马铃薯纺锤块茎类病毒Potato spindle tuber viroid，PSTVd是马铃薯生产中的重要病害之一，分布于世界各马铃薯产区。我国各马铃薯产区均有PSTVd的发生，危害程度不一，其中我国北方马铃薯产区(黑龙江、内蒙古、山西、甘肃)广泛发生，其危害日趋严重^{[1, 2, 3]}。PSTVd侵染马铃薯后，可导致种性退化，品质和产量降低，造成严重的经济损失。据报道，PSTVd强株系可使马铃薯减产60%以上，弱系可使马铃薯减产20%~35%，在大田中，PSTVd常与其他马铃薯病毒复合侵染，造成更严重的损失^{[4, 5, 6]}。PSTVd具有机械传播、种子带毒等特点，该病毒是唯一不能经过茎尖脱毒除去的类病毒，因此在种薯检疫规程中是最为重要的检疫对象。福建省马铃薯种植脱毒种薯主要从北方调种，建立马铃薯纺锤块茎类病毒快速诊断技术对保证福建省种薯安全调运具有重要的意义。

PSTVd是一种环状RNA，无外壳、单链，不编码蛋白，无抗原性，无法采用血清学方法进行检测。PSTVd通常采用指示植物法、往返双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法(R-PAGE)、核酸斑点杂交(NASH)检测病毒法^{[7, 8, 9, 10, 11]}，但是这些方法检测效果不理想，同时存在耗时耗力等问题。随着PCR技术的发展，RT-PCR被证明是检测植物RNA病毒的一种快速、灵敏的技术，极大地提高了检测速度，已成为目前应用最为广泛的检测手段之一^{[12, 13, 14, 15]}。目前，福建省其他几类主要马铃薯病毒检测及病原均有了相关报道，但尚未见用RT-PCR法检测和分析福建省马铃薯纺锤块茎类病毒的报道。因此本试验以福建省具有PSTVd症状的马铃薯为试验材料，提取RNA，反转录cDNA，建立高效灵敏的RT-PCR检测方法，以期为福建省脱毒马铃薯的种苗(薯)繁育和推广种植提供依据，促进福建马铃薯产业的健康可持续发展。

从福建龙海田间采集带有病毒症状的马铃薯叶片和薯块，材料经液氮处理后置于-80℃冰箱保存，以经检测不带病毒的组培苗为阴性对照。利用TaKaRa RNA提取试剂(RNAiso Plus)提取样品总RNA。

植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒(PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel MidiPurification Kit)、质粒小提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)、Taq DNA聚合酶购置于TaKaRa公司。氨苄青霉素、X-gal、IPTG购自北京天根生化科技有限公司。

克隆载体PMD-18T vector购自TaKaRa公司，大肠杆菌JM109由本实验室保存。

参照PSTVd基因序列，合成1对引物，上游引物5′-ATCCCCGGGGAAACCTGGAGCGAAC-3′，下游引物为5′-CCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以提取的植物总RNA为模板，利用随机引物Random Primer pd(N)₆ 合成第1链。反应体系：总RNA 4.0 μL，引物Random Primer (50 μmol·L^-1)1.0 μL，dNTPs(10 mmol·L^-1)1.0 μL，RNase free H₂O 4.0 μL，65℃反应5 min，冰上放置。反应体系加入5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript Rtase 1 μL，RNase free H₂O 4.5 μL，反应体系20 μL，反应程序为30℃10 min，42℃1 h，95℃ 5 min。

PCR扩增体系为25 μL：2.0 μL cDNA，1.0 μL PSTVd F(10 μmol·L^-1)，1.0 μL PSTVd R(10 μmol·L^-1)，0.15 μL Ex Taq (5 U·μL^-1)，2.0 μL dNTP (2.5 mmol·L^-1)，2.5 μL 10×PCR buffer，ddH₂O补足25 μL。反应条件为： 预变性(94℃)5 min； 变性(94℃) 30 s，退火(56℃)30 s，延伸(72℃)1 min，循环次数为 30 次；延伸(72℃)10 min，最后保存于4℃冰箱中。取5 μL PCR扩增产物，1%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结束后在凝胶成像仪观察拍照。

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANgel MidiPurification Kit)回收纯化后，连接克隆载体(pMD18-T vector)，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，涂布在LB平板上[100 μL Amp(100 mg·mL^-1)、28 μL IPTG(50 mg·mL^-1)和40 μL X-gal(20 mg·mL^-1]。在恒温培养箱中37℃倒置培养12~16 h。挑取白色菌落接种到1 mL含有1 μL Amp的LB液体培养基中，37℃ 180 r·min^-1摇菌过夜后用特异性引物对菌液进行PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测。经PCR扩增后确定为阳性克隆菌液由生工生物工程(上海)股份有限公司使用通用引物进行双向测序。

将测得的马铃薯纺锤块茎类病毒序列在GenBank(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的数据库中进行BLAST比对。搜索到已报道的PSTVd其他分离物的序列,采用Clustal X 1.83 和 MEGA 4.1软件，利用Neighbour-joining方法构建系统发育树。

将侵染PSTVd的马铃薯病样总RNA 电泳分析，在凝胶中28S、18S清晰可见(图 1)，且28S RNA的亮度是18S RNA的两倍左右，表明所提取的总RNA纯度较高，无降解，可用于后续试验。

图 1(Fig.1)

图 1 总RNA电泳检测 Fig.1 Electrophoresis validation on total RNA

以提取总RNA经反转录后的cDNA为模板，利用合成的特异性引物进行PCR扩增，扩增结果如图 2，扩增出1条约360 bp大小的条带，大小与合成引物预扩增大小相符，阴性对照未扩增出特异性条带。PCR扩增结果表明合成引物可以有效扩增出PSTVd特异性条带，该引物有较好的特异性。

图 2(Fig.2)

图 2 马铃薯纺锤块茎类病毒RT-PCR检测结果 注：M为DNA marker(DL2000)；泳道1~5为检测PSTVd阳性样品，泳道6为阴性对照。 Fig.2 Detection of potato spindle tuber viroid by RT-PCR

将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒纯化回收，与pMD18-T连接，转化大肠杆菌JM109，在含有Amp抗生素平板进行蓝白斑筛选，挑选白斑摇菌，提取质粒后进行双酶切(SacI/EcoR)鉴定，鉴定结果与克隆的PSTVd大小一致(图 3)，证明克隆片段为PSTVd基因。

图 3(Fig.3)

图 3 PSTVd重组质粒双酶切(SacI/EcoR)鉴定 注：M为DNA marker(DL2000)；1~2为PSTVd阳性样品；3~4为重组质粒双酶切(SacI/EcoR)。 Fig.3 Restriction analysis on recombinant plasmid with SacI and EcoR

将检测正确的克隆子送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果表明，该分离物包含359个碱基，与已报道的PSTVd分离物同源性达98%~100%，证明该分离物为 PSTVd 基因，将该分离物命名为 Fujian PSTVd并提交到NCBI，基因登录序列号为KM588065.1。

将分离物的序列与已公布的PSTVd弱毒株系(M14814.1)、中间株系(AY492084.1)、强毒株系(U23058.1)进行比对后(图 4)，结果表明分离物KM588065.1与弱毒株系M14814.1)的碱基序列没有差异，与中间株系(AY492084.1)碱基序列有7个碱基的差异，与强毒株系(U23058.1)有10个碱基的差异，与中间株系，强株系碱基在125位点发生了缺失，在309位点由A突变为T，在313位点由G突变为T。构建的不同国家和地区PSTVd分离物的系统进化树(图 5)分为2个亚组。其中福建分离物与我国北方河北、北京、黑龙江及欧洲和美国分离物的亲缘关系最近聚在第一亚组，而与新西兰分离物的关系较远聚在第二亚组，这可能与马铃薯在不同国家和地区间远距离调运有关。

图 4(Fig.4)

图 4 PSTVd核苷酸序列比对 Fig.4 Alignment of nucleotide sequences of PSTVd

图 5(Fig.5)

图 5 基于PSTVd核苷酸序列NJ树分析 Fig.5 Neighbor-joining tree based on nucleotide sequences analysis of PSTVd

马铃薯纺锤块茎类病毒是马铃薯生产上最重要的病害之一，由于其不能利用茎尖剥离去除，这给病毒防控带了极大的困难，种薯一旦感染PSTVd，马铃薯世代带毒，随着病毒的积累产量逐年下降，严重影响马铃薯的产量和品质，对育种工作者来说，这将是灾难性的问题。因此，在培育脱毒苗及选择杂交亲本时，首先要对种薯进行PSTVd检测，选择无病毒的薯块和亲本材料，同时建立严格的病毒检测程序，进行田间抽检，及时去除染病植株，保证种薯安全。

RT-PCR是近年来国内外应用较为普遍的病毒检测技术，该方法可快速、准确地检测马铃薯是否携带病毒。在RT-PCR反应体系中，只要保证所提取RNA的质量，通过不同的引物就能扩增出预期的目的片段^{[16, 17]}。生产上常见的马铃薯病毒有PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV、PSTVd、TMV等8种主要病毒，且PSTVd常和其他病毒复合侵染，因此，建立能同时检查多种的病毒RT-PCR方法尤为重要，本实验室已建立了同时检查PVX、PVY、PVS、PVA 和 PVM 5种病毒的RT-PCR方法^[18]，结合建立RT-PCR检查PSTVd，可实现检测马铃薯常见的6种病毒，提高了检测效率，为繁育无病毒组培苗提供了技术保障。

根据在鉴别寄主上的症状表现，PSTVd可划分为强毒株系、中间株系和弱毒株系3个株系^[14]。PSTVd核苷酸总数为356~360 nt，包含5个功能区，分别为左末端区、致病区、中央保守区、可变区和右末端区，病毒的致病性与致病区有关，病毒的复制与中央保守区有关^[19]。PSTVd由于基因组较小，极易发生变异，个别碱基的变化就能导致病毒致病区的改变，进而影响病毒的寄主范围。据报道，强毒株系与弱毒株系之间仅有3个碱基的差异^[20]。本研究通过RT-PCR方法鉴定福建省马铃薯感染的PSTVd，经核苷酸序列测定与分析，福建PSTVd的分离物(KM588065.1)的核苷酸共包含359个碱基，该分离物与弱毒株系(M14814.1)高度同源，与强毒株系和中间株系仅有3个碱基的突变，说明该分离物的分子变异较小。由于本研究获得的分离物较少，福建省马铃薯PSTVd分子变异情况还有待进一步研究。

本研究建立的RT-PCR检测PSTVd的方法具有良好的特异性，为马铃薯病毒检测供了快速、灵敏、准确的检测途径，检测结果可靠，而且省时省力，对福建省马铃薯脱病毒苗生产检测技术研究与应用具有重要意义。