value≤0.01)。 Fig. 5 Effect of light of different wavelengths on amaranthin and AmaDOPA5-GTexpression in Amaranth tricolor

在不同光质处理下,红光照射下,AmaDOPA5-GT基因表达量最高,是暗条件下幼苗中表达量的2倍左右,蓝光、复合光和白光处理次之,黑暗和绿光条件下,该基因表达量最少(图 5B)。

3 讨论与结论

DOPA5-GT是甜菜红色合成途径中关键基因,本研究对苋菜AmaDOPA5-GT基因进行生物信息学分析。多重比对发现AmaDOPA5-GT含有1个44个氨基酸残基组成的保守UDP结合位点[21, 22],说明该蛋白属于糖基转移酶家族成员。亚细胞定位结果表明AmaDOPA5-GT蛋白定位于细胞膜上,这可能与该蛋白的转移酶活性息息相关。

启动子分析结果表明AmaDOPA5-GT启动子含有大量的植物响应元件,其中最多的是光响应元件,说明光对AmaDOPA5-GT的调控起着重要的作用。为进一步研究光照对AmaDOPA5-GT表达的影响,对不同光质处理下该基因表达情况进行了研究。结果表明:在暗处理条件下,苋菜苷含量和AmaDOPA5-GT基因表达均显著降低,说明AmaDOPA5-GT基因表达的表达和苋菜苷的合成离不开光。在蓝光处理条件下,苋菜中AmaDOPA5-GT基因表达上调和苋菜苷含量增高,这说明短波长光源有利于色素的积累,这一点与Kishima等的结果相一致[23]。Göring[17]在苋菜愈伤的研究也发现蓝光促进苋菜苷的累积,而远红光反而可以逆转合成的色素。黄光和绿光处理条件下,AmaDOPA5-GT基因表达变化不大但苋菜苷含量显著降低,说明较长波长的光源对AmaDOPA5-GT基因表达的影响不大但却不利于苋菜苷的合成。在红光处理条件下,苋菜苷含量降低而AmaDOPA5-GT基因表达显著上调,AmaDOPA5-GT基因表达水平的提高可能是由苋菜苷含量减少引起的反馈调节。另外,光敏色素是红光的光受体,而光敏色素也是光调节色素累积的一个途径[24],这也可能是AmaDOPA5-GT基因在红光条件下的上调表达的原因。

以上结果表明,AmaDOPA5-GT基因在甜菜苷合成途径中发挥着重要的作用,其表达水平受光调控明显。另外本研究还发现短波长光源(如蓝光)对苋菜苷合成的促进作用可能是通过诱导AmaDOPA5-GT基因的表达实现的。本研究可为揭示AmaDOPA5-GT在苋菜苷合成中的作用奠定基础,并可为富含苋菜苷的苋菜育种提供线索。

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